第七章 分子发光-荧光与磷光#课件参考

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1、第七章分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光: :FluorescenceFluorescence分子磷光分子磷光分子磷光分子磷光: :PhosphorescencePhosphorescencemolecular luminescence analysis7.1 分子发光的基本原理分子发光的基本原理vv第第第第一一一一次次次次记记记记录录录录荧荧荧荧光光光光现现现现象象象象的的的的是是是是1616世世世世纪纪纪纪西西西西班班班班牙牙牙牙的的的的内内内内科科科科医医医医生生生生和和和和植植植植物物物物学学学学家家家家N.MonardesN.Monardes， 15751575年年年年 他他他他 提提

2、提提 到到到到 在在在在 含含含含 有有有有 一一一一 种种种种 称称称称 为为为为 “ “Lignum Lignum NephriticumNephriticum” ”的的的的木木木木头头头头切切切切片片片片的的的的水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中，呈呈呈呈现现现现了了了了极极极极为为为为可可可可爱爱爱爱的的的的天天天天蓝蓝蓝蓝色。色。色。色。vv直直直直到到到到18521852年年年年，StokesStokes在在在在考考考考察察察察奎奎奎奎宁宁宁宁和和和和叶叶叶叶绿绿绿绿素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光时时时时，用用用用分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计观观观观察察察察到到到到其其

3、其其荧荧荧荧光光光光的的的的波波波波长长长长比比比比入入入入射射射射光光光光的的的的波波波波长长长长稍稍稍稍微微微微长长长长些些些些，才才才才判判判判断断断断这这这这种种种种现现现现象象象象是是是是这这这这些些些些物物物物质质质质在在在在吸吸吸吸收收收收光光光光能能能能后后后后重重重重新新新新发发发发射射射射不不不不同同同同波波波波长长长长的的的的光光光光，而而而而不不不不是是是是由由由由光光光光的的的的漫漫漫漫射射射射作作作作用用用用所所所所引引引引起起起起的的的的，从从从从而而而而导导导导入入入入了了了了荧荧荧荧光光光光是是是是光光光光发发发发射射射射的的的的概概概概念念念念，他还由发荧光

4、的矿石他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石“ “萤石萤石萤石萤石” ”推演而提出推演而提出推演而提出推演而提出“ “荧光荧光荧光荧光” ”这一术语。这一术语。这一术语。这一术语。vv18671867年年年年，GoppelsroderGoppelsroder进进进进行行行行了了了了历历历历史史史史上上上上首首首首次次次次的的的的荧荧荧荧光光光光分分分分析析析析工工工工作作作作，应应应应用铝用铝用铝用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。vv1919世世世世纪纪纪纪以以以以前前前前，荧荧荧

5、荧光光光光的的的的观观观观察察察察是是是是靠靠靠靠肉肉肉肉眼眼眼眼进进进进行行行行的的的的，直直直直到到到到19281928年年年年，才才才才由由由由JetteJette和和和和WestWest提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、

6、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小； 2.激发态基态的能量传递途径(分子的去激过程) 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状

7、状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图非辐射能量传递过

8、程振动弛豫振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间10 -12 s。内转换内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10 -12 s。内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。 由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10 -12 s)，因此，激发后的分子很快回到电子第一激发单重态S1的最低振

9、动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见。外外转转换换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因此，该过程使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系系间间跨跨越越：是不同多重态之间的一种无辐射跃迁。该过程是激发电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的概率增大。 如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程 荧光发射：荧光发射：当分子处于第一激发单重态当

10、分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分的最低能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可能通过发射光子跃迁回到基态能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。为荧光发射。电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ；磷光发射磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上

11、，从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(即T1 S0)，故属于“禁阻”跃迁。因此磷光的寿命比荧光要长很多，约为10-3到10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可以观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。一一一一. . 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生1. 1. 单重态与三重态单重态与三重态单重态与三重态单重态与三重态2. 分子的活化与去活化3.3.分子发光的类型分子发光的类型分子发光的类型分子发光的类型按激发的模式分类：按激发的模式分类：按激发的模式分类：按激发的模式分类： 按分子激发态的类

12、型分类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类： 光致发光光致发光光致发光光致发光化学发光化学发光化学发光化学发光/ /生物发光生物发光生物发光生物发光热致发光热致发光热致发光热致发光场致发光场致发光场致发光场致发光摩擦发光摩擦发光摩擦发光摩擦发光 分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光分子发光荧光荧光荧光荧光磷光磷光磷光磷光瞬时荧光瞬时荧光瞬时荧光瞬时荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光按光子能量分类：按光子能量分类：按光子能量分类：按光子能量分类：斯托克斯荧光斯托克斯荧光斯托克斯荧光斯托克斯荧光(Stokes)(Stokes)： exex

13、emem共振荧光共振荧光共振荧光共振荧光(Resonance)(Resonance)： exex = = emem 荧光荧光荧光荧光 分子的活化与去活化S S0 0S S1 1T T1 1S S2 2紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见吸吸吸吸收收收收光光光光谱谱谱谱外转移外转移外转移外转移紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见共共共共振振振振荧荧荧荧光光光光光光光光谱谱谱谱内转移内转移内转移内转移荧光荧光荧光荧光系间系间系间系间窜跃窜跃窜跃窜跃磷磷磷磷光光光光反系间反系间反系间反系间窜跃窜跃窜跃窜跃迟迟迟迟滞滞滞滞荧荧荧荧光光光光振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫. . 无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型

14、无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫: : V Vr r 1010-12-12secsec外外外外 转转转转 移移移移: :无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁回到基态回到基态回到基态回到基态内内内内 转转转转 移移移移: :S S2 2SS1 1能级能级能级能级之间有重叠之间有重叠之间有重叠之间有重叠系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃: : S S2 2TT1 1能级能级能级能级之间有重叠之间有重叠之间有重叠之间有重叠反系间窜跃反系间窜跃反系间窜跃反系间窜跃: :由外部获由外部获由外部获由外部获取能量后取能量后取能量后取能量后 T T1 1 S S2 2. .

15、辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型共振荧光：共振荧光：共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 secsec荧荧荧荧 光：光：光：光：1010-8 -8 secsec磷磷磷磷 光：光：光：光：110110-4 -4 secsec迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光迟滞荧光: :10102 21010-4 -4 secsec二二二二. . 分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光( (磷光磷光磷光磷光) )光谱光谱光谱光谱1. 1. 荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )

16、均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。质发射出不同波长的荧光。质发射出不同波长的荧光。质发射出不同波长的荧光。 任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和发射光谱。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？A. A. 荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX) exex =290nm =290nm (MAX)(MAX)固定发射波长固定发射波长固定发射波长固定发射波长扫描激发波长

17、扫描激发波长扫描激发波长扫描激发波长荧光激发光谱与荧光激发光谱与荧光激发光谱与荧光激发光谱与紫外紫外紫外紫外- -可见吸收光可见吸收光可见吸收光可见吸收光谱类似谱类似谱类似谱类似 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。B. B. 发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱( (荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱) ) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。D.D.磷光光谱磷光光谱磷光光谱磷光光谱与与与与发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光

18、谱激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光光谱的特征激发光谱与发射光谱的关系1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移，这种位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。2. 2. 镜像对称规则镜像对称规

19、则镜像对称规则镜像对称规则 exex =290nm =290nm (MAX)(MAX)固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定固定固定 exex=290nm =290nm (MAX)(MAX) emem= = 620nm 620nm(MAX)(MAX)S S0 04 43 32 21 1S S1 14 43 32 21 11 1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 4 41 1 4 41 1 2 21 1 1 1 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释大多数吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态

20、的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构相似，因此吸收光谱的形状与荧光发生光谱的形状呈镜像对称关系。3、荧光发射光谱的形状与激发波长无关 一般地，用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上，所以荧光光谱的形状与激发波长无关。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换

21、 2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图2. 2. 2. 2. 三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱I I F F f f f f ( ( ( ( exex 、 emem) ) ) )蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长I I F F f f f f ( ( ( ( exex 、 emem) ) ) )蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫

22、描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱VBVB1 1和和和和VBVB2 2的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱RLSRLSDSDSTSTSATSATSADSADS散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱3.3.3.3.三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱ADSADSATSATSTSTSRLSDSDS散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振

23、光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射共振光散射共振光散射共振光散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射固定固定固定固定 exex=270nm=270nm拉曼光拉曼光拉曼光拉曼光二级共振光散射二级共振光散射二级共振光散射二级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间三三三三. . 分子荧光分子荧光分子荧光分子荧光( (磷光磷光磷光磷光) )强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关强度与荧光物质浓度的关系系系系1. 1. 荧光强度荧光

24、强度荧光强度荧光强度( (磷光磷光磷光磷光) )与浓度的关系与浓度的关系与浓度的关系与浓度的关系光吸收定律光吸收定律光吸收定律光吸收定律（Lambert Beer LawLambert Beer Law）相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：荧光强度（荧光强度（荧光强度（荧光强度（I IF F）与相应的吸光分数成正比：与相应的吸光分数成正比：与相应的吸光分数成正比：与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：按照级数展开式：按照级数展开式：按照级数展开式：对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bcbc0.0.0505（磷光磷光磷光磷光 bcbc

25、0.10001000 p p(s)(s)2.62.62.52.51.41.40.230.230.0140.0140.0020.0023 36.6.溶剂效应溶剂效应溶剂效应溶剂效应蓝移蓝移蓝移蓝移: : E E n *n * E E n * n * 红移红移红移红移: : E E* E E* * 在极性溶剂中：在极性溶剂中：在极性溶剂中：在极性溶剂中：无溶剂化作用无溶剂化作用无溶剂化作用无溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用有溶剂化作用三. 金属螯合物的荧光1. 1. 螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光2. 2. 螯合物中金属离子的发光螯合

26、物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉弱荧光弱荧光弱荧光弱荧光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉-Zn-Zn螯合螯合螯合螯合物物物物黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯无荧光无荧光无荧光无荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯-Al-Al螯合物螯合物螯合物螯合物强荧光强荧光强荧光强荧光T T1 1系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃S S0 0S S1 1d d * *、f f* * d d * * d d f f* * f

27、 f 荧光荧光荧光荧光分子内能量转移分子内能量转移分子内能量转移分子内能量转移三、影响荧光强度的环境因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象自自吸吸现现象象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的

28、猝灭荧荧荧荧 光光光光 熄熄熄熄 灭灭灭灭：荧荧荧荧光光光光分分分分子子子子与与与与溶溶溶溶剂剂剂剂分分分分子子子子或或或或其其其其它它它它溶溶溶溶质质质质分分分分子子子子相相相相互互互互作作作作用用用用引起荧光强度降低或消失的现象。引起荧光强度降低或消失的现象。引起荧光强度降低或消失的现象。引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。1. 1. 碰撞熄灭碰撞熄灭碰撞熄灭碰撞熄灭相对速率相对速率

29、相对速率相对速率 1 1K K1 1 M M* * K K2 2 MM* * Q Q 与分子的直径、与分子的直径、与分子的直径、与分子的直径、粘度、温度等因素粘度、温度等因素粘度、温度等因素粘度、温度等因素有关。有关。有关。有关。2. 2. 能量转移熄灭能量转移熄灭能量转移熄灭能量转移熄灭再吸收过程：再吸收过程：再吸收过程：再吸收过程：共振能量转移：共振能量转移：共振能量转移：共振能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移：hvhv激发激发激发激发发射发射发射发射熄灭熄灭熄灭熄灭3. 3. 氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂

30、，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4. 4. 自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于1g/L1g/L时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭( (浓度熄灭浓度熄灭浓度熄灭浓度熄灭) )自吸收：自吸收：自吸收：自吸收：没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中难以观察到磷光难以观察到磷光难以观察到磷光难以观察到磷光由于由于由于由于 F F 1 1，使荧光使荧光使荧光使荧光强度减弱

31、或消失强度减弱或消失强度减弱或消失强度减弱或消失. .形成二聚体：形成二聚体：形成二聚体：形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。灭现象。灭现象。灭现象。7.3 7.3 荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计一一一一. . 主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基

32、及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器问问问问题题题题：荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度

33、度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外- -可可可可见见见见分分分分光光光光光度计有何异同点？光度计有何异同点？光度计有何异同点？光度计有何异同点？二二二二. . 光源光源光源光源1. 1. 光源的要求：光源的要求：光源的要求：光源的要求：vv发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱vv光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小vv有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命2.2.氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源常用气体放电灯类型：常用气体放

34、电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型： 氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源高压汞光源高压汞光源波长范围：波长范围：波长范围：波长范围：2001000nm2001000nm工作压力工作压力工作压力工作压力：520 520 atmatm启动电压：启动电压：启动电压：启动电压：2040KV2040KV使用寿命：使用寿命：使用寿命：使用寿命：10002000h10002000h最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大发射光强度大发射光强度大

35、3. 3. 高压汞灯光源高压汞灯光源高压汞灯光源高压汞灯光源应用广泛的应用广泛的应用广泛的应用广泛的线光源线光源线光源线光源：253.7253.7 296.5 302.2 312.6 296.5 302.2 312.6313.2 313.2 365.0 365.0 365.5 366.3365.5 366.3404.7 435.8404.7 435.8 546.1 557.0 546.1 557.0579.0 579.0 (nm )(nm )光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发滤光片滤光片滤光片滤光片检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪

36、器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发滤光片滤光片滤光片滤光片检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射滤光片滤光片滤光片滤光片玻玻玻玻璃璃璃璃滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率干干干干涉涉涉涉滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率截截截截止止止止涉涉涉涉滤滤滤滤光光光光片片片片的的的的透透透透射射射射率率率率三三三三. . 单色单色单色单色器器器器 平面衍射光栅平面衍射光栅平面衍射光栅平面衍射光栅线色散率线色散率线色散率

37、线色散率聚光本领聚光本领聚光本领聚光本领分辨率分辨率分辨率分辨率四四四四. . 检测器检测器检测器检测器光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管 放大倍数：放大倍数：放大倍数：放大倍数：2 2 2 2n n n n 5 5 5 5n n n n;n=10,10;n=10,10;n=10,10;n=10,103 3 3 3 101010107 7 7 7， 最大最大最大最大101010108 8 8 8 101010109 9 9 9五五五五. .样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样

38、品池的材料：与紫外- -可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样2. 2. 吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外- -可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围3. 3. 使用注意事项使用注意事项使用注意事项使用注意事项容易破碎容易破碎容易破碎容易破碎问题：问题：问题

39、：问题：紫外紫外紫外紫外- -可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题闪跃特性闪跃特性闪跃特性闪跃特性六六六六. . 磷光分光光度计磷光分光光度计磷光分光光度计磷光分光光度计1. 1. 光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单

40、色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器切光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）共振荧光：共振荧光：共振荧光：共振荧光：1010-12 -12 secsec荧荧荧荧 光：光：光：光：1010-8 -8 secsec磷磷磷磷 光：光：光：光：110110-4 -4 secsec迟滞荧光：迟滞荧光：迟滞荧光：迟滞荧光：1001010010-4 -4 secsec2. 2. 样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计

41、的区别通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶内，来测定内，来测定内，来测定内，来测定低温磷光低温磷光低温磷光低温磷光。7.7. 荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用一一一一. . 工作曲线法工作曲线法工作曲线法工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高10103 310104 4. .荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工

42、作曲线法荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法F Fx xF FC Cs sC Cx x直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法F FC Cs sF Fx xC Cx x二二二二. . 荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度在在在在紫紫紫紫外外外外光光光光照照照照射射射射下下下下会会会会发发发发生生生生荧荧荧荧光光光光的的的的无无无无机机机机化化化化合合合合物物物物很很很很少少少少，主主主主要要要要依依依依赖赖赖赖于于于于有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。有机试剂形成的螯合物。三三三三. . 荧光分

43、析的应用荧光分析的应用荧光分析的应用荧光分析的应用1. 1. 无机化合物无机化合物无机化合物无机化合物vv直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法其其其其中中中中，较较较较常常常常测测测测定定定定的的的的元元元元素素素素有有有有：BeBe、AlAl、B B、GaGa、SeSe、MgMg、ZnZn、CdCd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到1010-10-10; ;某某某某些些些些元元元元素素素素虽虽虽虽然然然然不不不不与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂

44、剂剂形形形形成成成成发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物，但但但但是是是是它它它它会会会会与与与与发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物争争争争夺夺夺夺配配配配位位位位体体体体，组组组组成成成成不不不不发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合，使使使使其其其其产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光熄灭，由荧光熄灭的强度计算该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度计算该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度计算该元素的含量。熄灭，由荧光熄灭的强度计算该元素的含量。较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：F F、S S、FeFe、Ag

45、Ag、CoCo、NiNi、CuCu、MoMo、WWvv荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法荧光熄灭测定法 自自自自从从从从18671867年年年年GoppelsroderGoppelsroder进进进进行行行行了了了了历历历历史史史史上上上上首首首首次次次次的的的的荧荧荧荧光光光光分分分分析析析析工工工工作作作作，应应应应用用用用铝铝铝铝桑桑桑桑色色色色素素素素配配配配合合合合物物物物的的的的荧荧荧荧光光光光进进进进行行行行铝铝铝铝的的的的测测测测定定定定以以以以来来来来，采采采采用用用用有机试剂可以测定有机试剂可以测定有机试剂可以测定有机试剂可以测定7070多种元素。多种元素。多种元素

46、。多种元素。vv催化荧光测定法催化荧光测定法催化荧光测定法催化荧光测定法较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：CrCr、NbNb、U U、TeTe、PbPb某某某某些些些些元元元元素素素素虽虽虽虽然然然然与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物，但但但但是是是是反反反反应应应应速速速速度度度度慢慢慢慢，在在在在某某某某些些些些微微微微量量量量元元元元素素素素的的的的催催催催化化化化下下下下，反反反反应应应应速速速速度度度度会会会会加加加加快快快快，在在在在特特特特定定定定的的的的时时时时间

47、内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。间内可用来测定微量元素。vv低温荧光测定法低温荧光测定法低温荧光测定法低温荧光测定法常测定的元素有：常测定的元素有：常测定的元素有：常测定的元素有：CuCu、BeBe、FeFe、CoCo、OsOs、AgAg、AuAu、ZnZn、AlAl、TiTi、V V、MnMn、ErEr、H H2 2OO2 2、CNCN某某某某些些些些微微微微量量量量元元元元素素素素存存存存在在在在，会会会会催催催催化化化化发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光熄熄熄熄灭灭灭灭，在特定的时间内可用来测定微

48、量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。在特定的时间内可用来测定微量元素。溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 1961960 0C C较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：CeCe、SmSm、Tb Tb 等稀土元素等稀土元素等稀土元素等稀土元素SbSb、V V、PbPb、BiBi、NbNb、MnMnvv固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧光测定法固体荧光法在荧光分析中也经常

49、用到。固体荧光法在荧光分析中也经常用到。固体荧光法在荧光分析中也经常用到。固体荧光法在荧光分析中也经常用到。芳芳芳芳香香香香族族族族化化化化合合合合物物物物存存存存在在在在共共共共轭轭轭轭的的的的不不不不饱饱饱饱和和和和体体体体系系系系，是是是是有有有有机机机机化化化化合合合合物物物物荧荧荧荧光光光光测测测测定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。. . 有机化合物有机化合物有机化合物有机化合物待测物待测物待测物待测物试剂试剂试剂试剂 exexmaxmax ememmaxmax测定范围测定范围测定范围测定范围 ppmppm丙三醇丙三醇丙三醇丙三醇苯胺苯胺苯胺苯胺紫外紫外紫外紫外

50、蓝色蓝色蓝色蓝色0.120.12糠醛糠醛糠醛糠醛蒽酮蒽酮蒽酮蒽酮4654655055051.5151.515氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶3153154254250.01500.0150维生素维生素维生素维生素A A无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇345345490490020020蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质曙红丫曙红丫曙红丫曙红丫紫外紫外紫外紫外5405400.0660.066肾上腺素肾上腺素肾上腺素肾上腺素乙二胺乙二胺乙二胺乙二胺4204205255250.0010.020.0010.02 青霉素青霉素青霉素青霉素-甲氧基甲氧基甲氧基甲氧基- - -氯氯氯氯- -(-(-氨

51、乙基氨乙基氨乙基氨乙基)- )-氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽4204205005000.06250.6250.06250.625玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅玻璃酸梅3-3-乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚3953954704700.0010.0330.0010.033胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺胍基丁胺邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛邻苯二醛3653654704700.0550.055四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶四氧嘧啶苯二胺苯二胺苯二胺苯二胺3653654854851010-4-43. 3. 生命与生物物质生命与生物物质生命与生物物质生命与生物物质紫外紫外紫外紫外- -可见分光光度计

52、可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计: :光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光( (磷光磷光磷光磷光) )分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计: :光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品

53、池样品池样品池I0ItI0ItIF,p7.5 7.5 化学发光分析化学发光分析一、一、基本原理基本原理1. 1. 化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反

54、应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt 分析物参加反应的速率；3.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应： dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.

55、4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3； O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射

56、光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：c. 乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；（2 2）火焰中的化学发光反应）火

57、焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a. 一氧化氮一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：最大发射波长：690nm； 在在富氢火焰中：富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S +

58、 S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：最大发射波长：394nm； 灵敏度：灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程： 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用

59、这一现象可测定这些金属离子。5. 5. 化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2） 可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3） 间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 + O2 酮酸酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O

60、葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2 ，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶 草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。生物发光分析应用生物发光分析应用 1 1 在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi +

61、 2H+pH7 - 8复合物与氧反应，产生化学发光： AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O氧化荧光素* 氧化荧光素 + h最大发射波长562nm；生物发光分析应用生物发光分析应用 2 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脱氢酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黄素酶最大发射波长495 nm；二、二、特点特点1. 1. 灵敏度极高灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)

62、的化学发光分析，可测定210-17Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2 2. . 仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3. 3. 发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4. 4. 线性范围宽线性范围宽5. 5. 分析速度快分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。 三、三、装置与技术装置与技术 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静静态态方

63、方式式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流流动动注注射射方方式式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；习 题解释系列名词: (1) 量子效率 ；(2) 振动弛豫 (3)系间跨跃在UV-VIS范围内，从原理上比较分子荧光、磷光和化学发光的异同，并比较它们的吸收现象。什么是荧光猝灭？举例说明怎么利用荧光猝灭来进行化学分析？在实际中，怎样区分荧光和磷光？比较荧光光谱法和化学发光光谱法的仪器特点。荧光光谱法的灵敏度一般要比吸收光谱法的灵敏度高，试解释其原因。通过下列方法能够改变荧光量子产率，并说明原因。 (1) 降低温度；(2) 升高温度 （3）改变荧光体的浓度 (4)加入动态猝灭剂 (5) 加入静态焠灭剂(6)改变溶剂的黏度试说明为了获得荧光的: (1)激发光谱；(2) 发射光谱；(3) 同步荧光光谱；(4) 三维荧光光谱，在实验上有哪些差别？为什么在高浓度条件下分子荧光校准曲线会变成非线性？