第二章基因工程

《第二章基因工程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章基因工程（109页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系研究某基因与疾病的关系n n目的基因 已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的特定已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或基因或DNADNA片段片段 第三节第三节 目的基因的获取和表达目的基因的获取和表达一、目的基因获取一、目的基因获取直接分离直接分离化学合成法化学合成法酶促合成法酶促合成法 鸟枪法鸟枪法 ( (构建基因文库构建基因文库) ) PCR PCR法法人工合成人工合成从生物基因组中分离化学合成化学合成n n必须先知道目的基因核苷酸序列必须

2、先知道目的基因核苷酸序列 可由多肽链氨基酸序列反推可由多肽链氨基酸序列反推DNADNA碱基序列碱基序列 根据已知的根据已知的DNA序列，通过化学合成的方序列，通过化学合成的方法合成目的基因。单体一个个接上去，每接法合成目的基因。单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应。一个单体就是一个循环反应。 DNA合成仪是根据合成仪是根据固相亚磷酸三酯法固相亚磷酸三酯法原理设原理设计的。计的。 脱三苯脱三苯甲基甲基偶联偶联N N（iPriPr）2 2封端封端氧化氧化Hn n脱保护作用脱保护作用脱保护作用脱保护作用n n耦联反应耦联反应耦联反应耦联反应n n封端氧化反应封端氧化反应封端氧化反应封端氧化

3、反应寡核寡核苷酸苷酸合成合成步骤步骤 化学合成寡核苷酸限于化学合成寡核苷酸限于200bp以下，以下，需要将合成的寡核苷酸片段拼接成完整需要将合成的寡核苷酸片段拼接成完整的基因。的基因。 2.全基因合成策略全基因合成策略酶促合成法n n先得到目的基因的先得到目的基因的mRNAmRNA，以，以mRNAmRNA为模板，在为模板，在反转录酶的作用下合成互补反转录酶的作用下合成互补DNADNA单链，再在单链，再在DNADNA聚合酶聚合酶I I的作用下合成双链的作用下合成双链DNADNA分子分子直接分离直接分离n n提取总提取总DNADNAn n氯化铯梯度离心氯化铯梯度离心非洲爪蛙非洲爪蛙rDNArDNA

4、的分离的分离海胆海胆rDNArDNA的分离的分离依赖于依赖于DNADNA密度差异，局限性大密度差异，局限性大鸟枪法鸟枪法n n基因文库基因文库基因文库基因文库n n鸟枪法步骤鸟枪法步骤鸟枪法步骤鸟枪法步骤n n基因文库的构建过程基因文库的构建过程基因文库的构建过程基因文库的构建过程n n基因文库的特点基因文库的特点基因文库的特点基因文库的特点n n鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性又称散弹射击法或构建基因文库法，特别适合原核基因的分离 从特定生物个体中分离的从特定生物个体中分离的全部基因全部基因，通过人工构建将基因插入到载体

5、上，转通过人工构建将基因插入到载体上，转化到受体细胞中，含有插入基因的重组化到受体细胞中，含有插入基因的重组子的总和即为基因文库。基因以克隆的子的总和即为基因文库。基因以克隆的形式存在。形式存在。基因文库基因文库（gene library ) 1 1）供体细胞中提取基因组）供体细胞中提取基因组）供体细胞中提取基因组）供体细胞中提取基因组DNADNA； 3）将这些片段分别载入运载体；2）用限制酶或超声波将供体细胞中的DNA切成 许多片段；鸟枪法步骤鸟枪法步骤6）从中找出含有目的基因的克隆，再利用一定 的方法将包含的基因的DNA片段分离出来。5）在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，即 克隆。4）

6、然后通过运载体转入受体细胞；鸟鸟枪枪法法1）基因组）基因组DNA的制备的制备基因文库的构建过程基因文库的构建过程 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，整性，整性，整性， 用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的用于基因组文库构建的DNADNA在分离纯化在分离纯化在分离纯化在分离纯化操作中应尽量操作中应尽量操作中应尽量操作中应尽量避免过度断裂避免过度断裂避免过度断裂避免过度断裂。制备。制备。制备。制备DNADNA分子量越分子量越分子量越分子量越大，经切割处

7、理后样品中含有不规则末端的大，经切割处理后样品中含有不规则末端的大，经切割处理后样品中含有不规则末端的大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNADNA片段的比率就越低，重组率和完整性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完整性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完整性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完整性也就越高。 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段。2）基因组）基因组DNA的切割的切割 基因组基因组DNADNA片段的切割一般采用限制性内切片段

8、的切割一般采用限制性内切酶部分酶切或超声波处理，随机片段化的方法。酶部分酶切或超声波处理，随机片段化的方法。 部分酶切法一般选用四碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。n 双酶切部分消化 两种酶（Hae、Alu），片段10-30kb。 缺点：都为平末端n 单酶切部分消化 Sau3AI或MboI（同裂酶），粘末端，可插入 BamHI切的噬菌体载体中。 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA或柯斯质粒； 对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。4）载体和受体的选择）载体和受体的选择 电泳或密度梯

9、度离心，回收大小合适电泳或密度梯度离心，回收大小合适的的DNADNA片段，与载体连接。片段，与载体连接。3）基因组DNA的回收 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb -DNA 25 kb 柯斯质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因文库构建的受体受体则根据载体使用大大肠杆菌或酵母菌。肠杆菌或酵母菌。n n部分基因序列已知，用已知序列做探针，部分基因序列已知，用已知序列做探针，筛选文库。筛选文库。n n部分氨基酸序列已知，推导出部分氨基酸序列已知，推导出DNADNA序列，序列，筛选文库。筛选文库。n n根据测序序列，设计引物进行扩增根据测序序列，设计引物

10、进行扩增5）克隆基因的分离）克隆基因的分离 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性n n工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识n n不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因n n不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构PCR法法 PCR PCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法，）法，）法，）法， 又称为聚合酶链反应或又称为聚合酶链反应或又称为聚合酶链反应或又称为聚合酶链反应或PCRPCR扩增技术，扩增技术，扩增技术，扩增技

11、术， 是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序。聚合程序。聚合程序。聚合程序。 Kary Mullis1993 Nobel Prize in Chemistry 原理:总体积：一般为25l 或 50 l1）buffer3）底物（dNTPs）4）Taq酶5）模板6）引物常规常规PCR反应的成分和作用反应的成分和作用 10 Buffer 4 l 10mmol/L dNTPs 0.5 l P1(10mol/L) 1 l P2(10mol/L) 1 l Taq DNA Polymerase (5U/l) 0.2 l Template 10-1

12、00ng 加ddH2O至 25lPCR反应体系 PCR反应程序 94 4min， 1个循环；个循环； 94 30s 50-60 30s 35个循环；个循环； 72 30s 72 10min， 1个循环；个循环； 4保存、琼脂糖凝胶电泳保存、琼脂糖凝胶电泳 二、二、DNA重组与表达重组与表达 n n基因重组基因重组n n目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接DNA重组的类型重组的类型位点特异性重组位点特异性重组（site-specific recombination）接合接合(conjugation) 转化转化(tranformation) 转导转导(transduction)同源重组同源重组

13、（homologous recombination）转座重组转座重组（transposition recombination ）细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组接合作用接合作用 (conjugation ) 指通过细胞的指通过细胞的直接直接接触接触( (如菌毛如菌毛) ) ，遗，遗传信息从供体细胞传信息从供体细胞单向转移单向转移到受体到受体细胞的过程。细胞的过程。接合接合转移转移F因子因子染色体染色体DNA性鞭毛性鞭毛 转化：转化：细胞从周围介质中吸收裸露细胞从周围介质中吸收裸露 的的DNA,而获得新的遗传表型。而获得新的遗传表型。感受态细胞（感受态细胞（competent cell）

14、: 具有摄取周围介质中游离具有摄取周围介质中游离DNA 分子能力的细菌细胞。分子能力的细菌细胞。转化（转化（transformation） 转化过程：转化过程：DNA片断细菌细菌摄取摄取DNA片断片断重组重组细菌性状改变细菌性状改变转导（转导（transduction）通过病毒（噬菌体）介导发生在供通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的体细胞与受体细胞之间的DNADNA转移转移和重组过程。和重组过程。溶溶 菌菌感感 染染重重 组组感感 染染细细 菌菌噬菌体噬菌体 转导转导溶菌途径溶菌途径溶菌途径溶菌途径溶原途径溶原途径溶原途径溶原途径噬菌体感染宿主后的噬菌体感染宿主后的两种结局两

15、种结局同源重组同源重组（homologous recombination）两条具有同源序列的两条具有同源序列的DNA靠近时发生的靠近时发生的DNA交换，广泛存在于生物界。交换，广泛存在于生物界。同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则不易发生重组。不易发生重组。 概念概念同源重组意义同源重组意义同源重组发生在任何生物中。同源重组发生在任何生物中。细菌如果通过接合或转化获得的外源细菌如果通过接合或转化获得的外源DNA与宿主与宿主DNA充分同源，那么外源充分同源，那么外源DNA就可以整合进宿主的染色体。就可以整合进宿主的染色体。同源重组也是同源重组也是DNA损伤

16、修复的重要机制损伤修复的重要机制5353535353535353分支迁移分支迁移 (recA)53535353 内切酶内切酶 (recBCD)53535353533355 内切酶内切酶(recBCD)5333DNA侵扰侵扰(recA)35535353 DNA 连接酶连接酶Holiday中间体中间体53535353E. coli 的同源重组过程：的同源重组过程：53Holiday中间体中间体53535335555333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)5555333353555333 DNA连接酶连接酶35555333拼拼接接重重组组体体 DNA连接酶连接酶55553333片片段段

17、重重组组体体 位点特异性重组：位点特异性重组：由整合酶催化，在两个由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短序列之间发生的切割和连位点特异的短序列之间发生的切割和连接反应接反应:n n 噬菌体噬菌体DNA整合整合n n细菌特异位点重组细菌特异位点重组细菌特异位点重组细菌特异位点重组n n免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排位点特异性重组位点特异性重组转座重组（转座重组（transposition）由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。 许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转座座DNA片段，片段长度从几百到几万个片段，片

18、段长度从几百到几万个bp,是遗传多样性的一个重要来源。是遗传多样性的一个重要来源。转座重组分类：转座重组分类：插入序列插入序列插入序列插入序列 ( insertion sequence( insertion sequence，IS )IS )转座转座转座转座: : 由转座酶（由转座酶（由转座酶（由转座酶（transposasetransposase）、一个分离的反向重复序）、一个分离的反向重复序）、一个分离的反向重复序）、一个分离的反向重复序（inverted repestsinverted repests）列和侧翼二个正向重复序列（）列和侧翼二个正向重复序列（）列和侧翼二个正向重复序列（）列

19、和侧翼二个正向重复序列（direct direct repeatsrepeats）组成。）组成。）组成。）组成。 发生形式：发生形式：发生形式：发生形式： 保守性转座保守性转座保守性转座保守性转座(conservative transposition)(conservative transposition)(conservative transposition)(conservative transposition) 复制性转座复制性转座复制性转座复制性转座(duplicative transposition)(duplicative transposition)(duplicative tr

20、ansposition)(duplicative transposition) 转座子（转座子（transposon，Tn）转座：）转座： 除了有插入序列的除了有插入序列的除了有插入序列的除了有插入序列的 结构外，还带有抗性或其他标记基因。结构外，还带有抗性或其他标记基因。结构外，还带有抗性或其他标记基因。结构外，还带有抗性或其他标记基因。n n连接反应的条件连接反应的条件 酶切位点酶切位点 载体上特定酶切位点尽可能少载体上特定酶切位点尽可能少 强启动子强启动子 CaMV 35SCaMV 35Sn n注意事项注意事项 酶的用量酶的用量 反应时间与温度反应时间与温度 DNADNA分子分子 外源外

21、源DNADNA与载体的比值与载体的比值利用利用T4 DNAT4 DNA连接酶将目的基因与载体共价连接连接酶将目的基因与载体共价连接目的基因与载体的连接n n黏性末端连接n n平末端连接粘末端连接法粘末端连接法1、同一限制酶切位点可能出现的问题可能出现的问题n n目的基因间连接目的基因间连接n n载体之间连接载体之间连接n n载体的自身环化载体的自身环化n n目的基因与载体连接目的基因与载体连接 需要检验需要检验需要检验需要检验测序测序测序测序2、不同限制酶切位点优点：载体不能自身环化，重组率高。优点：载体不能自身环化，重组率高。平末端连接法平末端连接法效率显著低于粘性末端n n同聚物加尾法n

22、n衔接物连接法n nDNA接头连接法同聚物加尾法同聚物加尾法利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化dNTP 加到单链或双链DNA3-OH端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键作用，形成和转化大肠杆菌的开环重组分子。 按互补粘性片段按互补粘性片段按互补粘性片段按互补粘性片段 进行连接；进行连接；进行连接；进行连接； 10-3010-30个核苷酸；个核苷酸；个核苷酸；个核苷酸； 形成的形成的polypoly尾不会严格等长，形成的重组体有尾不会严格等长，形成的重组体有缺口或裂口。处理方式：缺口或裂口。处理方式： 用用KlenowKlenow大片段酶去填补，然后用大片

23、段酶去填补，然后用DNADNA连接酶连接酶封闭裂口。封闭裂口。注意事项注意事项 人工合成的的双链寡核苷酸，一端为平端人工合成的的双链寡核苷酸，一端为平端人工合成的的双链寡核苷酸，一端为平端人工合成的的双链寡核苷酸，一端为平端（与双链目的（与双链目的（与双链目的（与双链目的DNADNA平端连接），一端为带有某平端连接），一端为带有某平端连接），一端为带有某平端连接），一端为带有某种限制性内切酶的粘性末端（与载体的相应粘种限制性内切酶的粘性末端（与载体的相应粘种限制性内切酶的粘性末端（与载体的相应粘种限制性内切酶的粘性末端（与载体的相应粘性末端连接）。性末端连接）。性末端连接）。性末端连接）。衔接

24、物连接法衔接物连接法 人工接头是化学合成的两个自相互补的核人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（苷酸寡聚体（10-12bp10-12bp），而两个寡聚体可形成），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。寡核苷酸短片段。加人工接头连接法 如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加人工接头相同的酶切位点，在消化人工接头的同时，也会把克隆的外源基因切成不同的片段。三、外源基因表达体系三、外源基因表达体系n n原核表达体系原核表达体系n n真核表达体系真核表达体系原核表达体系原核表达体系n n大肠杆菌表达体系n n

25、芽孢杆菌表达体系n n链霉菌表达体系大肠杆菌表达体系易培养、生长快、遗传背景清楚易培养、生长快、遗传背景清楚载体要求：载体要求：n n含大肠杆菌适宜的选择标志含大肠杆菌适宜的选择标志n n具有能控制住转录、产生大量具有能控制住转录、产生大量mRNAmRNA的启动子的启动子n n翻译控制序列翻译控制序列n n多聚接头多聚接头缺点：n n表达的真核蛋白不能正确折叠或糖基化修饰表达的真核蛋白不能正确折叠或糖基化修饰n n蛋白常形成不溶的包涵体蛋白常形成不溶的包涵体n n难以大量表达分泌性蛋白难以大量表达分泌性蛋白芽孢杆菌表达体系n n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌表达体系枯草芽孢杆菌表达体系优

26、点优点: :n无致病性的，且一般认为安全的有机体；无致病性的，且一般认为安全的有机体；n可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中, ,利于分利于分离纯化（目前，大约离纯化（目前，大约6060的市售酶由芽孢杆菌生的市售酶由芽孢杆菌生产）；产）；n具有高效的分泌目的蛋白的能力具有高效的分泌目的蛋白的能力, ,分泌的重组担保分泌的重组担保多数情况下都具有天然构象和生物活性多数情况下都具有天然构象和生物活性; ;n生长迅速生长迅速, ,培养条件简单培养条件简单, ,遗传背景了解清晰遗传背景了解清晰链霉菌表达体系n n只有单层细胞外膜，表达的蛋白常常能直接分泌只有单层细胞

27、外膜，表达的蛋白常常能直接分泌到胞外培养基中到胞外培养基中n n人生长激素基因、干扰素基因、乙肝表面抗原基人生长激素基因、干扰素基因、乙肝表面抗原基因、白介素基因都在链霉菌中获得表达因、白介素基因都在链霉菌中获得表达优点优点: : 真核蛋白表达后可以正确的加工真核蛋白表达后可以正确的加工, ,折叠折叠, ,糖基化。糖基化。缺点缺点: : 相对操作技术复杂相对操作技术复杂, ,繁殖周期长繁殖周期长, ,培养成本高。培养成本高。真核表达体系真核表达体系n n酵母菌表达系统n n植物细胞表达系统n n昆虫细胞表达系统n n哺乳动物细胞表达系统n n胞浆表达系统酵母菌表达系统最理想的真核基因表达系统最

28、理想的真核基因表达系统优点：优点：n n基因表达调控机制比较清楚基因表达调控机制比较清楚n n遗传操作相对简便遗传操作相对简便n n具有蛋白翻译后修饰加工系统具有蛋白翻译后修饰加工系统n n外源基因产物可分泌到培养基中外源基因产物可分泌到培养基中n n不含毒素和特异性病毒，安全不含毒素和特异性病毒，安全n n培养简单培养简单n n酿酒酵母酿酒酵母n n毕赤酵母毕赤酵母n n乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母酵母表达载体酵母表达载体组成原件n复制起始区n选择标记n有丝分裂稳定区：决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中，来源于酵母染色体着丝粒片段n表达盒：启动子、分泌信号序列、终止子71 自主复

29、制型质粒表达载体（自主复制型质粒表达载体（YRP） 含酵母基因组含酵母基因组DNA复制起始区、选择标复制起始区、选择标记和基因克隆位点，可在酵母细胞中进行自记和基因克隆位点，可在酵母细胞中进行自我复制。每个细胞拷贝数为我复制。每个细胞拷贝数为200个，但经过数个，但经过数代培养后，子细胞中的拷贝数会减少。代培养后，子细胞中的拷贝数会减少。常用表达载体的类型常用表达载体的类型72 不含酵母不含酵母DNA复制起始区，不能在复制起始区，不能在酵母中自主复制。含有整合介导区，通酵母中自主复制。含有整合介导区，通过过DNA的同源重组将外源基因整合到染的同源重组将外源基因整合到染色体上，随染色体一起进行复

30、制。色体上，随染色体一起进行复制。 体内定点突变酵母基因组。体内定点突变酵母基因组。整合型质粒载体（整合型质粒载体（YIP）73 在自主复制型的基础上，增加了酵母在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体染色体有丝分裂稳定序列元件有丝分裂稳定序列元件。在细胞分。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性高，但拷贝数少，通常只有稳定性高，但拷贝数少，通常只有1-2个。个。着丝粒型质粒载体（着丝粒型质粒载体（YCP）74 包含酵母染色体自主复制序列、着丝包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、粒序列、端粒序列端粒序列、酵母选择标记基因，、酵母选择标记基因，大

31、肠杆菌的复制子及选择标记。大肠杆菌的复制子及选择标记。 适合高等生物基因组的克隆与表达研适合高等生物基因组的克隆与表达研究。究。酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YAC）植物细胞表达系统植物细胞表达系统特点：特点：n n细胞全能性细胞全能性n n可光合作用，易培养可光合作用，易培养n n外源蛋白加工修饰外源蛋白加工修饰n n灵活实用灵活实用 （组织特异性表达）（组织特异性表达）n n稳定的外植体来源稳定的外植体来源 （愈伤、原（愈伤、原生质体）生质体）TiTi质粒质粒根癌病（冠瘿病）的特征根癌病（冠瘿病）的特征n n是在根上或茎上产生瘿瘤，以木本植物上最常见，但草本植物也也受侵染。寄主植

32、物达90多科600多种。 症状症状番茄（左）和橄榄（右）番茄（左）和橄榄（右）桃（左）和卫矛（右）桃（左）和卫矛（右）圆叶葡萄（左）和向日葵（右）圆叶葡萄（左）和向日葵（右） 根癌菌附着在植物细胞表面根癌菌附着在植物细胞表面根癌病菌和质粒根癌病菌和质粒根癌病菌的质粒根癌病菌的质粒涉及根癌病的基因大多位于一个大质粒，即Ti (tumour-inducing)上。质粒是一种与染色体分离的、可在细胞中独立复制的、可通过接合作用从一细菌转移到另一细菌的环状DNA。质粒上的基因编码的是一些非必需功能，因为当细菌丢失质粒之后仍可正常培养。Ti质粒质粒大麦转化示意图大麦转化示意图昆虫细胞表达系统n n利用杆

33、状病毒作表达载体利用杆状病毒作表达载体 AcNPVAcNPV、BmNPVBmNPVn n秋黏虫秋黏虫哺乳动物细胞表达系统88常用受体常用受体 中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞（CHOCHO）小仓鼠肾小仓鼠肾(BHK)(BHK)细胞细胞COSCOS细胞细胞小鼠小鼠NSONSO胸腺瘤细胞胸腺瘤细胞小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤SP2/0SP2/0细胞细胞 89n n人腺病毒衍生的表达载体n nSV40 衍生的载体（猴空泡病毒） n nBKV衍生的载体（人乳多瘤病毒） n n人牛痘病毒DNA常用载体系统常用载体系统胞浆表达系统胞浆表达系统利用脂质体作为基因载体利用脂质体作为基因载体脂质体（脂质体（liposo

34、meliposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体搅动后形成双层脂分子的球形脂质体毒性低、无免疫原性、易制备、稳定性好毒性低、无免疫原性、易制备、稳定性好四、重组四、重组DNADNA导入受体菌导入受体菌1 1、重组子导入受体菌的方式、重组子导入受体菌的方式 ：u转化（转化（transformationtransformation）：）：特指将质粒特指将质粒DNADNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。程。u转

35、染（转染（transfectiontransfection）：）：病毒及其重组子病毒及其重组子导入受体细胞。导入受体细胞。2 2、导入方法、导入方法uu氯化钙法氯化钙法氯化钙法氯化钙法 感受态感受态感受态感受态 ：细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源DNADNADNADNA的状态称的状态称的状态称的状态称感受态感受态感受态感受态 制备条件：制备条件：制备条件：制备条件：冰浴、低渗冰浴、低渗冰浴、低渗冰浴、低渗CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2 （ 0.1mol/L 0.1mol/L 0.1mol/L 0.1mol/L ） 转化反应：转化反

36、应：转化反应：转化反应：冰浴冰浴冰浴冰浴30303030分分分分短暂短暂短暂短暂热休克（热休克（热休克（热休克（42424242） 转化效率：转化效率：转化效率：转化效率：101010105 5 5 5-10-10-10-106 6 6 6/ / / / g DNA;g DNA;g DNA;g DNA;环状环状环状环状DNADNADNADNA高于线状高于线状高于线状高于线状DNA 1000DNA 1000DNA 1000DNA 1000倍倍倍倍uu电穿孔法：电穿孔法：电穿孔法：电穿孔法：电穿孔仪电穿孔仪电穿孔仪电穿孔仪五、外源基因表达产物及分离五、外源基因表达产物及分离外源基因在细胞中的表达形

37、式外源基因在细胞中的表达形式n n包涵体包涵体n n融合蛋白融合蛋白n n寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白n n整合型外源蛋白整合型外源蛋白n n分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白 1 1 1 1、包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体包涵体：外源基因的高表达产物在大肠杆菌中积累，致密地集聚在一起，形成的水不溶性的结构。 正确的氨基酸序列，空间构象错误，通常没有生物学活性。包涵体本质：包涵体本质： 一为一为折叠状态折叠状态的外源基因高表达蛋白的集聚的外源基因高表达蛋白的集聚作用，形成疏水性颗粒；作用，形成疏水性颗粒； 二是二是高度非折叠状态而热稳定

38、性差高度非折叠状态而热稳定性差的外源蛋的外源蛋白的集聚作用，形成高分子量的蛋白多聚体。白的集聚作用，形成高分子量的蛋白多聚体。优点：优点：n n水不溶性，密度大，易于分离纯化。水不溶性，密度大，易于分离纯化。n n对蛋白酶有较好的抗性，能在一定程度上保持表对蛋白酶有较好的抗性，能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。达产物的结构稳定。n n毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。宿主菌的生长。缺点：缺点：n n无生物活性，需进行变性复性操作无生物活性，需进行变性复性操作包涵体表达形式的优包涵体表达形式的优缺缺点：点：n n包涵体的溶解与变

39、性包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性 拆开错配的二硫键和次级键。在人工拆开错配的二硫键和次级键。在人工拆开错配的二硫键和次级键。在人工拆开错配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中（盐酸胍、尿素等）径中（盐酸胍、尿素等）径中（盐酸胍、尿素等）径中（盐酸胍、尿素等） 包涵体的复性与重折叠包涵体的复性与重折叠: 通过次级键的形成使蛋白质复性；通过次级键的形成使蛋白质复性； 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠。将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠。

40、将外源基因与受体菌自身蛋白基因重组在一将外源基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白为融合蛋白。达的蛋白为融合蛋白。2 2、融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达N N 自身蛋白自身蛋白自身蛋白自身蛋白 裂解位点裂解位点裂解位点裂解位点 外源蛋白外源蛋白外源蛋白外源蛋白 C C优点：优点：优点：优点：n n目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 正确折叠，不易被降解，尤其对分子量较小的多肽效正确折叠，不易被降解，尤其对分子量较小的多肽效果更佳果更佳n n目的蛋白易于分离目的蛋

41、白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点n n目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件与受体蛋白共用一套完善的表达元件n n溶解性好溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。良好的空间构象，且大多具有水溶性。缺点：缺点：缺点：缺点：n n目的蛋白需要回收目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋

42、白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。 采用亲和层析进行纯化采用亲和层析进行纯化n n化学断裂法化学断裂法 溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr），与多肽链中的），与多肽链中的甲硫氨酸甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，其中上游肽段的甲硫氨残基侧链的硫醚基反应，其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N N端的端的第一位氨基酸残基保持不变。第一位氨基酸残基保持不变。 异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。不能用此方法。目的蛋白回收方法n n酶促裂解法酶促

43、裂解法 梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-CArg-C 葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-C Glu-C 假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-C Lys-C 猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-CArg-C 构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串联在一起，克隆在蛋白基因串联在一起，克隆在蛋白基因串联在一起，克隆在蛋白基因串联在一起，克隆在 载体上，以这种方载体上，以这种方载体上，以这种方载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为式表达的外源蛋白称为式表达的外源蛋白称为式表达的外源蛋

44、白称为寡聚型外源蛋白。寡聚型外源蛋白。寡聚型外源蛋白。寡聚型外源蛋白。3、寡聚型外源蛋白n n目的蛋白高效表达目的蛋白高效表达n n稳定表达小分子短肽稳定表达小分子短肽n n目的产物回收困难目的产物回收困难寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白优缺点：优缺点：优缺点：优缺点： 将要表达的外源基因整合到染色体的非必需将要表达的外源基因整合到染色体的非必需将要表达的外源基因整合到染色体的非必需将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码上，使之成为染色体结构的一部分而稳定的编码上，使之成为染色体结构的一部分而稳定的编码上，使之成为染色体结构的一部分而稳定的编码上，使之成为染色体结构的一部分而稳定的遗传，以这种

45、方式表达的外源蛋白为整合型外源遗传，以这种方式表达的外源蛋白为整合型外源遗传，以这种方式表达的外源蛋白为整合型外源遗传，以这种方式表达的外源蛋白为整合型外源蛋白。蛋白。蛋白。蛋白。 4、整合型外源蛋白整合型外源蛋白 外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基，即为分泌性蛋白。穿过细胞的外膜进入培养基，即为分泌性蛋白。 蛋白产物蛋白产物N N端信号肽序列端信号肽序列（15-30AA15-30AA）的存在的存在是蛋白质分泌的前提条件。是蛋白质分泌的前提条件。5、分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达108蛋蛋白白质质分分泌泌机机制制n n可能使蛋白质按适当方式折叠；可能使蛋白质按适当方式折叠；可能使蛋白质按适当方式折叠；可能使蛋白质按适当方式折叠；n n目的蛋白稳定性高；目的蛋白稳定性高；目的蛋白稳定性高；目的蛋白稳定性高；n n简化了发酵后处理的纯化工艺；简化了发酵后处理的纯化工艺；简化了发酵后处理的纯化工艺；简化了发酵后处理的纯化工艺；n n目的蛋白末端完整；目的蛋白末端完整；目的蛋白末端完整；目的蛋白末端完整； 真核基因的表达真核基因的表达真核基因的表达真核基因的表达分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：