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1、实验六实验六质粒质粒DNA的少量提取及鉴定的少量提取及鉴定天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系辛灵彪1相关知识目的要求目的要求1.了解了解质粒的概念。粒的概念。2.熟悉提取熟悉提取质粒的基本原理。粒的基本原理。3.掌握碱掌握碱变性法提取性法提取质粒粒DNA的方法。的方法。2相关知识a.a.什么是质粒（什么是质粒（plasmidplasmid）？）？b.b.质粒的本质是什么？质粒的本质是什么？c.c.质粒有哪些构型？质粒有哪些构型？c.c.质粒有哪些特点？质粒有哪些特点？d.d.质粒的用途有哪些？质粒的用途有哪些？31.1.关于质粒的概念关于质粒的概念3相关知识质粒的定义质粒的定义 质粒
2、是细菌细胞内一种自我复制的质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链环状双链DNADNA分分子子，能稳定地，能稳定地独立于染色体外独立于染色体外，并传递到子代，一般不整，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋共价闭环的超螺旋形式存在。形式存在。 44相关知识(1)超螺旋超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)(2)线状线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状如果两条链均断开，即为线状DNA。（3）开环）开环DNA (open circular DNA, OC DNA
3、) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。状分子。质粒的三种构型质粒的三种构型55相关知识质粒质粒DNADNA的一般特性：的一般特性：(1)宿主菌染色体宿主菌染色体DNA通常比质粒通常比质粒DNA要大得多要大得多(2)它是它是双链闭合环状双链闭合环状DNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。(3)质粒是细菌内的共生型遗传因子质粒是细菌内的共生型遗传因子,有有相对独立性相对独立性。(4)它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表
4、型表型：菌毛、抗药性等菌毛、抗药性等 6相关知识分离纯化质粒分离纯化质粒DNADNA的主要步骤的主要步骤(1)(1)培养细菌使质粒扩增（培养细菌使质粒扩增（DNADNA的扩增与选择）的扩增与选择）(2)(2)细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 v收集方法：高速离心的方法vv裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法碱变性法碱变性法碱变性法、沸水沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)(
5、3)质粒质粒DNADNA的纯化的纯化 v 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA相对较相对较 小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。 2 2 提取大肠杆菌质粒提取大肠杆菌质粒DNADNA的方法和原则的方法和原则7相关知识原理示意图原理示意图8相关知识实验原理：实验原理：高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段
6、中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用除去残留的蛋白质，并用除去残留的蛋白质9相关知识试剂盒主要试剂及作用试剂盒主要试剂及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisHClCl组
7、成组成. .( (保护、缓冲保护、缓冲) )葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的 机械机械 剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒. (保护作用保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止防止DNA酶对酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisHCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作范围（缓冲作用）用）1010相关知识 溶溶液液IIII：由由SDSSDS（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠）与与 NaOH NaOH 组组成
8、成( (裂裂解解、变变性性) ) SDSSDS是离子型表面活性剂是离子型表面活性剂,其主要作用是：溶解细胞膜上的脂其主要作用是：溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白质变性而沉淀下来。质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行。接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行。 NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNADNA分子变性（分子变性（DNADNA变变性作用）性作用
9、）可瞬间溶解细胞及细菌。可瞬间溶解细胞及细菌。11试剂盒主要试剂及作用试剂盒主要试剂及作用11相关知识溶液溶液IIIIII：pH4.8KAC(KAC(乙酸钾乙酸钾) ) 高盐溶液，高盐溶液，pHpH调至中性调至中性 ( (复性，分离复性，分离) )中和溶液中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA DNA 变性而发生缠绕，并变性而发生缠绕，并使质粒使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS 复合物缠绕成大分子而
10、与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。试剂盒主要试剂及作用试剂盒主要试剂及作用12相关知识吸附株纯化质粒吸附株纯化质粒DNADNA13相关知识实验步骤实验步骤1.1.收集收集4.5ml4.5ml菌液于菌液于EPEP管，每次管，每次12000g12000g30s30s2.2.弃上清，加含弃上清，加含Rnase ARnase A溶液溶液I I 250 250 l l ，剧烈振荡剧烈振荡3.3.加加250250 l l 溶液溶液IIII，快速颠倒数次，快速颠倒数次4.4.加加350350 l l 溶液溶液IIIIII，温和振荡，温和振荡10s10s，12000g1200
11、0g10min10min5.5.转移转移500500 l l上清到吸附株，上清到吸附株，12000g12000g1min1min6.6.吸附柱中加吸附柱中加700l700l漂洗液，漂洗液，1200012000g g1min1min，弃废液，弃废液，将吸附柱放入收集管中。将吸附柱放入收集管中。7.7.向吸附柱中加入向吸附柱中加入500l500l漂洗液，漂洗液，1200012000g g1min1min，弃废，弃废液，将吸附柱放入收集管中。液，将吸附柱放入收集管中。 12000g 12000g2min2min，8.8.将吸附柱敞口置于室温放置将吸附柱敞口置于室温放置2min2min，挥发残余的乙醇
12、。，挥发残余的乙醇。9.9.将吸附柱放入一个将吸附柱放入一个干净的干净的EPEP管管中，向吸附膜中，向吸附膜中央悬空中央悬空滴加滴加50l50l经经6565水浴预热的洗脱液，室温放置水浴预热的洗脱液，室温放置2min2min，1200012000g g1min1min。10.10.将此质粒将此质粒DNADNA溶液置于溶液置于-20-20保存。保存。14相关知识 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，
13、目前多用琼脂糖为电泳支持琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。物进行平板电泳。物进行平板电泳。物进行平板电泳。 在碱性环境下，在碱性环境下，在碱性环境下，在碱性环境下，DNADNADNADNA的磷酸基团解离，使的磷酸基团解离，使的磷酸基团解离，使的磷酸基团解离，使DNADNADNADNA带带带带负电荷负电荷负电荷负电荷，在，在，在，在电场中向电场中向电场中向电场中向正极方向泳动正极方向泳动正极方向泳动正极方向泳动，因各种因各种因各种因各种DNADNADNADNA
14、分子的分子的分子的分子的电荷数、分子量、电荷数、分子量、电荷数、分子量、电荷数、分子量、构象不同构象不同构象不同构象不同，在，在，在，在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 153、质粒、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定的琼脂糖凝胶电泳鉴定15相关知识实验材料及试剂实验材料及试剂 6xloading buffer6
15、xloading buffer6xloading buffer6xloading buffer：主要成分甘油、电泳指示剂和主要成分甘油、电泳指示剂和主要成分甘油、电泳指示剂和主要成分甘油、电泳指示剂和tris.tris.tris.tris.甘油主要负责沉降甘油主要负责沉降甘油主要负责沉降甘油主要负责沉降DNADNADNADNA，避免飞样。指示剂肉眼可见，确，避免飞样。指示剂肉眼可见，确，避免飞样。指示剂肉眼可见，确，避免飞样。指示剂肉眼可见，确定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯晴定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯晴定电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯晴定
16、电泳状态，一般指示剂两种，溴酚蓝呈蓝紫色，甲苯晴呈蓝色。呈蓝色。呈蓝色。呈蓝色。溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（EBEBEBEB）：）：）：）：荧光染料，可与荧光染料，可与荧光染料，可与荧光染料，可与DNADNADNADNA结合，在紫外光照结合，在紫外光照结合，在紫外光照结合，在紫外光照射下呈红橙色荧光。有致癌性。射下呈红橙色荧光。有致癌性。射下呈红橙色荧光。有致癌性。射下呈红橙色荧光。有致癌性。TBE:TBE:TBE:TBE:TrisTrisTrisTris，BoricBoricBoricBoricacid,EDTAacid,EDTAacid,EDTAacid,EDTA。核酸电泳的经
17、典缓冲液。核酸电泳的经典缓冲液。核酸电泳的经典缓冲液。核酸电泳的经典缓冲液。琼脂糖：琼脂糖：琼脂糖：琼脂糖：用用用用1xTBE1xTBE1xTBE1xTBE配置琼脂糖凝胶。配置琼脂糖凝胶。配置琼脂糖凝胶。配置琼脂糖凝胶。DNA markerDNA markerDNA markerDNA marker16相关知识DNA MarkerDNA MarkerDNA MarkerDNA Marker：是分子量不同的是分子量不同的是分子量不同的是分子量不同的DNADNADNADNA片段，主要用途就是片段，主要用途就是片段，主要用途就是片段，主要用途就是DNADNADNADNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来
18、检测琼脂糖凝胶是否分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，以及粗略判断样品的分子量。有问题，以及粗略判断样品的分子量。有问题，以及粗略判断样品的分子量。有问题，以及粗略判断样品的分子量。 DNA Marker DNA Marker DNA Marker DNA Marker应选择在目标片段大小附近应选择在目标片段大小附近应选择在目标片段大小附近应选择在目标片段大小附近ladderladderladderladder较密较密较密较密集的集的集的集的markermarkermarkerm
19、arker，这样对目标片段大小的估计较准确。，这样对目标片段大小的估计较准确。，这样对目标片段大小的估计较准确。，这样对目标片段大小的估计较准确。17相关知识影响影响DNADNA在凝胶中迁移速率的因素在凝胶中迁移速率的因素 v1 DNA分子的大小v2 构象v3 凝胶浓度v4 电压v5 缓冲液18相关知识OC 型型质质粒粒DNA点点样样孔孔细细菌菌基基因因组组DNAL型型质质粒粒DNASC 质质粒粒DNA细细菌菌RNA质粒电泳图谱质粒电泳图谱19相关知识实验步骤实验步骤 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备（封板、制备1%凝胶待温度降至凝胶待温度降至60-70时加入时加入EB（0.5
20、/ml）、倒胶、插梳、凝固后拔梳）、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样倒缓冲液，加样（取质粒取质粒DNA样品液样品液5l+1l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀）电泳（电泳（100V 20min左右，左右，5V/cm）紫外灯下检测紫外灯下检测20相关知识移液器的使用移液器的使用将微量液体从一个容器转移到另一个容器的计量器具，将微量液体从一个容器转移到另一个容器的计量器具，我们称之为移液器。我们称之为移液器。21相关知识移液器的使用移液器的使用移液循环移液循环安装枪头安装枪头设定容量设定容量吸液吸液放液放液卸去枪头卸去枪头22相关知识移液器的使用移液器的使用安装枪头安装枪头23相关知识移液器的
21、使用移液器的使用原点第一停点第二停点勿在液体中按至第一停点枪头勿伸入液面太深管壁加入排尽液体复位后，卸去枪头24相关知识移液器的使用移液器的使用卸去枪头卸去枪头无需用手接触枪头无需用手接触枪头25相关知识 1、加样枪正确使用；、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型；、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头；、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干；、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀；、转移上清时不要吸到沉淀； 7、使用前使用前请先先检查溶液溶液和溶液和溶液是否出是否出现混混浊； 8、
22、溶液溶液、溶液、溶液和漂洗液使用后和漂洗液使用后应立即立即拧紧盖子。盖子。 9、洗脱液不少于洗脱液不少于 50l，-20保存，以防保存，以防 DNA 降解。降解。质粒提取注意事项：质粒提取注意事项：26相关知识1.凝胶浓度选择根据样品凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所分子大小而定，所 以电泳前应对以电泳前应对DNA片段大小有粗略估计。片段大小有粗略估计。2.加加EB时，胶的温度不要太高。高温会导致时，胶的温度不要太高。高温会导致EB挥挥 发，发，EB有致癌性。倒胶时避免产生气泡。有致癌性。倒胶时避免产生气泡。3.缓冲液要完全没过点样孔。点样孔不能有气泡。缓冲液要完全没过点样孔。点样孔不
23、能有气泡。4.紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。琼脂糖电泳注意事项：琼脂糖电泳注意事项：27相关知识质粒的定义质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链环状双链DNADNA分分子子，能稳定地，能稳定地独立于染色体外独立于染色体外，并传递到子代，一般不整，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋共价闭环的超螺旋形式存在。形式存在。 2828相关知识29相关知识30相关知识基因克隆示意图基因克隆示意图分、切分、切接接转转筛筛实现基因克隆所实现基
24、因克隆所采用的方法及相采用的方法及相关的工作统称为关的工作统称为重组重组DNA技术，技术，又称基因工程。又称基因工程。31相关知识32相关知识2 BamHI 2 BamHI 、HindHind酶切质粒及鉴定酶切质粒及鉴定2.1 2.1 实验原理：实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别利用限制性内切酶特异的识别DNADNA特异的特异的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,产生一定长度的产生一定长度的DNADNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒别目的基因（重组质粒DNADNA）3333相关知识实验七实验七质粒质粒DNA质
25、粒质粒DNA的的浓度测定与双酶切鉴定浓度测定与双酶切鉴定天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系辛灵彪34相关知识1.熟悉熟悉DNA的的浓度度测定方法。定方法。2.了解限制性核酸内切了解限制性核酸内切酶酶在基因工程中的在基因工程中的应用。用。3.熟悉利用限制性核酸内切熟悉利用限制性核酸内切酶酶切割切割质粒的方法。粒的方法。目的要求目的要求35相关知识实验原理实验原理1.1.质粒质粒DNADNA浓度测定浓度测定36相关知识1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸
26、样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260的应用的应用37相关知识DNA样品的浓度（g/l）= OD260稀释倍数50/1000OD260/OD280=1.7-1.9打开紫外分光光度计，设定波长260nm,切换至紫外。1.1.质粒质粒DNADNA浓度测定方法浓度测定方法200倍稀释样品，10l质粒加水稀释至2000l洗净比色皿，加入待测样品。记录260nm的OD值。设定波长280nm，记录OD值。计算样品浓度和纯度38相关知识限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义：定义：能在特异位点（酶切位点）上
27、催化双链能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNADNA分分子的断裂子的断裂, ,产生相应的限制性产生相应的限制性DNADNA片段。片段。 切割不同来源的切割不同来源的DNADNA分子将产生特征性限制性酶分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀分子手术刀”）。）。 主要存在于细菌体内。主要存在于细菌体内。392.2.质粒质粒DNADNA双酶切鉴定双酶切鉴定39相关知识第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第
28、四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 限制性核酸内切酶命名限制性核酸内切酶命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶40相关知识 限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式41相关知识（1）20l酶切体系：取两支1.5ml的Ep管，标号，按下表加入试剂，实验组对照照组1010酶酶解反解反应液液2 2l2 2l质粒粒DNAup to 1up to 1gup to 1up to 1gXhoIXhoI1 1l0 0lHindHind1 1l0 0lddH
29、ddH2 2O O至至20l至至20l（2）加样后，小心混匀，置于37水浴中，酶解15min。（3）终止酶解反应：80反应5min。（4）琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。实验步骤实验步骤42相关知识实验步骤实验步骤 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备（封板、制备1%凝胶待温度降至凝胶待温度降至60-70时加入时加入EB（0.5/ml）、倒胶、插梳、凝固后拔梳）、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样倒缓冲液，加样（取质粒取质粒DNA样品液样品液5l+1l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀）电泳（电泳（100V 20min左右，左右，5V/cm）紫外灯下检测紫外灯下检测43相关知识44相
30、关知识质粒酶切电泳图谱质粒酶切电泳图谱质质粒粒DNA点点样样孔孔酶酶切切产产物物5kb3kb2kb1kb750bp500bp250bp100bp对对照照组组 实实验验组组 DNA marker45相关知识酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端；2. 内切酶的用量：内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。避免星火活性。3. 操作条件：操作条件：反应体系配置应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染污染。4. DNA. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。46相关知识47相关知识
