蛋白质的理化性质和分离纯化

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1、一、蛋白质的两性电离一、蛋白质的两性电离 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。 蛋白

2、质的理化性质和分离纯化蛋白质的理化性质和分离纯化（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水

3、作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。 造成变性的因素造成变性的因素如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物

4、碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为和功能，称为复性复性(renaturation) 。 天然状态，天然状态

5、，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性* * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再

6、溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biure

7、t reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。* * 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，

8、达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，

9、导导致致蛋蛋白白质质沉淀。沉淀。 （三）电泳（三）电泳蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pIpI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质的技术质的技术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶电泳等。胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电

10、聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不

11、同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。 问答题和计算题问答题和计算题1、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？2、试试比比较较Gly、Pro与与其其它它常常见见氨氨基基酸酸结结构构的的异异同同，它它们

12、们对对多多肽肽链链二二级结构的形成有何影响？级结构的形成有何影响？3、试试举举例例说说明明蛋蛋白白质质结结构构与与功功能能的的关关系系（包包括括一一级级结结构构、高高级级结结构构与功能的关系）。与功能的关系）。4、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？5、什什麽麽是是蛋蛋白白质质的的变变性性？变变性性的的机机制制是是什什麽麽？举举例例说说明明蛋蛋白白质质变变性性在实践中的应用。在实践中的应用。6、已已知知某某蛋蛋白白质质的的多多肽肽链链是是 -螺螺旋旋。该该蛋蛋白白质质的的分分子子量量为为240 000，求蛋白质的分子长度。，求蛋白质的分子长度。

13、(蛋白质中一个氨基酸的平均分子量为蛋白质中一个氨基酸的平均分子量为120) 名词解释名词解释等等电电点点（pI） 肽肽键键和和肽肽链链 肽肽平平面面及及二二面面角角 一一级级结结构构 二二级级结结构构 三三级级结结构构 四四级级结结构构 超超二二级级结结构构 结结构构域域 蛋白质变性与复性蛋白质变性与复性 分子病分子病 肽肽 v三、是非题v1.构成蛋白质的20种基本氨基酸除脯氨酸外，在结构上的共同点是与羧基相邻-碳原子上都有一个氨基。( )v2.一个氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离子形式存在。( ) v3. .构型的改变必须有旧共价键的破坏和新共价键的形成，而构象的改变则不发生此变化。(

14、 )v4.肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。( )v5.蛋白质分子中肽链能自由旋转。( )v6.所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。.( )v7.蛋白质在pl时其溶解度最小。( )v8.pH2.3时，所有氨基酸都带正电荷。.( )v9.SDSPAGE中,肽链越长，结合的SDS分子越多，故泳动速度越快。( )v10.该氨基酸溶液的pH大于它的pI时,则该氨基酸在电场中向正极移动。( )v11.蛋白质分子的四级结构是指多个肽键通过共价键连成的整体分子。( )v12.血红蛋白与肌红蛋白均为氧的载体，前者是一个典型的变构蛋白，后者则不是。.( )v13.变性的蛋白质的分子量发生了变化。( )v14

15、.蛋白质的亚基（或称亚单位）和肽键是同义的。( )v15.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量是依据不同蛋白质所带电菏的不同而分离的。( )v16.蛋白质变性作用的实质就是蛋白质分子中所有的键均被破坏引起天然构象的解体。( )v17. 变性蛋白质溶解度降低是因为蛋白质分子的电荷被中和以及除去了蛋白质外面的水化层所引起的。( )v18.天然氨基酸都具有一个不对称a-碳原子。( )v19. .蛋白质分子中所有氨基酸（除甘氨酸外）都是左旋的。( )v20. .只有在很高或很低pH值时，氨基酸才主要以非离子化形式存在。( )v四、填空v1.氨酸的结构通式为。v2.在pH7.0的缓冲液中，向阴极移

16、动的氨基酸是_、_和_。v3.肽链中,共有_个原子同在一个肽平面上。v4.-折叠结构的氢键是由邻近两条肽链中一条的_基因与另一条的_基之间所形成。v5.维持蛋白质一级结构的化学键有_和_；维持蛋白质二级结构的力是_；a螺旋是链_氢键，而维持三、四级结构靠_、_、_、_和_。v6.分离纯化蛋白质常用的盐析剂是_。v7.电泳是在一定的_下，根据各种蛋白质分子本身的_和_不同，因而在电场中移动的_不同而进行分离的方法。v8.天然蛋白分子中-螺旋大多属于_手螺旋。v9.蛋白质在等电点时溶解度最_，粘度最_，导电性最_。v10.用分光光度法测定蛋白质在280nm有吸收，这是因为蛋白质分子中的_、_和_三

17、种氨基酸残基侧链基团起作用。v11.组成蛋白质分子的碱性氨基酸有、和。酸性氨基酸有和。v12.维持蛋白质构象的化学键有、v和。v13.血红蛋白（Hb）与氧结合的过程呈现效应，是通过Hb的现象实现的。v14.当溶液中盐离子强度低时，可增加蛋白质的溶解度，这种现象称。当溶液中盐离子强度高时，可使蛋白质沉淀，这种现象称。v五.单项选择v1.下列氨基酸中，哪个含有吲哚环？（）v（A）甲硫氨酸（B）苏氨酸（C）色氨酸（D）缬氨酸（E）组氨酸v2.下列有关氨基酸的叙述，哪个是错误的？（）v（A）酪氨酸和苯丙氨本都含有苯环v（B）酪氨酸和丝氨酸都含羟基v（C）亮氨酸和缬氨酸都是非极性氨基酸v（E）组氨酸、色

18、氨酸和脯氨酸都是杂环氨基酸v3.下列氨酸溶液除哪个外都能使偏振光发生旋转？（）v（A）丙氨酸（B）甘氨酸（C）亮氨酸（D）丝氨酸（E）缬氨酸v4.测得某一蛋白质样品的氮含量为0.40克，此样品约含蛋白质多少克？( )v(A) 2.00g，(B) 2.50g，(C) 3.00g，(D) 6.25gv5.下列含有两个羧基的氨基酸是：( )v(A)精氨酸 (B)赖氨酸 (C)色氨酸 (D)谷氨酸v6.含有疏水侧链的一组氨基酸是：( )v(A)色氨酸、精氨酸，(B)苯丙氨酸、异亮氨酸，(C)精氨酸、亮氨酸，(D)蛋氨酸、组氨酸v7.肽键在下列哪个波长具有最大光吸收？（）v(A）215nm（B）260n

19、m（C）280nm（D）340nm（E）以上都不是v8.有一多及经酸水解后产生等摩尔的Lys、Gly和Ala。如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构？（）v(A)GlyLysAlaGlyAla （B）AlaLysGly(C)LysGlyAlav(D) GlyLysAla (E) AlaGlyLysv9. .关于肽键特点叙述错误的是：( )v(A)肽键的C-N键具有部分双键性质，(B)与alpha-碳原子相连的N和C所形成的化学键可以自由旋转，(C)肽键可以自由旋转，(D)肽键中C-N键所相连的四个原子基本处于同一个平面上v10.蛋白质所

20、形成的胶体颗粒，在下列那种条件下不稳定：( )v(A)溶液pH值大于pI，(B)溶液pH值等于pI，(C)溶液pH值小于pI，(D)在水溶液中v11.蛋白质的等电点是：( )v(A)蛋白质的溶液的pH值等于7时溶液的pH值，(B)蛋白质分子呈正离子状态时溶液的pH值，(C)蛋白质分子呈负离子状态时溶液的pH值，(D)蛋白质的正电荷与负电荷相等时溶液的pH值 v12.蛋白质变性是由于：( )v(A)氨基酸排列顺序的改变，(B)肽键的断裂，(C)蛋白质空间构象的破坏，(D)蛋白质的水解v13.变性蛋白质的主要特点是：( )v(A)黏度下降，(B)溶解度增加，(C)生物学活性丧失，(D)容易被盐析出

21、现沉淀v14.下列那种因素不能使蛋白质变性：( )v(A)加热震荡，(B)强酸强碱、有机溶剂，(C)重金属盐，(D)盐析v15.蛋白质变性不包括：( )v(A)氢键断裂，(B)肽键断裂，(C)疏水键断裂，(D)二硫键断裂v16.若用重金属沉淀pI=8的蛋白质时，该溶液的pH值应为：( )v(A) 8，(B) 8，(C) =8v17.蛋白质一级结构与功能关系的特点是（）v（A）相同氨基酸组成的蛋白质，功能一定相同v（B）一级结构相近的蛋白质，其功能类似性越大v（C）不同结构中任何氨基酸的改变，其生物活性即消失v（D）不同生物来源的同种蛋白质，其一级结构相同v（E）以上都不对v18.通过凯氏微量定

22、氮测得某样品的总蛋白氮为2.0克,该样品含多少克蛋白质？( )v（A）28.14 （B）18.56 （C） 14.07 （D）12.5v19某一溶液中蛋白质的百分含量为45，此溶液的蛋白质氮的百分浓度为：vA8.3% B9.8% C6.7% D5.4% E7.2v20下列含有两个羧基的氨基酸是：vA组氨酸 B赖氨酸 C甘氨酸 D天冬氨酸 E色氨酸v21下列哪一种氨基酸是亚氨基酸：vA脯氨酸 B焦谷氨酸 C亮氨酸 D丝氨酸 E酪氨酸v22维持蛋白质一级结构的主要化学键是：vA离子键 B疏水键 C肽键 D氢键 E二硫键v23关于肽键特点的错误叙述是： A肽键中的C-N键较C-N单键短 B肽键中的C

23、-N键有部分双键性质 C肽键的羰基氧和亚氨氢为反式构型 D与C-N相连的六个原子处于同一平面上 E肽键的旋转性，使蛋白质形成各种立体构象v24关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是：vA天然蛋白质分子均有这种结构 B有三级结构的多肽链都具有生物学活性vC三级结构的稳定性主要是次级键维系 D亲水基团聚集在三级结构的表面vE决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基v25具有四级结构的蛋白质特征是：vA依赖肽键维系四级结构的稳定性 vB在三级结构的基础上，由二硫键将各多肽链进一步折叠、盘曲形成vC每条多肽链都具有独立的生物学活性 D分子中必定含有辅基vE由两条或两条以上具有三级结构的多肽链组成v26含有Ala，Asp，Lys，Cys的混合液，其pI依次分别为6.0，2.77，9.74，5.07，在pH9环境中电泳分离这四种氨基酸，自正极开始，电泳区带的顺序是：vAAla，Cys，Lys，Asp BAsp，Cys，Ala，Lys CLys，Ala，Cys，AspvDCys，Lys，Ala，Asp EAsp，Ala，Lys，Cys v27变性蛋白质的主要特点是：vA粘度下降 B溶解度增加 C不易被蛋白酶水解 vD生物学活性丧失 E容易被盐析出现沉淀v28蛋白质分子在280nm处的吸收峰主要是由哪种氨基酸引起的vA谷氨酸 B色氨酸 C苯丙氨酸 D组氨酸 E赖氨酸