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1、1实验六实验六 植物组织中植物组织中DNADNA的提取与分的提取与分析析 温馨提示：温馨提示：1、请将教室水浴锅打开，温度调、请将教室水浴锅打开，温度调至至65。2、实验中、实验中-20冰浴时，请将样品放入冰浴时，请将样品放入6309室冰箱冷冻层。室冰箱冷冻层。1 12 （1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 （2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法一、实验目的一、实验目的2 2二、实验原理二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类
2、的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。3 3二、实验原理二、实验原理 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。4 4 CTAB法流程图：植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥
3、溶解离心洗涤异丙醇沉淀DNA溶液5 56三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、仪器、仪器： 恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。2、试剂、试剂： 液氮、液氮、CTAB提取缓冲液提取缓冲液、氯仿、氯仿:异戊醇（异戊醇（24:1）、）、异丙醇、异丙醇、70%乙醇、乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝溴酚蓝+40%蔗糖）、蔗糖）、1TAE电泳缓冲液。电泳缓冲液。6 6四、实验步骤四、实验步骤称取0.1g植物幼苗加入适量液氮充分研磨，全部转入1.5ml离心管中加入0.5ml CTAB提取缓冲液，充分混合均匀65水浴10min，其
4、间缓慢颠倒3次加入0.5ml氯仿:异戊醇，上下颠倒充分混匀12000r/min离心10min将上层水相移入另一新离心管加0.5ml预冷异丙醇，-20冰浴30min12000r/min离心10min弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮弃上清，加20LTE溶解沉淀，即得DNA溶液12000r/min离心10min1、DNA的的提提取取7 78四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（1）1%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶：称称取取0.3g琼琼脂脂糖糖，加加入入30mL 1TAE缓缓冲冲液液，在在微微波波炉炉中中加加热热，反反复复加加热热、振振荡荡2-3次次，使使琼琼脂脂糖糖充充分分融融化化。待待
5、凝凝胶胶冷冷却却至至60左左右右，倒倒入入插插入入梳梳子子的的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待待凝凝胶胶凝凝固固后后，小小心心拔拔出出梳梳子子，避避免免前前后后左左右右摇摇晃晃，以以免免破破坏坏胶胶面面及及加加样样孔孔，小小心心将将凝凝胶胶和和胶胶床床放放入入电电泳泳槽槽中中，加样孔靠近阴极的一端。加样孔靠近阴极的一端。8 89四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（3）上上样样电电泳泳：将将20LDNA样样品品溶溶液液和和5L上上样样缓缓冲冲液液混混匀匀后后，上上样样，100V稳稳压压电电泳泳检检查查，根根据据指指示示剂
6、剂迁迁移移的的位位置置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照照胶胶、拍拍照照：将将凝凝胶胶泡泡在在EB溶溶液液（注注意意：EB溶溶液液为为剧剧毒毒物物，需需带带上上一一次次性性手手套套拿拿取取凝凝胶胶）中中10min左左右右，进进入入暗暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。9 910五、实验结果与分析五、实验结果与分析 1 2 3 1 2 3 4 4图图1 植植物物组组织织基基因因组组DNA提提取取结结果果 将将凝凝胶胶图片片打打印印出出来，需要来，需要说明：明：1、小、小组点点样孔号；孔号；2、DNA质量分析。量分析。1010六、注意事项六、注意事项（1）叶片磨得越细越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。1111121、在在DNA抽提过程中造成抽提过程中造成DNA分子断裂的主分子断裂的主要因素有哪些？要因素有哪些？2、本本实实验验中中所所用用到到下下列列试试剂剂（CTAB、氯氯仿仿、异丙醇、异丙醇、75%乙醇）的作用各是什么乙醇）的作用各是什么? 七、思考题七、思考题1212
