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1、动物细胞生物学实验动物细胞生物学实验技术技术1优质课件主主要要内内容容第一第一节培养培养细胞的胞的细胞生物学胞生物学第二第二节细胞培养胞培养第三第三节显微微镜知知识第四第四节细胞生物学胞生物学实验技技术2优质课件第一节第一节培养细胞的细胞生物学培养细胞的细胞生物学3优质课件主要内容主要内容（一）体内、外细胞的差异（二）体外培养细胞的分型（三）培养细胞的生长和增殖过程4优质课件体外培养的细胞和体内细胞的比较相似：相似：仍存在仍存在细胞细胞和和细胞细胞、细胞细胞和和基质基质的的相互关系相互关系单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止细胞相互沟通生
2、物信息细胞相互沟通生物信息的结果对细胞外基质细胞外基质仍有依存性差异：差异：失去失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不明显5优质课件细胞外基胞外基质存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，分布在分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性纤维性成分成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子空间充填分子(主要为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接支持并连接组织结构、调节调节组织的发生和细胞的生理活动。6优质课件1影响影响细胞的存活、生胞的存活、生长与死亡与死亡正常真核正常真核细胞，大多
3、胞，大多须粘附于特定的粘附于特定的细胞外基胞外基质上才能上才能抑制凋亡而存活抑制凋亡而存活，称，称为定着依定着依赖性（性（anchoragedependence）。例如，）。例如，上皮上皮细胞及内皮胞及内皮细胞胞一旦脱离了一旦脱离了细胞外基胞外基质则会会发生程生程序性死亡。序性死亡。7优质课件2决定决定细胞的形状胞的形状细胞呈胞呈单个游离个游离状状态时多呈多呈球形球形。同一种同一种细胞在胞在不同的不同的细胞外基胞外基质上上粘附粘附时可表可表现出完全出完全不同的形状不同的形状。细胞外基胞外基质决定决定细胞的形状胞的形状这一作用是一作用是通通过其其受体受体影响影响细胞骨架的胞骨架的组装装而而实现的
4、。的。8优质课件3控制控制细胞的分化胞的分化细胞通胞通过与特定的与特定的细胞外基胞外基质成分作用成分作用而而发生分化。生分化。例如，成肌细胞成肌细胞在纤粘连蛋白纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。9优质课件4参与参与细胞的迁移胞的迁移细胞外基胞外基质可以可以控制控制细胞迁移胞迁移的的速度速度与与方向方向，并，并为细胞迁移提供胞迁移提供“脚手架脚手架”。细胞的迁移胞的迁移依依赖于于细胞的粘附胞的粘附与与细胞骨胞骨架的架的组装装。细胞粘附于一定的胞粘附于一定的细胞外基胞外基质时诱导粘着斑粘着斑的形成，粘着斑是的形成，粘着斑是联系系细胞外基
5、胞外基质与与细胞骨架胞骨架“铆钉”。10优质课件（一）体内、外（一）体内、外细胞的差异胞的差异体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响体外：缺乏动态平衡的稳定环境体外：缺乏动态平衡的稳定环境发生的变化发生的变化分化现象减弱分化现象减弱形态功能趋于单一化形态功能趋于单一化一定时间后死亡或者转化获得不死性一定时间后死亡或者转化获得不死性11优质课件体外培养的细胞仍具有研究的意义许多性状仍与体内相同如体外培养的心肌细胞仍可博动，细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭基因关闭开启开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控表达与调控提供线索
6、。12优质课件（二）体外培养（二）体外培养细胞的分型胞的分型贴附型：贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按体内组织学标推判定悬浮型：悬浮型：见于少数特殊的细胞，白血病细胞，骨髓细胞或免疫细胞，不需要细胞间和细胞与培养表面的接触。13优质课件贴附型附型细胞的分胞的分类成纤维细胞型成纤维细胞型上皮型细胞上皮型细胞游走细胞型游走细胞型多型细胞型多型细胞型14优质课件成纤维细胞型成纤维细胞型梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质中胚层间充质起源的组织，起源的组织，如心肌、
7、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。凡培养中凡培养中形态与成纤维类似形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。时皆可称为成纤维细胞。15优质课件16优质课件上皮型细胞：上皮型细胞：扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动，扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动，细胞很少单独行动。细胞很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。17优质课件游走细胞型：游走细胞型：散在生长，不连成片，散
8、在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运呈活跃游走或变形运动，方向不规则。动，方向不规则。此型细胞不稳定，有此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相时难以和其他细胞相区别区别。18优质课件多型细胞型：有一些细胞，如神经有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统和稳定的形态，可统归于此类。归于此类。19优质课件（三）培养细胞的生长和增殖过程（三）培养细胞的生长和增殖过程20优质课件培养细胞的生命周期培养细胞的生命周期是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 种类、供体的年龄等。种类、供体的年龄等。人胚成纤维细胞可传3050代，约15030
9、0个增殖周期，能维待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纤维细胞仅可传几代供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。21优质课件生命周期的三个生命周期的三个阶段段原代培养期原代培养期传代期传代期衰退期衰退期22优质课件原代培养：原代培养：从体内取出从体内取出组织, ,分离出分离出细胞、接种培养胞、接种培养 到到 第一次第一次传代。代。原代培养（原代培养（Primary CulturePrimary Culture）期）期原代培养原代培养细胞与体内原胞与体内
10、原组织细胞在胞在形形态结构构和和功能上功能上相似性大相似性大。特点特点细胞群是异质的（细胞群是异质的（HeterogeneousHeterogeneous）细胞克隆形成率（细胞克隆形成率（Cloning EfficiencyCloning Efficiency）低，即细胞独立生）低，即细胞独立生存性差。存性差。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象好的实验对象23优质课件原代培养分原代培养分为两种方法两种方法直接接种组织块直接接种组织块由组织分离出细胞后接种由组织分离出细胞后接种24优质课件25优质课件组织块接种：牛
11、胎儿成纤维细胞26优质课件传代期：传代期：原代培养细胞一经传代后一经传代后便改称做细胞系细胞系（Cell Line）。此期的持续时间最长。在培养条件较好培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养原代培养期期或传代后早期冻存冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞细胞增殖增殖逐渐缓慢逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。27优质课件衰退期：衰退期：增殖很慢增殖很慢或或不增殖不增殖，最后衰退，最后衰退凋亡凋亡。少数情况下，细胞可能发生少数情况下，细胞可能发生自发转化自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的转化的标志
12、标志之一是细胞可能获得之一是细胞可能获得永生性永生性（Immortality）或或恶性性质恶性性质（Malignancy）。这样的细胞这样的细胞群体称群体称无限细胞系无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。无限细胞系的形成主要发生在无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初第二期末，或第三期初阶段。阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。28优质课件细胞的一代生存期细胞的一代生存期1潜伏期潜伏期（LatentPhase）2指数增生期（指数增生期（Log
13、arithmicgrowthPhase）3停滞期停滞期（StagnatePhase）29优质课件1潜伏期（潜伏期（LatentPhase）细胞接种培养后，先是细胞接种培养后，先是悬浮期悬浮期。此时细胞质回缩，胞体。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。呈圆球形。接着细胞贴附于底物表面，称接着细胞贴附于底物表面，称贴壁贴壁，各种细胞各种细胞贴附速度不同贴附速度不同，这与细胞的，这与细胞的种类、培养基成分种类、培养基成分和和底物的理化性质底物的理化性质等密切相关。等密切相关。经过延展过程变成经过延展过程变成极性细胞极性细胞可运动，基本无增殖。可运动，基本无增殖。细胞细胞接种密度大时潜伏期短。接种密度大时潜
14、伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。指数增生期。30优质课件不同的细胞贴壁的时间不同不同的细胞贴壁的时间不同如如巨噬细胞、成纤维细胞巨噬细胞、成纤维细胞等等粘附能力强粘附能力强,能在数分钟至数能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面十分钟内粘附到固相表面如如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱,需要数小时乃至需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面更长的时间才能粘附到固相表面可可利用利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离分离、纯化细胞纯化细胞31优质课件32优
15、质课件贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着伸展33优质课件细胞贴壁影响因素生物因素：生物因素：血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着因子机械机械、物理等物理等其他因素：其他因素：流动：培养液流动可阻止细胞附着流动：培养液流动可阻止细胞附着离心：促进附着离心：促进附着低温：可抑制附着低温：可抑制附着34优质课件加速细胞贴壁的措施包被培养皿底面：对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质如:-通过其所带电荷先吸附培养皿底部,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分减少接种时细胞悬液的量，待细胞粘附和贴壁之后，
16、再补充足够的培养液35优质课件培养液中离子成分及其浓度如，培养液中的如，培养液中的Ca含量过低时不利于含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展细胞的粘附、贴壁和铺展合适的培养温度36优质课件细胞铺展（伸展）(spread)进行进行生命活动生命活动的一种的一种基本的生长特点基本的生长特点或生长行为或生长行为铺展状况铺展状况制约制约细胞的细胞的分裂增殖分裂增殖活动活动铺展的过程铺展的过程细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细，铺展的越好与生长基质的表面接触面越大极性细胞极性细胞就是细胞就是细胞在体外在体外的的特征性细胞形态特征性细胞形态铺展状况铺展状况与与细胞的生长细胞
17、的生长有密切关系有密切关系只有当只有当细胞铺展细胞铺展到到合适合适的的程度程度DNA合成合成才开始才开始进行进行37优质课件2，指数增生期（指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）是细胞是细胞增值最旺盛增值最旺盛的阶段，是细胞一代中活力最好的时的阶段，是细胞一代中活力最好的时期期,是进行各种实验最好的和最主要的阶段。是进行各种实验最好的和最主要的阶段。以细胞以细胞分裂指数分裂指数（MitoticIndex：MI）作为）作为判定判定细胞生细胞生长旺盛与否长旺盛与否的重要的重要标志标志。即每。即每1000个细胞中的分裂相数。个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养
18、液成分、体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于裂指数介于0.1%0.5%，原代细胞分裂指数低，永，原代细胞分裂指数低，永生细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达生细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。pH和和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响38优质课件2，指数增生期（指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）接触抑制接触抑制（ContactInhibition）由于细胞增殖细胞增殖而的相互接触相互接触，进而抑制抑制细胞的运动和增运动和
19、增殖殖，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。正常与癌细胞标志之一。接触抑制是创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周接触抑制是创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央爬行时边的上皮向创面中央爬行时,一旦上皮细胞互相接触一旦上皮细胞互相接触,就停就停止分化和增殖。该现象就叫止分化和增殖。该现象就叫接触抑制接触抑制。因此。因此,创面上不创面上不会出现多余的皮赘。这也是一种十分巧妙和会出现多余的皮赘。这也是一种十分巧妙和神秘神秘的调的调控现象。控现
20、象。39优质课件接触抑制接触抑制（Contact inhibition）细胞相互接触时，将停细胞相互接触时，将停止增长；止增长；细胞停留在细胞周期的细胞停留在细胞周期的G0G0期；期；转化的细胞却可以继续转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长导致细胞重叠堆积生长。生长。40优质课件3停滞期（停滞期（StagnatePhase）：）：细胞数量数量达饱和密度和密度后，细胞遂停止增殖停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改
21、变，重则从底物脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。41优质课件第二节、细胞培养第二节、细胞培养42优质课件主主要要内内容容（一）细胞培养所需条件（一）细胞培养所需条件（二）细胞培养所需用品（二）细胞培养所需用品（三）细胞培养液（三）细胞培养液（四）细胞的原代、继代培养（四）细胞的原代、继代培养（五）细胞的冻存和复苏（五）细胞的冻存和复苏（六）细胞污染（六）细胞污染43优质课件（一）（一）细胞培养所需条件胞培养所需条件1营养需要养需要2细
22、胞的生存胞的生存环境境温度温度:37O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.2-7.4渗透渗透压湿度湿度3无无污染染4无毒无毒44优质课件（二）（二）细胞培养所需用品：胞培养所需用品：无菌间、超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯CO2培养箱倒置显微镜液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管45优质课件1 1超超净工作台工作台(Hood):A.水平流超水平流超净工作台工作台(Horizontalairflow)B.垂直流超垂直流超净工作台工作台(Lateralairflow)C.层流空气超流空气超净工作台工作台(
23、Laminarairflow)46优质课件水平流超净工作台背送风，但病毒是不实用的，容易对人有害47优质课件垂直流超净工作台48优质课件49优质课件超超净工作台的清工作台的清洁维护： 保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，即试验完毕后，将所有的用用品品收收藏藏起起来来，工作台上只只留留有酒酒精精灯灯及橡橡皮皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。50优质课件整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正正确确错误51优质课件接种接种过程中尽可能达到程中尽可能达到悬空要求空要求防止操作带来的污染正正确
24、确错误52优质课件接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正确确错误53优质课件瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正确确错误54优质课件2，CO2培养箱培养箱CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，100%湿度，湿度，5CO2。使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题培养箱培养细胞时应注意的问题用用螺旋口瓶螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖培养细胞时，需将瓶盖微松微松，以保证通气。，以保证通气。保持培养箱内保持培养箱内空气干净空气干净。定期消毒定期消毒（90，14h)。箱内箱内灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水，毫升蒸馏水，
25、以保持箱内湿度，避免培养液蒸以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。发。55优质课件湿度以第二天第湿度以第二天第一次开门，能看一次开门，能看到玻璃门上的水到玻璃门上的水珠珠56优质课件3 3消毒消毒设备： A.A.高高压压消消毒毒锅锅（AutoclaveAutoclave）：110 110 C C，15 15 lblb，20 20 分分钟钟，适适合合于于橡橡皮皮、纸纸、布布、塑塑料料制制品品和和液液体体（9 9 lblb， 10 10 分分钟钟）等等。消毒后必须在烤箱中低温烤干。消毒后必须在烤箱中低温烤干。 B.B.干热消毒箱：干热消毒箱：150-200 150-200 C C， 2 -32 -3小时
26、。小时。 适合于玻璃器皿、金属器械等。适合于玻璃器皿、金属器械等。C.C.酒精消毒酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、动物皮毛解剖器械、塑料器皿、动物皮毛 等，酒精浓度为等，酒精浓度为75759595 。 57优质课件高压消毒锅高压消毒锅58优质课件 D. D. 滤膜膜过滤：正正压过滤: : 蠕动泵通入培液；通入气体。 负压过滤：用水泵或油泵抽滤。 滤膜孔径为滤膜孔径为0.22m0.22m，为延长滤膜寿命可同时添，为延长滤膜寿命可同时添加加0.45 m0.45 m和和1.2 m 1.2 m 滤膜。滤膜。59优质课件滤膜滤器60优质课件两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）61优质课件4.
27、 4. 蒸蒸馏器与去离子器与去离子纯水系水系统： 1 1）用三蒸水，通）用三蒸水，通过去离子去离子纯水水 系系统，电阻需达到阻需达到170170万欧姆万欧姆以上。以上。 2 2）专门的去离子水系的去离子水系统5. 5. 倒置相差倒置相差显微微镜： 需需用用相相差差镜头和和滤光光片片，集集光光器器的的选择应与与接接物物镜的放大倍数一致。的放大倍数一致。62优质课件纯水系统纯水系统 63优质课件倒置相差显微镜1，物镜朝上2，工作距离大3，相差干涉64优质课件5，培养器皿，培养器皿65优质课件培养板与培养瓶培养板与培养瓶66优质课件5，恒温水浴箱，血，恒温水浴箱，血清灭活，细胞解冻清灭活，细胞解冻6
28、7优质课件6，移液管，移液管68优质课件69优质课件70优质课件7，低速离心机，低速离心机71优质课件（三）细胞培养基（三）细胞培养基 干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基 常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖高糖（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-低糖（标准型）、低糖（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等72优质课件Gibco干粉培养液液体培养液1，培养在使用之前需要加入的成分
29、：血清、H2CO3,丙酮酸钠、抗生素等73优质课件Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根据需要的量进行分装，避免反复冻融，血清保存要放置2074优质课件培养液的选择培养液的选择没有一定的没有一定的标准，有几点建准，有几点建议可供参考可供参考 选择培养培养这种种细胞胞首首选的培养液。可以的培养液。可以查阅参考文献，或在参考文献，或在购买细胞株胞株时咨咨询。 其它其它实验室室惯用的培养液用的培养液不妨一不妨一试，许多培养液可以适合多种多培养液可以适合多种细胞。胞。 用用多种培养液多种培养液培养目的培养目的细胞，胞，观察其生察其生长状状态，可以用生，可以用生长曲曲线、集、集落形成率等
30、指落形成率等指标判断，根据判断，根据实验结果果选择最佳培养基，最佳培养基，这是最客是最客观的的方法，但比方法，但比较繁繁琐。总之，首之，首选MEM做粘附做粘附细胞培养、胞培养、RPMI-1640做做悬浮浮细胞培养，胞培养，各种目的无血清培养的首各种目的无血清培养的首选是是AIMV培养基（培养基（SFM）。）。75优质课件血清使用注意事项血清使用注意事项1.1.血清必血清必须贮存于存于20 20 -70-70，若存放于，若存放于44，请勿超勿超过一个月。一个月。1.1.血清血清解解冻步步骤( (逐步解逐步解冻法法): -20): -20或或7070至至44冰箱冰箱溶解一天，至溶解一天，至室温室温
31、下全溶后再分装。在溶解下全溶后再分装。在溶解过程中程中须规则摇晃均匀晃均匀( (小心勿造成气泡小心勿造成气泡) )，使温度与成分均一，减少沉淀的，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由生。勿直接由2020直接至直接至3737解解冻，因温度改，因温度改变太大，容易造成太大，容易造成蛋白蛋白质凝凝结而而发生沉淀。生沉淀。1.1.热灭活（活（heat-inactivationheat-inactivation）是指）是指56, 30 56, 30 分分钟加加热已完全解已完全解冻之之血清。目的是使血清中之血清。目的是使血清中之补体成份体成份(complement) (complement) 去活化
32、。除非必去活化。除非必须，一般不建一般不建议作此作此热处理理，因，因为会造成沉淀物会造成沉淀物显著增多，且会影响血清著增多，且会影响血清之品之品质。1.1.勿将血清置于勿将血清置于3737太久，若在太久，若在3737放置太久，血清会放置太久，血清会变得混得混浊，同，同时血清中血清中许多多较不不稳定之成份定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品亦会因此受到破坏，而影响血清之品质76优质课件补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解（抗体包裹细胞溶解）的不耐热因子；现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過在病原体表面的作用，破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨
33、噬细胞吞食，此外还能引起发炎反应。加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。77优质课件谷氨酰胺L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源能量来源、参与蛋白蛋白质的合成的合成和核酸代核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充
34、分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20-20保存保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 79优质课件酚酚 红红 大多数培养液中使用酚大多数培养液中使用酚大多数培养液中使用酚大多数培养液中使用酚红红作作作作为为pH pH pH pH 指示指示指示指示橙色橙色橙色橙色表示中性表示中性表示中性表示中性pHpHpHpH黄色黄色黄色黄色代表酸性代表酸性代表酸性代表酸性pHpHpHpH紫色紫色紫色紫色表示碱性表示碱性表示碱性表示碱性pHpHpHpH 在一些特殊培养液中不含酚在一些特殊培养液中不含酚在一些特殊培养液中不含酚在一些特殊培养液中不含
35、酚红红因为已有一些研究表明：酚红能因为已有一些研究表明：酚红能因为已有一些研究表明：酚红能因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素模拟类固醇激素模拟类固醇激素模拟类固醇激素（尤（尤（尤（尤其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞，其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞，其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞，其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做红干扰
36、检测，一些研究人员在做红干扰检测，一些研究人员在做红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测流式细胞检测流式细胞检测流式细胞检测时，不时，不时，不时，不使用加有酚红的培养基。使用加有酚红的培养基。使用加有酚红的培养基。使用加有酚红的培养基。 80优质课件细胞消化液l由组织中分离细胞和细胞传代l常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用81优质课件胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的主要作用：使细胞间的蛋白质水解蛋白质水解，使细胞相互离散，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些消化细胞时，加入一些血清血清或含血清的培养液，能终止消或含血清的培养液，能终止消化作用化作
37、用EDTAEDTA4Na 4Na 溶液溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便常用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%。注意：注意：使用使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的因残留的EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长82优质课件（四）细胞的原代和传代培养（四）细胞的原代和传代培养83优质课件鼠胎组织细胞原代培养鼠胎组织细胞原代培养取材：取材：用用颈椎脱位法椎脱位法使使孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把整个孕
38、鼠整个孕鼠浸入盛有浸入盛有7575乙醇乙醇的的烧杯中数秒杯中数秒钟消毒消毒，取出后放在大平皿中携入，取出后放在大平皿中携入超超净台台。用消。用消过毒的毒的剪刀剪刀在躯干中部在躯干中部环行剪开行剪开皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出子子宫置于无菌平皿中。用消置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀毒的剪刀剪开子剪开子宫，取出取出鼠胎，鼠胎，剪去剪去头、爪，、爪，以以平衡平衡盐溶液溶液洗去血洗去血污切割：切割：用用PBSPBS将取出的将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔剪刀仔细将将组织反复剪碎反复剪碎，直到成，直到成1mm1mm3 3左右的小左右的小块，再用，再用平衡平衡盐溶液溶液清
39、洗，洗到清洗，洗到组织块发白白为止。静置数分止。静置数分钟，使，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：消化、接种培养：加入加入0.250.25胰蛋白胰蛋白酶消化液消化液（5-105-10倍量倍量），与），与组织块混匀。置混匀。置3737水浴，水浴，观察消化情况察消化情况（每隔几分（每隔几分钟摇动一下一下试管），管），静止，吸去上清，加入静止，吸去上清，加入5 510ml10ml细胞培养液胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养84优质课件全量换液和半量换液全量换液和半量换液
40、换液时机的选择：培养液培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。值下降，营养液酸化变黄。细胞状态细胞状态细细胞胞换换液液85优质课件细细 胞胞 传传 代代 原代原代原代原代细细胞胞胞胞传传代以便代以便代以便代以便获获得得得得稳稳定的定的定的定的细细胞株胞株胞株胞株 细细胞系胞系胞系胞系传传代以代以代以代以得到大量的同种得到大量的同种得到大量的同种得到大量的同种细细胞胞胞胞，并，并，并，并维维持持持持细细胞种的延胞种的延胞种的延胞种的延续续 接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制 营营养枯竭养枯竭养枯竭养枯竭 将培养的
41、将培养的将培养的将培养的细细胞从培养器皿中胞从培养器皿中胞从培养器皿中胞从培养器皿中消化消化消化消化下来，以下来，以下来，以下来，以1:21:21:21:2或或或或l:3l:3l:3l:3以上以上以上以上的比率的比率的比率的比率转转移到另外的器皿中移到另外的器皿中移到另外的器皿中移到另外的器皿中进进行培养，即行培养，即行培养，即行培养，即为传为传代培养代培养代培养代培养 细细胞胞胞胞“一代一代一代一代”指指指指从从从从细细胞胞胞胞接种接种接种接种到分离再培养的一段期到分离再培养的一段期到分离再培养的一段期到分离再培养的一段期间间，与与与与细细胞世代或倍增不同，在一代中，胞世代或倍增不同，在一代
42、中，胞世代或倍增不同，在一代中，胞世代或倍增不同，在一代中，细细胞培增胞培增胞培增胞培增3 3 3 36 6 6 6次次次次86优质课件消化法传代培养步骤87优质课件( (五五) )细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏冷冷冻冻保存要点保存要点冷冻过程要缓慢：冷冻过程要缓慢：缓冻速溶缓冻速溶4 304 3060 60 分钟分钟-20 30 -20 30 分钟分钟 -80 16-80 1618 18 小时（或过小时（或过夜）夜）液氮长期保存液氮长期保存或使用程序降温盒，每秒下降或使用程序降温盒，每秒下降1 1 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于9090，无微生物污染。
43、，无微生物污染。细胞浓度控制在：细胞浓度控制在：5x105x106 62x102x107 7/ml/ml。常用常用细细胞冷胞冷冻冻保存液保存液 5%5%或或1010DMSODMSO完全培养液完全培养液 1010甘油完全培养液甘油完全培养液88优质课件冷冻细胞注意事项冷冻细胞注意事项冻存液配制存液配制 : 现用现配，DMSO是易燃物冻存液体存液体积：要小，0.5-1 ml冻存存细胞数胞数：与正常传代细胞数目要相当，避免复苏后细胞传代比例发生变化冻存速度存速度： 降温缓慢 4C，1030 min -20C，1 - 2 h -80C，1 hour 过夜 -196C，1- 2 year 完善完善记录：
44、冻存细胞名称，PD，冻存日期，冻 存人，存放位置，其它特殊信息等89优质课件细胞冻存管，做好标记90优质课件91优质课件细细 胞胞 复复 苏苏 速融速融冻存细胞从液氮中取出后，立即放冻存细胞从液氮中取出后，立即放冻存细胞从液氮中取出后，立即放冻存细胞从液氮中取出后，立即放入入入入37373737水浴水浴水浴水浴中，轻轻中，轻轻中，轻轻中，轻轻摇动冷冻管，使其在摇动冷冻管，使其在摇动冷冻管，使其在摇动冷冻管，使其在1 1 1 1 分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过3 3 3 3 分分分分钟）钟）钟）钟） 解解冻冻后的后的细细胞可直接接
45、种到含胞可直接接种到含完全培养液完全培养液中直接中直接进进行培养，行培养，24 24 小小时时后后再用再用新新鲜鲜完全培养液完全培养液替替换换旧培养液，以去除旧培养液，以去除DMSODMSO 如果如果细细胞胞对对冷冷冻冻保保护剂护剂特特别别敏感敏感解冻后的细胞应先通过解冻后的细胞应先通过解冻后的细胞应先通过解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂离心去除冷冻保护剂离心去除冷冻保护剂离心去除冷冻保护剂，然后再接，然后再接，然后再接，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中种到含完全生长培养液的培养瓶中种到含完全生长培养液的培养瓶中种到含完全生长培养液的培养瓶中92优质课件（六）细（六）细 胞胞 污污
46、 染染细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除93优质课件细菌污染细胞培养常胞培养常见的的污染染最常最常见的有革的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假杆菌、假单胞菌胞菌等革等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常常见。培养培养细胞受胞受细菌菌污染后，会出染后，会出现培养液培养液变混混浊，pH改改变。污染后染后细胞胞发生病理改生病理改变，胞内，胞内颗粒增多、增粗，最后粒增多、增粗，最后变圆脱落脱落死亡。死亡。94优质课件真菌污染真菌污染真菌真菌污染后，染后，细胞生胞生长变慢，但最后由于慢，但最后由于营养耗尽及养耗尽及毒性
47、作用而使毒性作用而使细胞脱落死亡。胞脱落死亡。95优质课件白色念珠菌（倒置显微镜下）中间长梭型的是正在分裂的念珠菌96优质课件细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除使用抗生素使用抗生素抗生素抗生素对杀灭细菌菌较有效。有效。联合用合用药比比单独用独用药效果好。效果好。预防用防用药比比污染后再用染后再用药效果好，一般用双抗生素。效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用染后清除用药需采用大于常用量需采用大于常用量5 51010倍倍药物冲洗物冲洗法，于加法，于加药后作用后作用24244848小小时，再，再换常常规培养液。此培养液。此法在法在污染早期有效。染早期有效。97优质课件9595以上是以下四种支原体：以
48、上是以下四种支原体：口腔支原体（口腔支原体（M.oraleM.orale）精氨酸支原体（精氨酸支原体（M.argininiM.arginini）猪鼻支原体（猪鼻支原体（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性问题，平均发生率达到世界性问题，平均发生率达到11%11%能改变细胞的能改变细胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表达及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：来源：操作环境不良
49、操作环境不良操作人员的疏失操作人员的疏失实验器具不洁等实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的细胞已受污染的培养基、血清已受污染的培养基、血清支原体污染支原体污染98优质课件荧光染色法荧光染色法电镜检查电镜检查：扫描电镜扫描电镜、透射电镜透射电镜支原体培养支原体培养聚合酶链反聚合酶链反应应(PCR)法法支原体污染检测支原体污染检测99优质课件细胞营养液常常细胞营养液常常仍清亮但仍清亮但变黄变黄,细胞生长变缓细胞生长变缓，部分细胞发部分细胞发生脱落等等生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现支原体污染表现荧光染料荧光染料Hoechst33258Hoechs
50、t33258染色法检测支原体染色法检测支原体100优质课件 支原体的清除支原体的清除支原体清除剂MRA（MycoplasmaRemovalAgent）处理法每4天换一次液，连续处理15天清洗纯化法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。支原体特异性血清法用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支
51、原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。101优质课件共培养通常是一类细胞需要另一种细胞提供营养或者物理支持小鼠胚胎干细胞102优质课件细胞运输 1. 保存在干冰或液氮中运输； 2. 培养在瓶中: 当细胞生长至50汇合，瓶中 充满培液，瓶口封紧，运输途中培养瓶最好 呈直立状。细胞带至培养室后，在确保无污 染的情况下立即开封，用酒精消毒瓶口和瓶 身，吸出多余的培养液后将培养瓶平躺在培 养箱内。吸出的培液置于无菌容器中, 可用 于同一种细胞的培养。103优质课件血清的作用 1. 血清中含有许多多营养物养物质如：蛋白、激素、生长因子、 细胞因子、维生素等； 2. 血清是很好
52、的缓冲系冲系统； 3含有转运蛋白，如转铁蛋白、铜蓝蛋白等； 4含有贴壁因子壁因子或粘附蛋白如纤粘连蛋白、胎球蛋白等可 以帮助细胞贴壁； 5对于重金属有重金属有解毒的作用。104优质课件血清的缺点1. 1. 血清成分复成分复杂，不利于从培液中提取提取产物物；2. 有些物质能干干扰实验结果果，如受体和C3片段的检测；难以研究各种因子作用的机制;3. 血清能促使成纤维细胞过量生长，故对上皮细胞培养不利;4. 每每批批血血清清中中成成分分不不同同，可以影响实验的结果，包括贴壁率等；5. 易易污染支原体染支原体。105优质课件无血清培养的优点1便于研究激素、生长因子、细胞因子、维生素等对细胞生长和分泌功
53、能的作用及其作用机理包括信号通路等。2作为选择性培养基，便于从原代培养细胞中选择目的细胞类型和较纯的上皮细胞。3. 消除不同批号引起实验结果的不一致。5基因工程和细胞工程产物的后处理简单。6用于追踪肿瘤细胞的扩散。7. 细胞工程临床治疗中降低免疫排斥。106优质课件使用无血清培养的注意事项1pH缓冲系统不如含血清者佳，培液中加 HEPES、细胞培养在CO2 培养箱中。 2 细 胞 经 胰 蛋 白 酶 消 化 后 需 加 入 血 清 、 BSA 或大豆胰蛋白酶抑制剂。 3 细胞的冻存液中一般可添加血清。107优质课件使用无血清培养的注意事项 5进行药物筛选实验时，用药量比含血清者 低十倍左右。 6根据各种细胞不同要求添加贴壁因子和生 长因子，也可以将细胞先培养在含血清的 培养液中，待细胞贴壁后换成无血清培养 液；或将成系的细胞培养在不断降低血清 浓度的培养液中 (每传5次降低一次血清浓 度10510.1)。108优质课件
