DNA的生物合成ppt课件

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1、目目 录录DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 九九 章章1 1目目 录录中心法则（ central dogma）遗传信息传递方向的规律遗传信息传递方向的规律基因表达：基因表达：是指将遗传信息由是指将遗传信息由DNA转录转录为为RNA、再、再翻译翻译成蛋白质的过程成蛋白质的过程2 2目目 录录3 3目目 录录复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA4 4目目 录录复制的基本规律复制的

2、基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节5 5目目 录录一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生生物物合合成成时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代细细胞胞的的DNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成成。两两个个子子细细胞胞的的DNA都都和和亲亲代代DNA碱碱基基序序列列一一致致。这这种种复复制制方式称为方式称为半保留

3、复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念6 6AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 目目 录录7 7目目 录录密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮N15-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代

4、继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果8 8目目 录录按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。9 9目目 录录二、双向复制二、双向复制原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制两个方向解链，形

5、成两个延伸方向相反的复制叉，称为叉，称为双向复制双向复制。 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象1010目目 录录Cairns复制模型复制模型型复制型复制1111目目 录录1212目目 录录A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C1313目目 录录53oriorioriori535533553复制子复制子31414目目 录录（2）起始点和方向）起始点和方向 原核生物和真核生物复制都是在原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的分子特定的位置

6、起始的，如大肠杆菌起始点有固定的重复的保守顺位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的重复的保守顺序，可被酶识别。序，可被酶识别。 方向：大多是双向、对称复制方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或不对称也有单向或不对称的。的。 速度：速度： 原核生物复制叉移动快原核生物复制叉移动快(约约105bp/min); 真核生物复制叉移动慢真核生物复制叉移动慢 (约约51025103bp/min) 1515目目 录录复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）1616目目 录录三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链

7、(lagging strand)1717目目 录录顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的，这股链称为这股链称为领头链领头链(前导链）前导链）。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为随随从从链链（后后随随链链、滞滞后后链链）。复复制制中中的的不不连连续续片段称为片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制制的的半不连续性半不连续性

8、。 1818目目 录录参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子1919一、复制的化学反应一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 录录2020目目 录录聚合反应的特点聚

9、合反应的特点 除了底物和酶外，除了底物和酶外，DNA 新链生成需新链生成需引引物物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3方向进行方向进行 。2121目目 录录二、二、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合酶活性的聚合酶活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性2222目目 录录23235 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G

10、 A C 5 35外切酶活性外切酶活性 53 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录2424目目 录录2525目目 录录2626目目 录录2727目目 录录2828目目 录录2929目目 录录3030目目 录录n n功能：n n 53聚合酶活性；n n 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 n n确配对后才发挥聚合作用n n 3 5外切酶活性；n n 主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配”n n 53外切酶活性。n n 主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA

11、复制时RNA引物的切除及其空隙的填补n n 可见，DNA pol是1个多功能酶3131目目 录录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段53核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 35核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 3232目目 录录功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)33

12、33目目 录录3434目目 录录亚基具有亚基具有53方向合成方向合成DNA的催化活性的催化活性亚基具有亚基具有35外切酶活性，起校对功能，外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶可提高聚合酶复制复制DNA的保真性的保真性 亚基可能亚基可能起组建的作用起组建的作用亚基犹如夹子，亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动分子向前滑动 亚基亚基起着促使核心酶二聚化的作用起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成其余的亚基构成 -复合物，复合物，主要功能是帮助主要功能是帮助 亚基夹住亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用增强核心

13、酶活性的作用3535目目 录录（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 3636目目 录录3737目目 录录（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白3838目目 录录解螺

14、旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 3939目目 录录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类4040目

15、目 录录4141目目 录录4242目目 录录4343目目 录录4444目目 录录4545目目 录录五、五、DNA连接酶连接酶连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相相邻邻的的DNA链链连连接接成成一一条条完完整整的的链链。以以N（大肠杆菌）或（真核细胞）为能源。（大肠杆菌）或（真核细胞）为能源。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式4646HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353目目 录录4747目目 录录4848目目 录录DNA连连接接酶酶在在复复制制中中起起最

16、最后后接接合合缺缺口口的的作用。作用。在在DNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能4949目目 录录（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 5050目目 录录原核生物原核生物E.coli为例为例复制由起始点复制由起始点复制由起始点复制由起始点 oriC(origin)oriC(origin)开始双向复制

17、开始双向复制开始双向复制开始双向复制E.coliE.coliE.coliE.coli的复制起始点的复制起始点的复制起始点的复制起始点oriCoriCoriCoriC（245bp245bp245bp245bp的的的的DNADNADNADNA组分）组分）组分）组分）序列分析有如下特点序列分析有如下特点序列分析有如下特点序列分析有如下特点 3 3 3 3组串连重复序列组串连重复序列组串连重复序列组串连重复序列(13bp(13bp(13bp(13bp），每个顺序都由），每个顺序都由），每个顺序都由），每个顺序都由GATCGATCGATCGATC开始开始开始开始 2 2 2 2组反向重复序列组反向重复序

18、列组反向重复序列组反向重复序列(9bp)(9bp)(9bp)(9bp) 4 4 4 4个个个个dnaAdnaAdnaAdnaA蛋白结合部位蛋白结合部位蛋白结合部位蛋白结合部位5151目目 录录1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存在存在下结合于四个下结合于四个9bp9bp的重复序列。的重复序列。3 3、在类组蛋白（、在类组蛋白（HUHU、ATPATP参与下参与下, , Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp的重复序的重复序列列, ,形成开链复合物。形成开链复合物。4 4 、Dna BDna B借

19、助于水解借助于水解ATPATP产生的产生的能量在能量在Dna CDna C的帮助下沿的帮助下沿5 5 33 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，双链，形成前引发复合物。形成前引发复合物。5 5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）开蛋白）开始合成始合成RNARNA引物。引物。5252目目 录录5353目目 录录5454目目 录录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和

20、DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 5555目目 录录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶5656目目 录录5757目目 录录 DNADNA复复复复制制制制的的的的调调调调控控控控是是是是在在在在起起起起始始始始阶阶阶阶段段段段进进进进行行行行的的的的，一一一一旦旦旦旦复复复复制制制制起起起起始始始始，它它它它就就就就会会会会继继继继续续续续下下下下去去去去直直直直到到到到整整整整个个个个复复复复制制制制子子子子完成复制。完成复制。完成复制。完成复制。 复复复复制制制制

21、起起起起点点点点是是是是以以以以一一一一条条条条链链链链为为为为模模模模板板板板起起起起始始始始DNADNA合合合合成成成成的的的的一一一一段段段段序序序序列列列列。有有有有时时时时，两两两两条条条条链链链链的的的的复复复复制制制制起起起起点点点点并并并并不不不不在同一点上（不对称复制，如在同一点上（不对称复制，如在同一点上（不对称复制，如在同一点上（不对称复制，如DD环复制）。环复制）。环复制）。环复制）。 在在在在一一一一个个个个完完完完整整整整的的的的细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期中中中中，每每每每一一一一个个个个复复复复制起点只使用一次，完成一次复制过程。制起点只使用一次，完成一次复

22、制过程。制起点只使用一次，完成一次复制过程。制起点只使用一次，完成一次复制过程。 多数生物的复制起点，都是富含多数生物的复制起点，都是富含多数生物的复制起点，都是富含多数生物的复制起点，都是富含A.TA.T。5858目目 录录（二）复制的延长（二）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5959目目 录录 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目

23、录录6060领头链的合成领头链的合成目目 录录6161随从链的合成随从链的合成目目 录录6262目目 录录6363目目 录录6464目目 录录6565目目 录录6666目目 录录6767目目 录录原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止（三）复制的终止6868目目 录录 细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子的终止子(terminator)位点，位点，E. coli 有有7个终止子位点。个终止子

24、位点。 6969目目 录录 新合成的两条新合成的两条染色体染色体DNADNA分子相互分子相互连在一起，被拓扑连在一起，被拓扑异构酶异构酶IVIV分离分离7070目目 录录DNA复制的分子机制的基本特点n n复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。n n复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。n n复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。n n复制时，DNA的两条链都从5端向3端延伸。7171目目 录录n n前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。n n DNA的合成始于RNA引物的合成，因此前导链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每个都有RNA引物的合成。RNA引物随

25、后由DNA片段替换，相邻的DNA片段连接形成一条完整的DNA链。n nDNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持DNA分子的准确性和忠实性。7272目目 录录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。 蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实施调控作用。实施调控作用。 7373目目 录录 真真核核生生物物每每个个染

26、染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分分组组方方式式激激活活而不是同步起动。而不是同步起动。 复复制制的的起起始始需需要要DNA-pol（引引物物酶酶活活性性）和和pol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复复制制因子因子(replication factor, RF)。 增增殖殖细细胞胞核核抗抗原原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。 （一）复制的起始（一）复制的起始7474目目 录录

27、3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长7575目目 录录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）复制的终止（三）复制的终止76765 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录7777目目 录录20092009年诺贝尔生理学年诺贝尔生理学/ /医学奖：端粒和端粒酶如何保

28、护染色体医学奖：端粒和端粒酶如何保护染色体7878目目 录录端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG7979目目 录录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端

29、粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成8080目目 录录端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）8181目目 录录8282目目 录录真核生物真核生物DNADNA复制复制的特点的特点4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复 制；而在快速生长的原核生物染色体制；而在快速生长的原核生物染色体DNADNA复制中，起点可复制中，起点

30、可 以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多 的复制起点。的复制起点。1 1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列 （ARSARS）或复制基因）或复制基因(replicator);(replicator);多复制眼，呈双向复多复制眼，呈双向复 制，多复制子。制，多复制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp200bp。3 3、真核生物、真核生物DNADNA复制速度比原核慢，速度为复制速度比原核慢，速度为10001000 3000bp/min(3000bp/min(仅为原核生

31、物的仅为原核生物的1/201/201/501/50）。）。8383目目 录录5 5、真核生物有、真核生物有多种多种DNADNA聚合酶聚合酶,DNA,DNA聚合酶聚合酶（）是真正的）是真正的复制酶，在复制酶，在PCNAPCNA存在下有持续的合成能力。存在下有持续的合成能力。PCNAPCNA称为称为增殖细增殖细胞核抗原胞核抗原，相当于大肠杆菌，相当于大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的- -夹子，夹子，RFCRFC蛋白蛋白相当于夹子装配器。相当于夹子装配器。6 6、真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构，它是由许多成串的，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色

32、体末段结构，防止染色重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链体间的末端连接，并可补偿滞后链5 5- -末段在消除末段在消除RNARNA引物后引物后造成的空缺，使染色体造成的空缺，使染色体保持保持一定长度一定长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNARNA的的逆转录酶逆转录酶. .7 7、RPARPA：真核生物的单链结合蛋白；：真核生物的单链结合蛋白；RNaseHRNaseH1 1和和MF-1MF-1切除切除RNARNA引引物，物，DNADNA聚合酶聚合酶填补缺口。填补缺口。8484目目 录录n n至少依赖三种机制至少依赖三种机制至少依赖三种机制至少依赖

33、三种机制n n1 1 1 1、遵守严格的碱基配对规律、遵守严格的碱基配对规律、遵守严格的碱基配对规律、遵守严格的碱基配对规律n n2 2 2 2、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）选择底物）选择底物）选择底物）n n3 3 3 3、复制出错时有即时的校读功能、复制出错时有即时的校读功能、复制出错时有即时的校读功能、复制出错时有即时的校读功能复制忠实性的保证复制忠实性的保证8585目目 录录三、DNA复制的调控 n n原核生物DNA

34、的甲基化以及与细胞质膜的相互作用可以影响复制的起始时间。 n n酶： Dam甲基化酶 （腺嘌呤甲基化酶） n n位点： GATC中腺嘌呤的N6位 n n方式： 游离的oriC8686目目 录录n n复制时间与染色质结构、DNA甲基化以及转录活性有关。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。 n n复制许可因子（replication licensing factor）所控制.该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。由于该因子不能通过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体的复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。真核生物的复制起始是受多种因

35、子的调控，这些因子的磷酸化和去磷酸化直接影响着复制的起始。 8787目目 录录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 8888目目 录录逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA8989目目 录录逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T

36、分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 9090目目 录录DNADNA的损伤（的损伤（DNA damageDNA damage） 指一个或多个脱氧核苷酸的构成、复指一个或多个脱氧核苷酸的构成、复制或表型功能的异常变化，也称制或表型功能的异常变化，也称DNADNA损伤，损伤，又称又

37、称突变（突变（mutationmutation） 突变的结果引起遗突变的结果引起遗传信息的改变。传信息的改变。 DNA的突变的突变(损伤损伤)大多数是自发的，大多数是自发的，是进化与分化的基础。是进化与分化的基础。因素因素因素因素：自发突变：自发突变：自发突变：自发突变 诱发突变诱发突变诱发突变诱发突变9191目目 录录引发突变的因素引发突变的因素物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UV9292化学因素化学因素目目 录录9393目目 录录突变的分子改变类型突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入

38、(insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) 9494目目 录录DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换颠换（一）错配（一）错配9595目目 录录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val

39、glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因9696目目 录录（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或

40、插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变 。9797目目 录录谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变9898目目 录录-9999目目 录录（三）重排（三）重排DNA分子内较大片段的交换，称为分子内较大片段的交换，称为重组或重排。重组或重排。 100100目目 录录由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型101101目目 录录DNA损伤的修复损伤的修复修复修复(repairing) 是对已发生分子改变的补

41、偿措施，使其是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。回复为原有的天然状态。光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 修复的主要类型修复的主要类型102102目目 录录103103目目 录录（一）光修复（一）光修复光修复酶光修复酶(photolyase) UV104104UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP （二）切除修复（二）切除修复是细胞内最重要和是细胞内最重要和有效的修复机制，主要有效的修复机制，主要由由DNA-po

42、l和连接酶完和连接酶完成。成。DNA连接酶连接酶ATPE.coli的切除的切除修复机制修复机制目目 录录105105目目 录录106106目目 录录107107目目 录录108108目目 录录109109目目 录录（三）重组修复（三）重组修复110110目目 录录（四）（四）SOS修复修复当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，由由此此而而诱诱发出一系列复杂的反应。发出一系列复杂的反应。在在E. coli，各各种种与与修修复复有有关关的的基基因因，组组成成一一个个称为称为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这这种种修修复复特特异异性性低低，对对碱碱

43、基基的的识识别别、选选择择能能力力差差。通通过过SOS修修复复，复复制制如如能能继继续续，细细胞胞是是可可存存活活的的。然然而而DNA保保留留的的错错误误较较多多，导导致致较较广泛、长期的突变。广泛、长期的突变。111111目目 录录112112目目 录录113113目目 录录114114目目 录录115115目目 录录116116目目 录录117117目目 录录118118目目 录录119119目目 录录120120目目 录录121121目目 录录122122目目 录录123123目目 录录124124目目 录录125125目目 录录酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定酵母单杂交技术是一种研

44、究蛋白质和特定DNADNA序列相互作用的技术方法序列相互作用的技术方法根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。126126目目 录录127127目目 录录128128目目 录录129129目目 录录130130目目 录录131131目目 录录132132目目 录录三磷酸腺苷双磷酸酶三磷酸腺苷双磷酸酶ATPATP硫酸化酶硫酸化酶萤光素酶萤光素酶133133目目 录录134134目目 录录荧光标记荧光标记的的dNTP,3dNTP,3羟基带有羟基带有可被化学可被化学切割基团切割基团135135目目 录录136136目目 录录137137目目 录录138138