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1、HPLC分离条件的优化步骤以及定分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择量计算公式的选择分离条件的优化分离条件的优化定量计算公式的选择定量计算公式的选择HPLCHPLC分离优化基本概念分离优化基本概念主要内容主要内容确定分离模式与色谱柱确定分离模式与色谱柱1. HPLC分离优化基本概念分离优化基本概念一、分离度与基本色谱分离方程式一、分离度与基本色谱分离方程式1、分离度、分离度柱的总分离效能指标柱的总分离效能指标柱效参数：柱效参数：标准偏差准偏差( ( ) ): : 即即0.6070.607倍峰高倍峰高处处色色谱谱峰峰宽宽度的一半度的一半半峰半峰宽(W1/2): (W1/2): 色色谱峰高一半
2、峰高一半处的的宽度度W1/2 W1/2 =2.354=2.354峰底峰底宽(W)(W)：W=4W=41. HPLC分离优化基本概念分离优化基本概念R=1.5R=1.5，色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开；，色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开；R=1.0R=1.0，表明两个相邻组分只有，表明两个相邻组分只有94%94%分离开。分离开。( (最低指最低指标）标）分离度表达式：分离度表达式： R=n1/2/4(-1)/k2 /(1+k2 )R受热力学因素受热力学因素容量因子容量因子k 和选择性系数和选择性系数（ = k2 / k1 ）和动力学因素（理论塔板数和动力学因素（理论塔板数n）两个方面控
3、）两个方面控制。制。若若相邻两峰的峰底宽近似相等相邻两峰的峰底宽近似相等，令令W W2=W1=2=W1=W W ，引入，引入相相对对保留保留值值和塔板数，和塔板数，分离度公式演分离度公式演变为下式：下式：柱效柱效柱效柱效项项柱柱柱柱选择项选择项柱容量柱容量柱容量柱容量项项1. HPLC分离优化基本概念分离优化基本概念2、色谱分离基本方程式、色谱分离基本方程式2.12.1、分离模式的、分离模式的选择2.确定分离模式与色谱柱确定分离模式与色谱柱2.22.2色谱柱的选择色谱柱的选择2.确定分离模式与色谱柱确定分离模式与色谱柱 首选首选C18/C8C18/C8：以：以1515cmcm为佳，可解决为佳，
4、可解决8080的样的样品分析，柱效应大于品分析，柱效应大于5000050000。 特殊样品用特定的柱子特殊样品用特定的柱子 不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。同柱子比例会不一样。 不同色谱柱需合适的不同色谱柱需合适的pHpH范围，一般在范围，一般在2.5-7.52.5-7.5之间，有的色谱柱比较耐碱，之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasilkromasil可以到可以到1010，而杂化，而杂化xterraxterra在在1 112,12,XDBXDB在在pH3-11.pH3-11.3.1 3.1 容量因子和死时间的测量容量因子和死时
5、间的测量 在在HPLC分析中，容量因子分析中，容量因子k是一个非常重要的是一个非常重要的参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。分离的选择性都发挥着重要的作用。 k=t Rt M t R = t R - t M 在在HPLC分析中，死时间表示了一个在高效液分析中，死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。3.分离条件的优化分离条件的优化1.由色谱柱的结构参数进行计算由色谱柱的结构参数进行计算 t M = Lr2 T / F式中，式中，L为柱长，为柱长，cm；
6、r为柱内径半径，为柱内径半径，cm；F为为流动相体积流速，流动相体积流速，cm3/s； T 为总孔率，对全多孔为总孔率，对全多孔固定相为固定相为0.84，对化学键和固定相、离子交换剂为，对化学键和固定相、离子交换剂为0.75，对薄壳型固定相为，对薄壳型固定相为0.42。死时间死时间t M的测量比较困难，有以下几种方法：的测量比较困难，有以下几种方法：3.分离条件的优化分离条件的优化2.由色谱柱的操作参数进行计算由色谱柱的操作参数进行计算 t M =L2/ pd p2式中，式中，为阻抗因子；为阻抗因子；为流动相的动力黏度；为流动相的动力黏度；L为柱长；为柱长； p为柱压力降；为柱压力降；d p为
7、固定相粒径为固定相粒径3.依据经验公式计算依据经验公式计算当当dc/dp10 时，可按下述公式计算时，可按下述公式计算 t M： t M =L / u对全多孔固定相全多孔固定相 u=1.5F/dc2对非多孔固定相非多孔固定相 u=3F/dc23.分离条件的优化分离条件的优化4.液固色谱死时间液固色谱死时间用用RID（折光指数检测器）检测：若以正己烷与（折光指数检测器）检测：若以正己烷与极性改性剂作流动相，可以正戊烷作探针测死时极性改性剂作流动相，可以正戊烷作探针测死时间。间。用用UVD（紫外吸收检测器）检测：可以苯、四氯（紫外吸收检测器）检测：可以苯、四氯乙烯或乙烯或KNO3水溶液作探针测死时
8、间水溶液作探针测死时间3.分离条件的优化分离条件的优化5.液液色谱死时间液液色谱死时间用用RID检测：可以重水（检测：可以重水（D2O）、重氢甲醇）、重氢甲醇（CD3OH）作探针测死时间。）作探针测死时间。用用UVD检测：反相可用检测：反相可用NaCl、NaNO3、HNO3、HClO3、苯甲酸、苦味酸、尿嘧啶水溶液作探针测、苯甲酸、苦味酸、尿嘧啶水溶液作探针测死时间，测量误差较大。正相可用四氯乙烯、四氟死时间，测量误差较大。正相可用四氯乙烯、四氟乙烯作探针测死时间。乙烯作探针测死时间。3.分离条件的优化分离条件的优化3.2 3.2 色谱柱操作参数的选择色谱柱操作参数的选择色谱柱操作参数：柱长色
9、谱柱操作参数：柱长L L、柱内径、柱内径、柱内填充固、柱内填充固定相的粒度定相的粒度d d p p、柱、柱压力降力降p p和对应于每米柱长的和对应于每米柱长的理论塔板数理论塔板数n n表示的柱效。表示的柱效。分析型色谱柱，选择操作参数的一般原则如下：分析型色谱柱，选择操作参数的一般原则如下：色谱柱长色谱柱长L 10L 1025cm25cm；柱内径；柱内径 （直径）（直径） 4 46mm6mm；固定相的粒度；固定相的粒度d d p p 5 51010mm；柱压力降柱压力降p p 5 514MPa14MPa；理论塔板数；理论塔板数 n n （2 25 5）10 10 3 3（2 21010） 10
10、 10 4 4块块/m/m3.分离条件的优化分离条件的优化3.3 3.3 样品组分保留值和容量因子的选择样品组分保留值和容量因子的选择 选择好操作参数后，通常希望完成一个简单选择好操作参数后，通常希望完成一个简单样品的分析时间控制在样品的分析时间控制在101030min30min之内，若为含多之内，若为含多组分的复杂样品，分析时间控制在组分的复杂样品，分析时间控制在60min60min以内。以内。 保留时间和容量因子由色谱过程的热力学因保留时间和容量因子由色谱过程的热力学因素控制，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗素控制，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。脱来进行调节。 若使用恒
11、定组成流动相洗脱，与组分保留时若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间对应的容量因子间对应的容量因子kk应保持应保持110110之间，以求获得之间，以求获得满意的分析结果。满意的分析结果。 3.分离条件的优化分离条件的优化 对组成复杂、由具有宽范围对组成复杂、由具有宽范围kk值组分构成的值组分构成的混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常能将组分的能将组分的kk值减小至原来的值减小至原来的1/101/101/1001/100，从而，从而缩短了分析时间。）缩短了
12、分析时间。）3.分离条件的优化分离条件的优化3.4 3.4 相邻组分的选择性系数和分离度的选择相邻组分的选择性系数和分离度的选择 为达到某一确定分离度，选择性系数的优化十分为达到某一确定分离度，选择性系数的优化十分重要，对预期柱效重要，对预期柱效10 10 3 3 10 10 5 5块块/m/m理论塔板的色谱理论塔板的色谱柱，若相邻组分柱，若相邻组分k k在在1 11010，且，且1.051.10，则易，则易达到达到多组分优化分离的最低指标（多组分优化分离的最低指标（ R=1.0R=1.0 ） 选定一种高效液相色谱方法时，很难将各组分间选定一种高效液相色谱方法时，很难将各组分间的分离度都调至最
13、佳，只能使少数几对难分离物质对的分离度都调至最佳，只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持的分离度至少保持R=1.0R=1.0。 R R1.01.0，仅呈半峰处分离，则应通过改变流动相，仅呈半峰处分离，则应通过改变流动相组成或改变流动相流速，调节分离度，尽可能使组成或改变流动相流速，调节分离度，尽可能使R=1.0R=1.0，才能满足准确定量分析的要求。，才能满足准确定量分析的要求。3.分离条件的优化分离条件的优化3.5 3.5 流动相的选择流动相的选择3.5.1流动相流动相pH的选择：的选择： 反相色反相色谱法分离弱酸（法分离弱酸（3pKa73pKa7）或弱碱）或弱碱（7pKa87pKa8）
14、样品品调节流流动相的相的pHpH值： 抑制抑制样品品组分的解离分的解离 增加增加组分在固定相上的保留分在固定相上的保留 改善峰形改善峰形 ，减，减轻或消除峰拖尾或消除峰拖尾现象象 3.5.2 流动相调整的三原则流动相调整的三原则（1）由强到弱）由强到弱 （2）三倍规则）三倍规则 （3）粗调转微调）粗调转微调3.5.3 流动相流速的选择流动相流速的选择对内径为对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为，对于内径为4.0mm柱，流速选择柱，流速选择0.8mlmin为佳。为佳。 3.分离条件的优化分离条件的优化3.分离条件的优化分离条件的优化3.5.4 流
15、动相的洗脱方式选择流动相的洗脱方式选择(一一)恒组成溶剂洗脱恒组成溶剂洗脱: 优点是方法简便、柱易再生，但优点是方法简便、柱易再生，但对于成分复杂的混合物，往往不能满足性质相差较大对于成分复杂的混合物，往往不能满足性质相差较大的组分的分离此时需用梯度洗脱。的组分的分离此时需用梯度洗脱。(二二)梯度洗脱：在同一分析周期内按梯度洗脱：在同一分析周期内按定程度不断改定程度不断改变流动相的浓度配比，从而使每个组分都在适宜的条变流动相的浓度配比，从而使每个组分都在适宜的条件下获得分离的一种洗脱方法。件下获得分离的一种洗脱方法。适用对象：组分较多、性质差别较大的复杂混合物适用对象：组分较多、性质差别较大的
16、复杂混合物优点：优点：缩短分析周期；缩短分析周期； 提高分离效能；改善峰形，提高分离效能；改善峰形，减少拖尾减少拖尾 ；使峰变锐，能检测出微量组分，因而使峰变锐，能检测出微量组分，因而提高检测灵敏度提高检测灵敏度4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择定量分析方法归一化法标准曲线法内标法标准加入法4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择 把所有岀峰的组分含量之和按把所有岀峰的组分含量之和按100%计的定量方计的定量方法，称归一化法。法，称归一化法。 适用范围：样品中所有组分均能流出色谱柱，并适用范围：样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上产生信号。主要应用于在检测器上产生信号。主要应用于G
17、C定量测定，在定量测定，在HPLC中很少使用。中很少使用。 i = i Ai / i Ai 100%式中，式中，Ai组分组分i的峰面积；的峰面积； ii组分的质量校正因子组分的质量校正因子一、归一化法一、归一化法4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择 在在HPLC中比较常用，是一种简便、快速的绝对中比较常用，是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法是相对定量方法）定量方法（归一化法是相对定量方法） 测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度，准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度，也可通过下式计算
18、也可通过下式计算 pi / % = f i / A i(h i)式中，式中，A i(h i) i组分的峰面积（峰高）组分的峰面积（峰高） f ii组分标准工作曲线的斜率组分标准工作曲线的斜率二、标准曲线法（外标法二、标准曲线法（外标法 / 直接比较法）直接比较法）4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择 当预测组分含量变化不大，并已知这一组分的大当预测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可不必绘制标准工作曲线，采用单点校概含量时，也可不必绘制标准工作曲线，采用单点校正法，即直接比较法。正法，即直接比较法。 i = sA i(h i) / A s (h s)式中，式中， s 标准样品
19、溶液质量分数，标准样品溶液质量分数，%； i 样品溶液中待测组分质量分数，样品溶液中待测组分质量分数，%； A s (h s) 标准样品的峰面积（峰高）；标准样品的峰面积（峰高）； A i (h i) 样品中样品中i组分的峰面积（峰高）。组分的峰面积（峰高）。4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择 此法可省去测定相对校正因子的工作，特别适此法可省去测定相对校正因子的工作，特别适用于大批量样品的测定。若要获得很高精度的结果用于大批量样品的测定。若要获得很高精度的结果时，可加入数种内标物，以提高定量分析的精度。时，可加入数种内标物，以提高定量分析的精度。 i = i sA i(h i) / A
20、s (h s) （ i = f i/ f s）式中，式中， i待测组分（待测组分（i）对内标物（）对内标物（s）的质量相）的质量相对校正因子，可由实验测定或由文献值进行计算得对校正因子，可由实验测定或由文献值进行计算得到。到。三、内标法三、内标法四、标准加入法四、标准加入法4.定量计算公式的选择定量计算公式的选择 标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选不到合适的内标物时，以预测组分的纯物质为内标不到合适的内标物时，以预测组分的纯物质为内标物，加入到待测样品中。物，加入到待测样品中。 i = i / A i(h i) / A i(h i) -1 标准
21、加入法中加入的预测组分（标准加入法中加入的预测组分（i） 还可以作为还可以作为另一组分（另一组分（j）的含量。）的含量。 j = A j(h j) / A i(h i) (i + i )式中，式中， 组分组分j对组分对组分i的相对校正因子；的相对校正因子； A j(h j) 组分组分j的峰面积（峰高）。的峰面积（峰高）。参考文献：参考文献：1 于世林于世林. . 高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用M. 化学工业出版化学工业出版社社,2005,42 张庆合张庆合. 高效液相色谱实用手册高效液相色谱实用手册M. 化学工业出版社化学工业出版社,2005,43 傅若农傅若农. 色谱分析概论色谱分析概论M. 化学工业出版社化学工业出版社,2000,14 张祥民张祥民. 现代色谱分析现代色谱分析M. 复旦大学出版社，复旦大学出版社，2004，75 汪正范汪正范. 色谱定性与定量色谱定性与定量M. 化学工业出版社化学工业出版社,2007,9 谢谢！谢谢！
