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1、电子晶体学与电镜三维重构电子晶体学与电镜三维重构l概况l电子显微镜的基本知识l电镜三维重构的理论基础l有关的实验技术l应用实例概况l目前广泛使用的术语l方法特点l膜蛋白结构测定的困难l电子晶体学与X-射线晶体学的比较l电子晶体学的历史l结构测定的一般步骤概况l目前广泛使用的术语： Electron crystallography 电子晶体学 Electron cryomicroscopy 低温电子显微学 3-dimensional reconstruction of electron microscopy 电镜三维重构 Electron diffraction and imaging 电子衍射
2、和成像概况l方法特点n分辨率：330 ，大多数达不到原子分辨率n适用的样品：晶态或非晶态，复杂的大分子组装体l蛋白质的二维晶体l螺旋状分子复合物l纤维样品l单颗粒的大分子复合物（MW250kDa）l病毒n无相位问题，电镜像本身即包含振幅和位相信息概况l膜蛋白结构测定的困难nPDB统计：内在膜蛋白 2003年3月 58 个n膜蛋白难于结晶n膜蛋白多是多重复合物，分子量大概况l电子晶体学与X-射线晶体学的比较 X-ray EMn研究对象： 晶体 20um 微小晶体与薄膜，单颗粒，螺旋纤维n数据形式： 衍射数据 衍射数据，显微像n相位问题： 有 无概况l电子晶体学的历史n20世纪30年代，原苏联的一
3、个晶体学小组开始电子衍射的方法研究n1968年Klug和DeRosier开创电子显微镜三维重构的基本原理和方法重构了T4烟草花叶病毒颗粒尾部的三维空间结构。n1975年，Henderson和Unwin重构了细菌视紫红质（BR）的7分辨率的三维结构。-电子晶体学的一个里程碑。n1982年，Klug因此获得诺贝尔化学奖。n1990年，Henderson等人把细菌视紫红质的研究提高到了3.5分辨率，并提出了原子模型。n最近十几年来，电子晶体学已经发展成为一种X射线晶体学所不可替代的生物大分子空间结构分析的有效手段。概况l结构测定的一般步骤n电镜样品的制备（包括蛋白质二维晶体的生长）n电镜观察照相n数
4、据处理及计算机三维重构n（构建原子模型）电子晶体学与电镜三维重构l概况l电子显微镜的基本知识l电镜三维重构的理论基础l有关的实验技术l应用实例电子显微镜的基本知识l“科学之眼”的诞生l电子显微镜的分辨率l透射电镜的基本工作原理“科学之眼”的诞生l光的衍射效应对分辨率的限制nd 0.4 ln人眼的分辨率：0.10.2 mmn光学显微镜：0.10.2 uml寻找新的光源n电子波动性的发现l1924 De. Broglie提出物质波理论，并被电子衍射实验证实n电子透镜的发现l1926年, H. Busch提出轴对称磁场可以汇聚电子束，并服从几何光学定律l第一台电子显微镜的研制nE. Ruska电子显
5、微镜的分辨率l电子的波长n电子的速度由加速电压决定，故电子的波长与加速电压有关： （kv） l () - 50 0.0548 100 0.0388 200 0.0251 400 0.0164 1000 0.0123l电子显微镜的实际分辨率：n目前可达到 1左右，能够看到单个原子透射电镜的基本工作原理l透射电镜的外观透射电镜的基本工作原理l透射电镜的内部结构n电子透镜系统（镜筒）l照明系统：由电子枪和聚光镜组成l成象系统：包括物镜、中间镜、投影镜，有时增加一个衍射透镜。l观察系统：荧光屏、光学观察放大镜及照相机。n真空系统n电源系统透射电镜的基本工作原理l电子成象和电子衍射的基本原理n电镜的三级
6、成像系统：物镜、中间镜和投影镜。n成像模式和衍射模式：电镜的两种工作模式。电子晶体学与电镜三维重构l概况l电子显微镜的基本知识l电镜三维重构的理论基础l有关的实验技术l应用实例电镜三维重构的理论基础l电子显微像是物体的二维投影l三维重构的数学基础l三维重构的原理电子显微像是物体的二维投影三维重构的数学基础lRadon理论n1917年，Radon提出：如果已知一个物体在不同方向上的无穷多个低维投影，就可以通过Radon变换，精确地重构出高维空间的物体结构。l傅里叶变换l中央截面定理三维重构的数学基础l中央截面定理n物体的二维投影像的傅里叶变换等于物体的三维傅里叶变换中通过原点且与投影方向垂直的一
7、个截面（中央截面）。三维重构的原理l如果获得足够多的物体在各个方向的二维投影像，即可获得足够多的傅里叶空间中的中心截面，将这些中心截面按其方向组合起来，即可获得物体三维傅里叶变换的近似值，将它作傅里叶逆变换，就得到物体的三维图像。l1968年，D.De Rosier和A.Klug首次提出上述三维重构思想三维重构原理电子晶体学与电镜三维重构l概况l电子显微镜的基本知识l电镜三维重构的理论基础l有关的实验技术l应用实例有关的实验技术l蛋白质二维晶体的生长l电镜样品的制备l数据的收集和处理蛋白质二维晶体的生长l二维晶体的特征n一个连续的脂双层或脂单层膜n膜上的蛋白质呈规则的周期排列n有囊泡状、片状和
8、管状等类型n疏水相互作用是维系二维晶体结构的主要作用蛋白质二维晶体的生长l二维晶体的生长n膜蛋白二维晶体的生长（内在膜蛋白）l天然膜中重排n天然形成的膜晶体嗜盐菌质膜上的细菌视紫红质（BR）n物理或化学因素诱导形成膜晶体l负提纯技术l透析法n水溶性蛋白二维晶体的生长l脂单层表面的二维结晶化电镜样品的制备l电镜制样的器材n载网：铜网n支持膜：碳膜l负染色技术n原理及方法：用高电子密度的染色剂沉积在蛋白质分子周围，使蛋白质的电子显微像具有较高的反差（衬度）。n常用的负染剂：醋酸铀n特点：最常用的衬度增强技术；分辨率低，1520 ；样品脱水会影响蛋白质分子的结构l糖包埋技术n用葡萄糖等物质取代蛋白质
9、溶液中的水介质，形成类似水的环境。n包埋剂：葡萄糖、海藻糖、单宁酸等n特点：可以保持生物大分子的结构；分辨率较高，理论上可达3-4 电镜样品的制备l冰包埋技术n将样品悬液薄层高速冷冻到-160以下，冷冻速度达到106/s，使蛋白质样品处于非晶体的玻璃态冰中。n常用液氮冷却n特点：1）是目前最好的样品包埋方法；2）高速冷冻形成的无序冰中，样品的水合状态得以保持，样品的结构不受破坏；3）可以获得高分辨率的结构数据；4）可以降低样品的辐射损伤；数据的收集和处理l显微像和电子衍射信息的获取n样品的多角度照相n低剂量曝光技术：聚焦和照相不在同一个样品区域n低温电镜技术：电镜中样品的温度维持在-160左右l数据处理n照片的数字化n计算机数据处理及三维重构电子晶体学与电镜三维重构l概况l电子显微镜的基本知识l电镜三维重构的理论基础l有关的实验技术l应用实例应用实例lDNA分子结构的研究应用实例l蛋白质三维结构的测定n微管蛋白的结构与功能研究n膜蛋白的三维结构研究n二十面体病毒颗粒的三维结构研究微管蛋白的结构与功能研究l微管：细胞的物质传送系统l微管是由微管蛋白单体线性聚合而成膜蛋白的三维结构研究l细菌视紫红质：第一个用电子晶体学方法得到的膜蛋白结构二十面体病毒颗粒的三维结构研究l球状病毒颗粒具有二十面体对称性
