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1、实验三:药敏Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望实验内容实验内容l一、纸片扩散法(K-B法)l二、稀释法 (MIC)实验目的实验目的l一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果的判断及其临床意义。l二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。l三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。l四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。纸片扩散法(纸片扩散法(K-B法)法)l器材与试剂 菌种菌种: 金黄色葡萄球菌ATCC259
2、23和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物,调整浓度至0.5麦氏比浊管(相当于1.5108CFU/ml);或挑新鲜培养的单个菌落,在无菌生理盐水中研磨,校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 培养基培养基:水解酪蛋白培养基(MH琼脂)。 其他其他:无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。l原理:含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解,不断向纸片周围区域扩散,形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。l方法方法:(4人一组,人一组,2人做金葡菌标准种,人做金葡菌标准种,2人做人做
3、临床种,每种菌选临床种,每种菌选4个不同的药物纸片)个不同的药物纸片) 1、制备MH琼脂平板:将加热融化的琼脂冷却至60左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中,使琼脂厚度为4mm,待琼脂凝固后使用,如有冷凝水产生,可放置37 温箱中15-30分钟后使用。 2、无菌棉签蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60,最后沿平板內缘涂布1周。 3、平板在室温下干燥5分钟,用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面,各纸片中心相距大于24mm,距平板內缘大于15mm, 37 温箱中孵育16-18小时,量取抑菌圈直径。l结果观察中的注意事项: 1、准确量取抑菌圈直径,若抑菌
4、圈为椭圆形,量其最长径和最短径,取其平均值。 2、若出现双层抑菌圈,一般药物测量内圈,而磺胺类药物则量其外圈。 3、若抑菌圈内有散在菌落出现,排除污染菌的存在和其他影响因素,若无污染菌等,需重做。l结果观察结果观察:1、结果解释结果解释:用毫米尺量取抑菌圈直径,参照书上的标准判读结果。按敏感(S)、中介(I)、耐药(R)报告。 例如:抗菌药物丁胺卡那霉素(AMK),每张纸片含药量30微克,抑菌圈14mm为耐药,15-16mm为中介,17mm为敏感。2、质量控制质量控制:标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内,如果超出该范围,应为失控,而不发报告,应及时查找原因,予以纠正。 例如:抗菌药物丁胺卡
5、那霉素(AMK),每张纸片含药量30微克,金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在20-26mm之间。l思考题: 影响因素? 1、培养基的质量:双层抑菌圈的出现? 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素稀释法稀释法l微量稀释法l常量稀释法(试管稀释法)常量稀释法(试管稀释法)常量稀释法(试管稀释法)1、实验目的: 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓度(MIC)2、实验原理: 将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释,再加入定量的测试菌,经一定时间和温度培养后,无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此菌的MIC。定量的测试菌的制备定量的测试菌的制备l1、将金黄色葡萄球菌A
6、TCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物,调整浓度至0.5麦氏比浊管(相当于1.5108CFU/ml);或挑新鲜培养的单个菌落,在无菌生理盐水中研磨,校正其浓度至0.5麦氏比浊管。l2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍,即可使用。步骤和方法步骤和方法l将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度,加入定量测试菌。l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9(对照) 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 (ml) 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去 (80单位) 稀释的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 (ml) 37培养
7、16-18小时 l结果观察:l完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药对此菌的MIC。l此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC株和临床株的MIC。l结果举例:l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 (ml) 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去 (80单位) 金葡菌 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1结果 细菌生长 - - - - - + + + +青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照- l结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MICl影响因素?临床意义?