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1、第二章第二章 离心机的原理与应用离心机的原理与应用 离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的据物质颗粒的据物质颗粒的据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力沉降系数、质量、密度及浮力沉降系数、质量、密度及浮力沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不等因子的不等因子的不等因子的不同，而使物质分离的技术同，而使物质分离的技术同，而使物质分离的技术同，而使物质分离的技术 一、离心机的种类与用途一、离心机的种类与用途 离心机有多种多样。离心机有多
2、种多样。离心机有多种多样。离心机有多种多样。 按用途有按用途有按用途有按用途有分析用、制备用分析用、制备用分析用、制备用分析用、制备用及及及及分析分析分析分析- - - -制备两用制备两用制备两用制备两用之分；之分；之分；之分； 按结构特点则有按结构特点则有按结构特点则有按结构特点则有管式、吊篮式、转鼓式和碟式管式、吊篮式、转鼓式和碟式管式、吊篮式、转鼓式和碟式管式、吊篮式、转鼓式和碟式等多种；等多种；等多种；等多种； 按离心机转速的不同，可分为按离心机转速的不同，可分为按离心机转速的不同，可分为按离心机转速的不同，可分为常速常速常速常速( ( ( (低速低速低速低速) ) ) )、高速和超速
3、、高速和超速、高速和超速、高速和超速三种。三种。三种。三种。台式高、超速台式高、超速离心机离心机0.6-10万转万转/分分离心机离心机制备型制备型分析型分析型分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或地台式（或地面式）普通面式）普通离心机离心机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万转转/分分高速冰冻高速冰冻离心机离心机万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心分析性超速离心主要用于检测大主要用于检测大分子物质的沉降分子物质的沉降特征和结构等特征和结构等) 1 1常速离心机常速离心机 常速离心机又称为常速离心机又称
4、为常速离心机又称为常速离心机又称为低速离心机低速离心机低速离心机低速离心机。 其最大转速在其最大转速在其最大转速在其最大转速在6 6 6 6000 000 000 000 r r r rminminminmin以内，相对离心力以内，相对离心力以内，相对离心力以内，相对离心力( ( ( (RCF)RCF)RCF)RCF)在在在在1101101101104 4 4 4g g g g以下以下以下以下 主要用于主要用于主要用于主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，和粗结等固形物，和粗结等固形物，
5、和粗结等固形物，和粗结晶等晶等晶等晶等较大颗粒较大颗粒较大颗粒较大颗粒。 低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样，低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样，低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样，低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样，可根据需要选择使用。可根据需要选择使用。可根据需要选择使用。可根据需要选择使用。 高速离心机的转速为高速离心机的转速为1101104 42 25105104 4 r rminmin。相对相对离心力达离心力达1101104 41101105 5g g，主要用于分离各种主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器沉淀物、细胞碎
6、片和较大的细胞器等。等。为了防止高速离心过程中为了防止高速离心过程中温度升高温度升高而使酶等生物分子而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机装设了变性失活，有些高速离心机装设了冷冻装置冷冻装置，称，称高速高速冷冻离心机冷冻离心机。 2 2高速离心机高速离心机3 3超速离心机超速离心机超速离心机的转速达超速离心机的转速达2.5102.5104 48108104 4 r rminmin，最大相对最大相对离心力达离心力达5105105 5g g甚至更高一些。超速离心机的精密度相甚至更高一些。超速离心机的精密度相当高。当高。分离分离细胞器、病毒、蛋白质、核酸、多糖细胞器、病毒、蛋白质、核酸、多糖等等为
7、了防止样品液溅出，一般附有为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽离心管帽；为防止温度升高，均有为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制冷冻装置和温度控制系统；系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统真空系统。此外还有一系列此外还有一系列安全保护系统、制动系统及各种指示仪表安全保护系统、制动系统及各种指示仪表等。等。 二、离心分离方法的选择二、离心分离方法的选择 离心分离的方法可分为离心分离的方法可分为三类三类1 1差速离心差速离心采用不同的采用不同的离心速度和离心时间离心速度和离心时间，使沉降速度不同的，使沉降速度不同的颗粒分批分离颗粒分批分离的的方法，称为差速离
8、心。方法，称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。离较小的颗粒。如此多次离心，如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离使不同大小的颗粒分批分离。差速离心所得到的沉降物含有差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能获得较纯再离心若干次，才能获得较纯的分离产物。的分离产物。差速离心主要用于分离大小和差速离心主要用于分离大小
9、和密度密度差异较大的颗粒差异较大的颗粒。操作操作简简单方便单方便，但分离但分离效果较差效果较差。 举例： 沉淀沉淀(细胞膜细胞膜碎片、线粒体、碎片、线粒体、溶酶体溶酶体)已破碎的细胞已破碎的细胞500g,10 沉淀沉淀(细胞核细胞核)上清液上清液10 000g,10上清液上清液100 000g,3h 沉淀沉淀(核糖核蛋白体核糖核蛋白体) 上清液上清液(可溶性组分可溶性组分)2 2密度梯度离心密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的密度不同的组分得以分离组分得以分离的一种区带分离方法。的一种区带分离方法。密度梯度系统是在
10、溶剂中加入一定的密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质梯度介质制成的。制成的。梯度介质应有梯度介质应有足够大的溶解度足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组，以形成所需的密度，不与分离组分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。常用的有常用的有蔗糖、甘油蔗糖、甘油等。使用最多的是等。使用最多的是蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖系统，其梯度范围是：蔗糖浓度浓度5 56060，密度密度1.021.021.301.30g/cmg/cm3 3。密度梯度的制备可采用密度梯度的制备可采用梯度混合器梯度混合器，也可将不同浓度，也可将
11、不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，越靠管底，浓度越高，浓度越高，形成形成阶梯梯度阶梯梯度。离心前，把离心前，把样品样品小心地铺放在预先制备好的小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带不连续区带。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。在密度梯度离心过程中，在密度梯度离心过程中，区带的位置区带的位
12、置和和宽度宽度随随离心时间离心时间的不同而改的不同而改变。变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增增大离心力大离心力而而缩短离心时间缩短离心时间，可以减少区带扩宽，可以减少区带扩宽。 3 3等密度离心等密度离心 将将CsClCsCl2 2、CsSOCsSO4 4等介质等介质溶液与样品溶液混合，然后在选溶液与样品溶液混合，然后在选定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场中沉降形成中沉降形成密度梯度密度梯度样品中不同浮力密度的颗粒在各自的样品中不同浮力密度的颗粒在各
13、自的等密度点位置等密度点位置上形上形成区带。成区带。常用来分离提取常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒核酸、亚细胞器和质粒。前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。 应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度铯盐浓度和离心机转速及离心时间和离心机转速及离心时间。此外，铯盐
14、对铝合金转子有很此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性强的腐蚀性，故最，故最好使用好使用钛合金转子钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干，转子使用后要仔细清洗并干燥。燥。 三、离心条件的确定三、离心条件的确定 离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度梯度等以外等以外确定离心机的确定离心机的转速转速和离心和离心时间时间还要注意离心介质溶液的还要注意离心介质溶液的pHpH值和温度值和温度等条件。等条件。 1 1离心力离心力物质颗粒在离心场中所受到的物质颗粒在离心场中所受到的离心力
15、离心力( (Fc)Fc)的大小，决定于的大小，决定于颗粒的质量颗粒的质量( (m)m)和和离心加速度离心加速度( (c)c)：Fc=mcFc=mc离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径：离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径：c=c=2 2r r 式中式中：转子的转子的角速度角速度( (radrads)s)；r r：旋转半旋转半径径，即颗粒到旋转轴中心的距离，即颗粒到旋转轴中心的距离( (cm)cm)。若转速以惯用的每分钟转数若转速以惯用的每分钟转数( (r rmin)min)来表示，则来表示，则=2n/60=2n/60代入上式，得到：代入上式，得到：c =c =2 2r
16、=4r =42 2n n2 2r /3600r /3600式中式中 n n：转子每分钟转数转子每分钟转数( (r rmin)min)。在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数转数表示表示，如，如4000 4000 r rminmin。而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离相对离心力心力来表示。如：来表示。如：65 00065 000g g。相对离心力相对离心力是指颗粒所受的是指颗粒所受的离心力离心力与与地心引力地心引力( (重力重力) )之比。之比。即即: :RCF=Fc/Fg=4RCF=F
17、c/Fg=42 2n n2 2r r / /（3600980.63600980.6）gg 将有关数字代入上式，化简为：将有关数字代入上式，化简为： RCF=1.1210RCF=1.1210-5-5nn2 2rgrg式中式中 RCFRCF：相对离心力相对离心力( (g)g)；n n：转子每分钟转数转子每分钟转数( (r rmin)min)；r r：旋转半径旋转半径( (cm)cm)；g g：重力加速重力加速度，度，9809806 6 cmcms s2 2 转速与转速与RFCRFC的换算的换算：便于进行转速和相对离心力之间：便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在式的换算，人们在式的基础上制作了
18、三者关系的列的基础上制作了三者关系的列线计算图线计算图半径半径相对离心力相对离心力转速转速方法：三点一线，左对左，右对右方法：三点一线，左对左，右对右2 2、转子离心管及选择、转子离心管及选择 离心管离心管v玻璃离心管质虽硬、但脆，不能承受超离心的压力。玻璃离心管质虽硬、但脆，不能承受超离心的压力。v超离心机离心管：塑料管及不锈钢管。超离心机离心管：塑料管及不锈钢管。v注意离心管的平衡注意离心管的平衡v离离心心时时样样品品一一般般应应装装满满离离心心管管，否否则则将将可可能能因因有有气气泡泡而而使使管管的的外外部部受受压压不不均均，造造成成离离心心管管破破裂裂，使使转转子子不不平平衡衡产生事故
19、产生事故 离心管帽离心管帽v超超离离心心机机所所用用离离心心管管一一般般都都附附有有管管帽帽，离离心心时时离离心心管管需需戴上管帽。戴上管帽。3 3、转子及选择、转子及选择 角角转转子子（TypeType）、水水平平转转子子（swsw）、垂垂直直转转子子（v v）、区带转子（区带转子（c c）等等 角转子角转子指离心管腔与转轴成一定倾角的转子指离心管腔与转轴成一定倾角的转子角度越大，沉降越结实，分离效果越好角度越大，沉降越结实，分离效果越好角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向颗粒在角转子
20、中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一侧离心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一侧会出现颗粒沉积，称为会出现颗粒沉积，称为“壁效应壁效应”。最适合差速离心，强度大、方便但加速或减速最适合差速离心，强度大、方便但加速或减速时，对样品有搅动。时，对样品有搅动。 水平转子水平转子v旋旋转转时时随随着着转转子子的的转转动动从从垂垂直直悬悬吊吊上上升升到到水水平平位位置置（约（约200200800rpm800rpm）时。）时。v颗颗粒粒在在水水平平转转子子中中的的沉沉降降是沿管子方向的，是沿管子方向的，梯度离心中颗粒沉降区梯度离心中颗粒沉降区带带横过离心管横过离心管，离心后，离
21、心后区带不必重新定位区带不必重新定位但只有处于样品区带中但只有处于样品区带中心的颗粒才直接向管底心的颗粒才直接向管底沉降，沉降，其它颗粒则撞向壁的两其它颗粒则撞向壁的两侧，产生侧，产生“壁效应壁效应”，但受振动和变速搅乱后但受振动和变速搅乱后对流现象小得多。对流现象小得多。 四、四、 离心机的使用离心机的使用 离心法是分离沉淀的一种方法。离心法是分离沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为因液体在沉淀的上部，故称
22、清亮的液体部分为上清液。上清液。 （一）电动离心机的使用方法：（一）电动离心机的使用方法：1.1.将欲离心的液体，置于将欲离心的液体，置于离心管或小试管离心管或小试管内。并检查离内。并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。2.2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有垫，有无玻璃碎片或漏孔无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。应该用蜡封住）。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套
23、管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与套管之间滴加水来套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡调节两边的重量使之达到平衡。 3.3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。对应的两插孔内。盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。心机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止
24、转动后（不可人为制动），取出离心管。离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。EppendorfEppendorf管放置、重量的平衡管放置、重量的平衡离心机（二）离心机使用要点（二）离心机使用要点工作转速在允许范围内工作转速在允许范围内工作转速在允许范围内工作转速在允许范围内严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，对称严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，对称严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，对称严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，对称放置。放置。放置。放置。加盖，防止离心管飞出伤人。加盖，防止离心管飞出伤人。加盖，防止离心管飞出伤人。加盖，防止离心管飞出伤人。发现异常立即关机发现
25、异常立即关机发现异常立即关机发现异常立即关机每次离心后要想清楚是留什么、弃什么。每次离心后要想清楚是留什么、弃什么。每次离心后要想清楚是留什么、弃什么。每次离心后要想清楚是留什么、弃什么。 J-30IJ-30I高高速速冷冷冻冻离离心心机机实例1：用用 途途1. 1. 细菌，蛋白沉淀细菌，蛋白沉淀 - - 核酸提取核酸提取 - - 细胞细胞/ /亚细胞组份分离。亚细胞组份分离。2. 2. 动、植物病毒分离、血液血清提取及动、植物病毒分离、血液血清提取及溶液中大、小颗粒不同组份的分离。溶液中大、小颗粒不同组份的分离。、操作步骤操作步骤1 1、打开离心机盖打开离心机盖, ,选选择容量适合的转子，将择容量适合的转子，将带样品离心管放入转子带样品离心管放入转子内（样品一定要平衡好）内（样品一定要平衡好），再将转子放入离心室，再将转子放入离心室内固定好转子。内固定好转子。2 2、关关好好离离心心机机盖盖，设设定定离离心心机机转转子子型型号号、转转速速、离心时间、温度、启动运转。离心时间、温度、启动运转。3 3、离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心离心时间到待转速降至零，打开离心机盖将样品（离心管）取出，离心结束。管）取出，离心结束。
