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1、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦丁新伦130672064061【一】背景知识背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳琼脂糖电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳2【二二】实验目的实验目的n学习琼脂糖凝胶电泳分离学习琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA的原理和方法的原理和方法n检测碱裂解法提取质粒的结果检测碱裂解法提取质粒的结果n检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果n检测检测PCRPCR法鉴定重组质粒的结果法鉴定重组质粒的结果3【三三】实验原理实验原理（1）
2、某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的以分离大小不同的DNA或或RNA分子。分子。（2 2）琼脂糖是一种）琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，可以形成具有刚，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决
3、定于性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。4琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。分子
4、大小来确定。5（3 3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。下发射荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复复合物，其荧光强度与合物，其荧光强度与DNADNA的含量成正比。据的含量成正比。据此可判断此可判断DNADNA分子量大小和粗略估计样品分子量大小和粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 6琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围
5、分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 27【四】仪器、材料与试剂质粒样品、酶切样品和质粒样品、酶切样品和PCRPCR样品。样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统凝胶电泳系统和电泳图像分析系统( (凝胶成凝胶成像系统像系统) )等。等。 琼脂糖、琼脂糖、 1X1XTBE电泳缓冲液电泳缓冲液、溴化乙锭溴化乙锭、 6X6X载样缓冲液载样缓冲液 （ 6X loading buff
6、er6X loading buffer）和）和DNADNA分子量标准（分子量标准（ Lambda DNA / Lambda DNA / EcoEcoRI + RI + HinHindIII Marker dIII Marker ）等。）等。8凝胶电泳系统凝胶电泳系统DYY-6C型型双稳定时电泳仪电源（北京六一）双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W美国美国Bio-rad伯乐伯乐小型水平电泳槽小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell9凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统10Lambda DNA / Lambda DNA /
7、 EcoEcoRI + RI + HinHindIII dIII MarkerMarker（FermentsFerments）一个已知分子质量的一个已知分子质量的DNA样品做最对照，样品做最对照，用来确定待测样品的用来确定待测样品的相对分子质量。相对分子质量。11常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 缓冲液缓冲液缓冲容量缓冲容量迁移速度迁移速度分辨率分辨率用途用途TAETAE最低最低最快最快( (高高1010) )高分子量高分子量高高高度复杂高度复杂DNA混合混合物；超螺物；超螺旋旋DNATBETBE很高很高较慢较慢低分子量低分子量高高价格昂价格昂贵，不贵，不常用常用TPETPE12电泳指示剂溴酚兰在
8、碱性液体中呈紫兰色，一电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。 作用：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔均匀沉入加样孔内。内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液13溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭（ 3 3，8-8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲啶溴苯基菲啶溴盐盐EthidiumEthidiumBromideBromide
9、，EBEB），EBEB染色（染色（EBEB可很好可很好地掺入到双链地掺入到双链DNADNA中），在紫外光下会发出橙红色中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对的荧光，用于对DNADNA进行染色和观察。进行染色和观察。用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（）。光（）。短波紫外光（）观察效果较好，但对短波紫外光（）观察效果较好，但对DNADNA的破环很大。的破环很大。长波紫外光（）：回收。长波紫外光（）：回收。141516EBEB染染料料优优点点：染染色色操操作作简简便便，快快速速，室室温温下下15-2015-20minmin；不不会会使使核核酸
10、酸断断裂裂；灵灵敏敏度度高高，1010ngng或或更更少少的的DNADNA即即可可检检出出；可可以以加加到到样样品品中或胶中。中或胶中。EBEB是是诱诱变变剂剂，使使用用时时一一定定要要戴戴手手套套。 EBEB废废液要经过处理才能丢弃。液要经过处理才能丢弃。SYBR:SYBR:新新型型低低毒毒，高高灵灵敏敏度度染染料料，加加入入样样品品中，价格较昂贵。中，价格较昂贵。17【五】实验步骤1.1.制备琼脂糖凝胶（制备琼脂糖凝胶（1%1%）2.2.制备凝胶板制备凝胶板3.3.加样加样4.4.电泳电泳 5.5.染色染色6.6.结果观察结果观察 18（1 1）制备凝胶和胶板）制备凝胶和胶板： 4545m
11、l(1TBE)+0.4gml(1TBE)+0.4g琼脂糖（琼脂糖（ 三角三角瓶瓶 ），）， 煮胶，溶解，冷却至煮胶，溶解，冷却至6060( (不烫手不烫手) )，倒板，倒板(4-6mm)(4-6mm)，室温下充分凝固，室温下充分凝固，竖直拔下梳子竖直拔下梳子 。胶板设计（胶板设计（4444人）：人）：每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板每8孔胶板（2人X3样品+ 1marker ），2胶板19（2 2 ）加样加样： 5l5l质粒质粒DNA+1l loading bufferDNA+1l loading buffer ，混匀混匀 15lPCR 15lPCR产物产物+3l loading buffer+3l loading buffer，混匀，混匀10l10l酶切产物酶切产物+2l loading buffer+2l loading buffer，混匀，混匀 6lDNAMark 6lDNAMark （每板胶加一孔）（每板胶加一孔）（3 3 ）电泳）电泳：电压电压3-5V/cm3-5V/cm，约，约80-90V80-90V，注意电极方向，注意电极方向（4 4 ）染色）染色：EBEB染色约染色约15min15min（5 5 ）观察：紫外透射分析仪下观察。）观察：紫外透射分析仪下观察。202122232425【六】实验结果26
