土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件

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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的分离与计数专题专题2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用1一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素尿素是一种重要的农业氮肥。尿素尿素是一种重要的农业氮肥。尿素尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能不能不能不能直接被农作物直接被农作物直接被农作物直接被农作物吸收。土壤中的细菌将吸收。土壤中的细菌将吸收。土壤中的细菌将吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨尿素分解成氨尿素分解成氨尿素分解成氨之后才能被植物利之后才能被植物利之后才能被植物利之后才能被植物利用。用。用。用。2 2、细菌利用尿素的

2、原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶脲酶脲酶CO(NHCO(NHCO(NHCO(NH2 2 2 2) ) ) )2 2 2 2脲酶脲酶脲酶脲酶+ H+ H+ H+ H2 2 2 2O OO O+ CO+ CO+ CO+ CO2 2 2 22NH2NH2NH2NH3 3 3 33 3、本课题目的、本课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含

3、有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌21 1、实例：、实例：启示启示启示启示：寻找目的菌种时要根据它对：寻找目的菌种时要根据它对：寻找目的菌种时要根据它对：寻找目的菌种时要根据它对生存环境生存环境生存环境生存环境的要求，的要求，的要求，的要求，到到到到相应的环境中相应的环境中相应的环境中相应的环境中去寻找。去寻找。去寻找。去寻找。原因原因原因原因：因为热泉温度：因为热泉温度：因为热泉温度：因为热泉温度70707070808080800 0 0 0C C C C，淘汰了绝大多数微，淘汰了绝大多数微

4、，淘汰了绝大多数微，淘汰了绝大多数微生物只有耐热的生物只有耐热的生物只有耐热的生物只有耐热的TaqTaqTaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNA DNA DNA DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR)PCR)PCR)PCR)是一种在体外将少量是一种在体外将少量是一种在体外将少量是一种在体外将少量DNADNADNADNA大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温技术要求使用耐高温技术要求使用耐高温技术要求使用耐高温（939393930 0 0 0C C C C）的

5、）的）的）的DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶。一、研究思路一、研究思路 筛选菌株筛选菌株 统计菌落数目统计菌落数目 设置对照设置对照3 要分离一种微生物，必须根据要分离一种微生物，必须根据要分离一种微生物，必须根据要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点该微生物的特点该微生物的特点该微生物的特点，包，包，包，包括括括括营养营养营养营养、生理、生理、生理、生理、生长条件生长条件生长条件生长条件等；等；等；等；方法：方法：方法：方法： 抑制抑制抑制抑制大多数微生物的生长大多数微生物的生长大多数微生物的生长大多数微生物的生长 造成造成造成造成有利于有利于有利于有利于该菌生长的环境该菌

6、生长的环境该菌生长的环境该菌生长的环境结果：结果：结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板划平板划平板划平板划线法线法线法线法或或或或稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于目的菌株生长的条件目的菌株生长的条件目的菌株生长的条件目的菌株

7、生长的条件( (包括包括包括包括营养、营养、营养、营养、温度、温度、温度、温度、pHpH等等等等) )，同时，同时，同时，同时抑制或阻止抑制或阻止抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。其他微生物生长。其他微生物生长。选选择择培培养养基基：在在微微生生物物学学中中，将将允允许许特特定定种种类类的的微微生生物物生生长长，同，同时时抑制或阻止抑制或阻止其他种其他种类类微生物生微生物生长长的的培养基。培养基。415.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO

8、4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3 3 3、土壤中、土壤中、土壤中、土壤中分解尿素的细菌分解尿素的细菌分解尿素的细菌分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：的分离与计数所需培养基：的分离与计数所需培养基：的分离与计数所需培养基：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：氮源：氮源：尿素尿素尿素尿素思考思考15从从物物理理性性质质看看此此培培养养基基属属于于 培培养养基基，是是由由于于加加入入了凝固了凝固剂

9、剂 。从从功功能能上上看看属属于于 培培养养基基，此此培培养养基基的的 只只有有尿尿素素，能能利利用用尿尿素素的的微微生生物物可可分分泌泌脲脲酶酶，因因此此能能在在此此培培养养基上生长，此培养基属于基上生长，此培养基属于 培养基。培养基。思考思考2 2该培养基对微生物该培养基对微生物 （具有，不具（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是有）选择作用。如果具有，其选择机制是 。具有具有 只有能够以只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长选择选择固体固体琼琼脂脂选择选择氮源氮源思考思考315.0g15.0g15.0g15.0g琼脂琼脂琼脂琼

10、脂1.0g1.0g1.0g1.0g尿素尿素尿素尿素10.0g10.0g10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖0.2g0.2g0.2g0.2gMgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOOO2.1g2.1g2.1g2.1gNaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 41.4g1.4g1.4g1.4gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 46 培养基的氮源为尿素，只有能合成培养基的氮源为尿素，只有能合成培养基的氮源为尿素，只有能合成培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才的微生物才的微生物才的微生物才能分

11、解尿素，以能分解尿素，以能分解尿素，以能分解尿素，以尿素尿素尿素尿素作为氮源。缺乏作为氮源。缺乏作为氮源。缺乏作为氮源。缺乏脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物由的微生物由的微生物由的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出受到抑制，所以用此培养基就能够选择出受到抑制，所以用此培养基就能够选择出受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素分解尿素分解尿素分解尿素的的的的微生物。微生物。微生物。微生物。4 4 4 4、培养

12、基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 47活学活用1.1.在在缺缺乏乏氮氮源源的的培培养养基基上上，大大部部分分微微生生物物无无法法生生长长；在在培培养养基基中中加加入入青青霉霉素素可可以以抑抑制制细细菌菌和和放放线线菌菌的的生生长长；在在培培养养基基中中加加入入10%10%的的

13、酚酚可可以以抑抑制制细细菌菌和和霉霉菌菌的的生生长长。利利用用上上述述选选择择培培养养基基依依次次能能从从混混杂杂的的微微生生物物群群体体中中分分离出离出( () )A.A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B.B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.C.固氮细菌、霉菌、放线菌固氮细菌、霉菌、放线菌D.D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌C8（1 1）原理：原理：当样品的当样品的稀释度足够高稀释度足够高时，培养基表面生时，培养基表面生长的一个菌落，长的一个菌落，来源于样品稀释液中的来源于样品稀释液中的一个一个活菌。通

14、活菌。通过统计平板上的过统计平板上的菌落数菌落数，就能推测出样品中大约含有，就能推测出样品中大约含有多少活菌。多少活菌。（2 2）常用方法：）常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(C(C(CV)V)V)V)M M M M其中，其中，其中，其中，C C C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，数，数，数，V V V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀

15、释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)(ml)(ml)，M M M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目：1.活菌计数法活菌计数法（3 3）计算公式：）计算公式：）计算公式：）计算公式：（间接计数法（间接计数法）9想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按以下公式进行计算。平均值，然后按以

16、下公式进行计算。旁栏思考题旁栏思考题每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(C(C(CV)V)V)V)M M M M其中，其中，其中，其中，C C C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，数，数，数，V V V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)(ml)(ml)，M M M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。1

17、0实例分析实例分析P22 第二位同学第二位同学的统计结果更接近真实值。因为第一位同学只的统计结果更接近真实值。因为第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？需要，如何改进？ 都需要都需要。第一位同学在该浓度下可以多涂布几个平板第一位同学在该浓度下可以多涂布几个平板；第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个

18、平板，但是其中但是其中1个平板的计数结果与另外个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个个平板的计数值用来求平均值，平板的计数值用来求平均值，可以在该浓度下重新进行可以在该浓度下重新进行实验。实验。11注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板的平板上进行计数。上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布三同一稀释度涂布三个或三个以上的平板个或三个以上的平板，培养统计菌落数，计算，培养统计菌落

19、数，计算出菌落平均值。出菌落平均值。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以三个稀释度一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在平均菌落数在5050个左右时为最好。个左右时为最好。122 2、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。（二）（二）.统计菌落数目：统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计

20、数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点13 将含将含已知数目的红细胞已知数目的红细胞液体与液体与待测的菌液待测的菌液按按1：1均匀混合，均匀混合，在显微镜下在显微镜下数出各自的数目数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。，然后求菌液中的细胞数目。（比例计数法，类似与标志重捕法）（比例计数法，类似与标志重捕法）待测样品待测样品等量的已知含量的红细胞等量的已知含量的红细胞 混匀混匀涂抹涂抹测定：测定： 红细胞数目红细胞数目细菌数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目计算单位体积内的细菌数目细菌

21、细菌红细胞红细胞【补充补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。显微镜直接计数是测定微生物的方法。14举例：已知红细胞浓度为举例：已知红细胞浓度为M个个/mL，从体积，从体积为为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液胞液等量均匀混合等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌个，大肠杆菌Y个，求个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？是多少？XNM YW(个个)观察到的红细胞平均数观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数观察到的细菌平均数红

22、细胞含量红细胞含量/细菌含量细菌含量 （类似于标志重捕法）（类似于标志重捕法）公公 式式 W / Y M / X(每每mL中）中） NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X为：为：152.2.用用稀稀释释涂涂布布平平板板法法来来统统计计样样品品中中活活菌菌的的数数目目。在在某某稀稀释释浓浓度度下下某某同同学学做做了了若若干干个个平平板板并并统统计计每每个个平平板板的的菌落数，最接近菌落数，最接近样样品中菌体数真品中菌体数真实值实值的是的是( () )A.A.菌落数量最多的平板菌落数量最多的平板B.B.菌落数量最少的平板菌落数量最少的平板C.C.菌落数量适中的平板菌落数量

23、适中的平板D.D.取若干个平板菌落数量的平均值取若干个平板菌落数量的平均值D D活学活用16 设置对照设置对照的主要目的是的主要目的是排除实验组中非测试排除实验组中非测试因素对实验结果的影响因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。，提高实验结果的可信度。（三）（三）设置对照：设置对照：设置对照的方法：设置对照的方法：空白对照：空白对照：不给对照组任何处理不给对照组任何处理因素；因素；条件对照：条件对照： 给对照组施以部分实验因素，但给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究不是所要研究的处理因素的处理因素；自身对照：自身对照： 对照组和实验组对照组和实验组都在同一研究对象都在同一研究对象上进

24、行；上进行；相互对照：相互对照： 不单设对照组，而是不单设对照组，而是几个实验组相互对照几个实验组相互对照。17教教材材提提供供的的案案例例中中A A同同学学的的结结果果与与其其他他同同学学不不同，可能的解同，可能的解释释有两种有两种： 一是一是由于土由于土样样不同不同； 二是二是由于培养基由于培养基污污染或操作失染或操作失误误。如何如何设设置置对对照照实验实验来确定原因？来确定原因？方案一：方案一： 其他同学用其他同学用与与A A同学一样同学一样的土样进行实验的土样进行实验。 如如果果结结果果与与A A同同学学一一致致，则则证证明明A A同同学学操操作作无误无误； 如如果果结结果果不不同同，

25、则则证证明明A A同同学学存存在在操操作作失失误误或培养基的配制有问题。或培养基的配制有问题。实例：教材实例：教材P23P2318教教材材提提供供的的案案例例中中A A同同学学的的结结果果与与其其他他同同学学不不同同，可能的解可能的解释释有两种有两种： 一是一是由于土由于土样样不同不同； 二是二是由于培养基由于培养基污污染或操作失染或操作失误误。如何如何设设置置对对照照实验实验来确定原因？来确定原因？方案二：方案二： 将将A A同同学学配配制制的的培培养养基基在在不不加加土土样样的的情情况况下下进进行行培培养养，作作为为空空白白对对照照，以以证证明明培培养养基基是是否否受受到到污染。污染。 实

26、例：教材实例：教材P23P23小小结结：通通过过这这个个事事例例可可以以看看出出，实实验验结结果果要要有有说说服力，服力，对照实验对照实验的设置是必不可少的。的设置是必不可少的。19920实验设计：实验设计：实验设计包括对实验设计包括对实验方案实验方案，所需，所需仪器仪器、材材料料、用具用具和和药品药品，具体的实施，具体的实施步骤步骤以及时以及时间安排等的综合考虑和安排。间安排等的综合考虑和安排。21二实验设计与操作二实验设计与操作下下面面是是土土壤壤中中尿尿素素分分解解菌菌的的分分离离与与计计数数的的实实验验流流程程示示意意图图，请请结结合教材提供的合教材提供的资资料料，进进行行实验设计实验

27、设计，并写出，并写出详细详细的的实验实验方案方案：22菌落计数菌落计数配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀释系列稀释涂布平板涂布平板与培养与培养实验设计：实验设计：实验方案：实验方案：23（一）土壤取样（一）土壤取样（三）样品的稀释（三）样品的稀释（四）取样涂布（四）取样涂布（五）微生物的培养与观察并计数（五）微生物的培养与观察并计数（六）鉴定（六）鉴定 实验的具体操作实验的具体操作 （二）制备培养基：（二）制备培养基：24应在应在应在应在火焰旁火焰旁火焰旁火焰旁称取土壤称取土壤称取土壤称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土

28、壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁火焰旁火焰旁火焰旁进行进行进行进行分离不同的微生物采用分离不同的微生物采用分离不同的微生物采用分离不同的微生物采用不同的稀释度。不同的稀释度。不同的稀释度。不同的稀释度。原因：原因：原因：原因：不同微生物在土壤中不同微生物在土壤中不同微生物在土壤中不同微生物在土壤中含量不同。含量不同。含量不同。含量不同。目的：目的：目的：目的：保证获得菌落数在保证获得菌落数在保证获得菌落数在保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的之间、适于计数的之间、适于计数的之间、适于计数的平板。平板。平板。平板。（三）样

29、品的稀释（三）样品的稀释特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作 25 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg/kg）是不同的）是不同的。 测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 为为为为获获获获得得得得不不不不同同同同类类类类型型型型的的的的微微微微生生生生物物物物，就就就就需需需需要要要要按按按按不不不不同同同同

30、的的的的稀稀稀稀释释释释度度度度进行分离进行分离进行分离进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。旁栏思考题旁栏思考题微生物细菌放线菌真菌稀释度104、105、106103、104、105102、103、104保证获得菌落数在30300的平板进行计数。稀释度稀释度26（四）（四）（四）（四）取样涂布取样涂布取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿对培养皿作作好标记好标记。注。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、间、稀释度稀释度、培养物等。培养物等。 如

31、果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上个以上个以上个以上菌落数目在菌落数目在菌落数目在菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作则说明稀释操作则说明稀释操作则说明稀释操作比较成功比较成功比较成功比较成功，并能够进行，并能够进行，并能够进行，并能够进行菌落的计数菌落的计数菌落的计数菌落的计数，如果同一，如果同一，如果同一，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需稀释

32、倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要要要要重新实验重新实验重新实验重新实验。特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作 273.3.下下列列是是关关于于“检检测测土土壤壤中中细细菌菌总总数数”实实验验操操作作的的叙叙述述，其中其中错误错误的是的是( () )A.A.用用蒸蒸馏馏水水配配制制牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基，经经高高温温、高高压压灭菌后倒平板灭菌后倒平板。B.B.取取10104 4、10105 5、10106 6倍倍的的土土壤壤稀稀释释液液和和无无菌菌水水各各0.1 0.1 mLmL，分别涂布于各组平板上，分别涂布

33、于各组平板上。C.C.将将实实验验组组和和对对照照组组平平板板倒倒置置，37 37 恒恒温温培培养养24244848小时小时。D.D.确确定定对对照照组组无无菌菌后后，选选择择菌菌落落数数在在300300以以上上的的实实验验组组平板进行计数平板进行计数。活学活用D284.4.测测定定土土壤壤中中细细菌菌数数量量一一般般选选用用10104 4、10105 5和和10106 6倍倍的的稀稀释释液液进进行行平平板板培培养养，而而测测定定真真菌菌的的数数量量一一般般选选用用10102 2、10103 3和和10104 4倍稀倍稀释释，其原因是，其原因是( () )A.A.细细菌个体小，真菌个体大菌个体

34、小，真菌个体大B.B.细菌易稀释，真菌不易稀释细菌易稀释，真菌不易稀释C.C.细菌在土壤中数量比真菌多细菌在土壤中数量比真菌多D.D.随机的，没有原因随机的，没有原因C活学活用29（五）微生物的培养与观察并计数（五）微生物的培养与观察并计数 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果选取菌落数目稳定时的记录作为结果选取菌落数目稳定时的记录作为结果选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培，以防止因培，以防止因培，以防止因培养时间不足而

35、导致遗漏菌落的数目。养时间不足而导致遗漏菌落的数目。养时间不足而导致遗漏菌落的数目。养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要培养不同微生物往往需要培养不同微生物往往需要培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间不同培养温度和培养时间不同培养温度和培养时间不同培养温度和培养时间。 细菌：细菌：细菌：细菌：3030303037373737培养培养培养培养1 1 1 12d2d2d2d 放线菌：放线菌：放线菌：放线菌：2525252528282828培养培养培养培养5 5 5 57d7d7d7d 霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：2525252528282828的温度下培养的温度下培养的温度

36、下培养的温度下培养3 3 3 34d4d4d4d。 当菌落当菌落数目稳定数目稳定时，选取菌落数在时，选取菌落数在3030300300的平板的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对进行计数。在同一稀释度下，至少对3 3个个平板进行重平板进行重复计数，然后求出复计数，然后求出平均值平均值，并根据平板所对应的，并根据平板所对应的稀释稀释度度计算出样品中细菌的数目。计算出样品中细菌的数目。 特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作 30微生物的培养与观察微生物的培养与观察 关注菌落的关注菌落的形状形状、大小大小、隆起程度隆起程度、颜颜色色、质地等等，都是、

37、质地等等，都是区分细菌的重要手段。区分细菌的重要手段。 3132注意注意研究未知的微生物，一定要注意进研究未知的微生物，一定要注意进行规范的无菌操作，以防被行规范的无菌操作，以防被致病的微生物致病的微生物感感染，实验后，一定要洗手。染，实验后，一定要洗手。（六）鉴定：（六）鉴定：筛选后必鉴定筛选后必鉴定 鉴定（鉴别）培养基鉴定（鉴别）培养基：加入某种指示剂或化学药加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存。品，不影响微生物的生存。1 1、酚红培养基：、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌是否存在鉴定分解尿素的细菌是否存在 2、伊红、伊红美蓝培养基：美蓝培养基：鉴定大肠杆菌是否存在鉴定大肠杆菌是否存

38、在特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作特别注意的几个具体操作 331 1、酚红培养基酚红培养基： 鉴定鉴定分解尿素的细菌分解尿素的细菌。 原理：原理：脲酶脲酶催化尿素分解成氨催化尿素分解成氨培养基碱性培养基碱性增强增强 酚红酚红变红变红脲脲酶阳性酶阳性2 2、伊红伊红美蓝培养基：美蓝培养基： 鉴定鉴定大肠杆菌大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红原理：代谢产物与伊红美蓝美蓝结合结合 菌落呈菌落呈深紫色并带有金属光深紫色并带有金属光泽泽。鉴定（鉴别）培养基的实例：鉴定（鉴别）培养基的实例：341.实验设计和操作提示步步骤骤实验实验操作操作操作提示操作提示土壤土壤取取样样从

39、酸碱度接近从酸碱度接近 潮潮湿的土壤中取湿的土壤中取样样。先。先铲铲去去表表层层土土_左右，再取样，左右，再取样，将样品装入事先准备好的将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取取样样用的小用的小铁铲铁铲和盛土和盛土样样的信封都要的信封都要经过经过_制制备备培养培养基基分分别别配制牛肉膏蛋白配制牛肉膏蛋白胨胨培培养基和养基和 为为唯一唯一氮源的氮源的 培养基培养基牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨胨培养基可培养基可以作以作为为 ，用来判断用来判断选择选择培养基是培养基是否起到了否起到了 作用作用3 cm3 cm选择选择灭灭菌菌选择选择中性中性尿素尿素对对照照填一填填一填35样样品品的的稀稀释释和和涂涂布布称

40、取称取 g g土土样样加到盛加到盛有有 mLmL无菌水的无菌水的锥锥形瓶形瓶中，充分中，充分摇摇匀；匀；吸取吸取上清液上清液 mLmL，转转移移至盛有至盛有 mLmL的无菌水的无的无菌水的无菌大试管中，按照上图流程菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释；进行样品的稀释；按照由按照由10107 710103 3稀释度的稀释度的顺序分别吸取顺序分别吸取 mLmL进行进行 操作。按照操作。按照浓度浓度 到到 的顺序涂布的顺序涂布平板，不必更换移液管平板，不必更换移液管应应在在 旁称取土旁称取土样样；由于初次实验，对由于初次实验，对于稀释的范围没有把于稀释的范围没有把握，因此选择了一个握，因此选择了一

41、个较为宽泛的范围较为宽泛的范围 _倍的稀释液；倍的稀释液；实验时要对所用的实验时要对所用的平板、试管作好平板、试管作好 。如培养皿要注明培。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、养基类型、培养时间、 、培养物等、培养物等高高稀稀释释度度10109090190.1平板涂布平板涂布低低火焰火焰103107标记标记36培培养养将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在_ _ 温度下培养。随着培养温度下培养。随着培养时间时间的延的延长长，会有不同的菌落，会有不同的菌落产产生。生。比比较较牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨胨培养基和培养基和选选择择培养基中菌落的数量、形培养基中菌落的数量、形态态等，并做好等，并做好记录

42、记录在牛肉膏蛋白在牛肉膏蛋白胨胨培培养基上生养基上生长长的菌落的菌落数目数目应应明明显显_ _ 选择选择培养基上的数培养基上的数目，才目，才说说明明选择选择培培养基有养基有_作用作用3037 选择选择多于多于37计计数数当菌落数目当菌落数目_ _ 时时，选选取菌落数在取菌落数在_ 的平板的平板进行计数。在同一进行计数。在同一稀释度下，至少对稀释度下，至少对 _个平板进行重个平板进行重复计数，然后求出复计数，然后求出_ _ ，并，并根据平板所对应的根据平板所对应的稀释度计算出样品稀释度计算出样品中细菌的数目中细菌的数目如果得到了如果得到了_菌落菌落数目符合要求的平板，数目符合要求的平板，则说则说

43、明稀明稀释释操作比操作比较较成功；成功；如果同一稀释倍数的三个重复如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要精确，需要_ ；在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24 h24 h统计统计一次菌落数目。选取菌落数目稳一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的培养时间不足而导致遗漏菌落的数目数目平均平均值值重新重新实验实验稳稳定定3030032 2个或个或2 2个以上个以上38三、操作提示三、操作提示 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作 做好标记做好标记做好标记做好标记 制定计划制定

44、计划制定计划制定计划 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 （一）如何判断培养物中是否有杂菌污染以及选（一）如何判断培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？择培养基是否筛选出菌落？ 对照的培养皿对照的培养皿在培养过程中在培养过程中没有菌落没有菌落生长，生长，说明培养基没有被杂菌污染。说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。，说明选择培养基已筛选出一些菌落。39（二）如何判断样品的稀释操作是否成功？（二）如何判断样品的稀释操作是否成功？ 如果得到了如果得到了2 2个或个或

45、2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。进行菌落的计数。如果学生选取的是同一种土样，如果学生选取的是同一种土样，统计的结统计的结果应该接近果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。分析产生差异的原因。 （三）重复组的结果是否一致的判定方法：（三）重复组的结果是否一致的判定方法：四、结果分析与评价四、结果分析与评价 40课题小结稀释涂布平板法显微镜直接计数法目的菌株411.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正

46、确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2

47、 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素课堂训练课堂训练A A C CD D424.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目

48、的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）加入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C43（宁夏，（宁夏，15分）（分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件

49、外，还要考虑外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能紫外线能使蛋白质变性

50、，还能_。 （3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的证待测样品稀释的_。 （4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的菌落特征对细菌进行初步的_。 （5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是对于固体培养基应采用的检测方法是_。

51、 （6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。温度温度 酸碱度酸碱度易培养易培养生活周期短生活周期短灭菌灭菌消毒消毒损伤损伤DNA的结构的结构比例合适比例合适鉴定鉴定(或分类或分类) 将未接种的培养基在适将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生观察培养基上是否有菌落产生。灭菌灭菌44845当堂检测1.1.通常用来作通常用来作为为菌种菌种鉴鉴定的重要依据是定的重要依据是( () ) A. A.菌落

52、菌落 B.B.细菌形态细菌形态 C.C.细菌体积细菌体积 D.D.细菌结构细菌结构A2.2.从从土土壤壤中中分分离离以以尿尿素素为为氮氮源源的的细细菌菌，下下列列实实验验操操作作不不正确的是正确的是( () ) A. A.将土壤用无菌水稀释，制备将土壤用无菌水稀释，制备10103 310106 6土壤稀释液土壤稀释液 B.B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上 C.C.用用加加入入刚刚果果红红指指示示剂剂的的选选择择培培养养基基筛筛选选分分解解尿尿素素的的细菌细菌 D.D.从从周周围围出出现现红红色色环环带带的的菌菌落落中中挑挑取取能能够够分分泌泌脲脲

53、酶酶的的菌株菌株C463.3.请选请选出下列正确的操作步出下列正确的操作步骤骤( () )土土壤壤取取样样称称取取10 10 g g土土壤壤，取取出出加加入入盛盛有有90 90 mLmL无无菌菌水水的的锥锥形形瓶瓶中中吸吸取取0.1 0.1 mLmL土土壤壤溶溶液液进进行行平平板板涂涂布布依依次稀释至次稀释至10101 1、10102 2、10103 3、10104 4、10105 5、10106 6、10107 7稀释度稀释度A. A. B.B.C. C. D.D.C4.4.在在以以尿尿素素为为唯唯一一氮氮源源的的培培养养基基中中加加入入酚酚红红指指示示剂剂的的目的是目的是( () ) A.

54、 A.筛选出能分解尿素的细菌筛选出能分解尿素的细菌 B.B.对分离的菌种作进一步鉴定对分离的菌种作进一步鉴定 C.C.作细菌的营养成分作细菌的营养成分 D.D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素B475.5. 甘甘蔗蔗是是南南方方地地区区燃燃料料酒酒精精生生产产的的重重要要原原料料。利利用用甘甘蔗蔗生生产产燃燃料料酒酒精精的的一一般般工工艺艺流流程程为为：甘甘蔗蔗榨榨汁汁( (蔗蔗糖糖) )酵母菌酵母菌发发酵酵蒸蒸馏馏成品成品( (燃料酒精燃料酒精) )。(1)(1)具具有有耐耐高高糖糖和和耐耐酸酸特特性性的的酵酵母母菌菌是是理理想想的的酒酒精精发

55、发酵酵菌菌种种，对对野野生生酵酵母母菌菌进进行行诱诱变变后后通通过过筛筛选选可可以以得得到到具具有有这这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步步骤骤1 1：野野生生菌菌液液体体培培养养一一段段时时间间后后接接受受紫紫外外线线照照射射诱诱变变处理。处理。步步骤骤2 2：制制备备选选择择培培养养基基。在在基基本本培培养养基基的的基基础础上上，注注意意_和和 ，加加琼琼脂脂后后灭灭菌，制成固体平板。菌，制成固体平板。步骤步骤3 3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤步骤4 4：根据：根据_，筛选出突变菌。，筛选出突变菌。添加

56、高添加高浓浓度蔗糖度蔗糖( (葡萄糖葡萄糖) )调调低低pHpH是否能在是否能在选择选择培养基上生培养基上生长长48(2)(2)上述步上述步骤骤2 2、3 3和和4 4的依据分的依据分别别是是_ 。5.5. 甘甘蔗蔗是是南南方方地地区区燃燃料料酒酒精精生生产产的的重重要要原原料料。利利用用甘甘蔗蔗生生产产燃燃料料酒酒精精的的一一般般工工艺艺流流程程为为：甘甘蔗蔗榨榨汁汁( (蔗蔗糖糖) )酵母菌酵母菌发发酵酵蒸蒸馏馏成品成品( (燃料酒精燃料酒精) )。(1)(1)具具有有耐耐高高糖糖和和耐耐酸酸特特性性的的酵酵母母菌菌是是理理想想的的酒酒精精发发酵酵菌菌种种，对对野野生生酵酵母母菌菌进进行行

57、诱诱变变后后通通过过筛筛选选可可以以得得到到具具有有这这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步步骤骤2 2：制制备备选选择择培培养养基基。在在基基本本培培养养基基的的基基础础上上，注注意意_和和 ，加加琼琼脂脂后后灭灭菌，制成固体平板。菌，制成固体平板。步骤步骤3 3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤步骤4 4：根据：根据_，筛选出突变菌。，筛选出突变菌。添加高添加高浓浓度蔗糖度蔗糖( (葡萄糖葡萄糖) )调调低低pHpH是否能在是否能在选择选择培养基上生培养基上生长长获获得得单单菌落；能生菌落；能生长长的菌落具有耐

58、高糖和耐酸的特性的菌落具有耐高糖和耐酸的特性提供高糖和酸性的筛选环境；提供高糖和酸性的筛选环境；49课后练习课后练习2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括物，其中也包括分解尿素的微生物分解尿素的微生物。由于。由于瘤胃中的微生物多为瘤胃中的微生物多为厌氧菌厌氧菌，接触空气后，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备物除了需要准备选择培养基选择培养基外，还应参照外，还应参照厌氧菌的培养厌氧菌的培养方法进行实验设计。方法进行实验设计。50大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属

59、光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并带有金属光泽深紫色并带有金属光泽，使大肠杆，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基例如：鉴别大肠杆菌培养基515253545556归纳提炼1.选择培养

60、基(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。(2)常见的选择培养基加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。57石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项(1)为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取其平均值。(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。58