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1、第三章第三章 抗体与免疫球蛋白抗体与免疫球蛋白Antibody and ImmunologyAntibody and Immunology海南医学院微生物学与免疫学教研室制作海南医学院微生物学与免疫学教研室制作海南医学院微生物学与免疫学教研室制作海南医学院微生物学与免疫学教研室制作Copyright 2009Copyright 2009内内 容容 与与 要要 求求1 1、免疫球蛋白的结构（掌握）、免疫球蛋白的结构（掌握）2 2、免疫球蛋白、免疫球蛋白的功能（掌握）的功能（掌握）的功能（掌握）的功能（掌握）3 3、各类、各类IgIg的特性与功能（掌握）的特性与功能（掌握）4 4、单克隆抗体（了解
2、）、单克隆抗体（了解） 抗体抗体(Antibody Antibody ， AbAb） 是是B细胞识别抗原细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能，主要存在于血清等体液中。能，主要存在于血清等体液中。免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunologyImmunology，IgIg） 具有抗体具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体是否等于免疫球蛋白？抗体是否等于免疫球蛋白？Ab IgIg包括Ab和M蛋白抗体的发现与命名抗体的发现与命名 303
3、0年年年年代代代代 血血血血清清清清中中中中具具具具有有有有防防防防御御御御作作作作用用用用的的的的保保保保护护护护成成成成分分分分统统统统称称称称为为为为抗抗抗抗体体体体抗体是血清丙种球蛋白，抗体是血清丙种球蛋白，抗体是血清丙种球蛋白，抗体是血清丙种球蛋白，4040年代被命年代被命年代被命年代被命名为名为名为名为-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白, 60, 60年代年代年代年代 免疫免疫免疫免疫球蛋白（球蛋白（球蛋白（球蛋白（IgIg）替代替代替代替代-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白第一节第一节 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构一、基
4、本结构：四肽链结构一、基本结构：四肽链结构一、基本结构：四肽链结构一、基本结构：四肽链结构 由两条相同的由两条相同的由两条相同的由两条相同的轻链轻链轻链轻链（L Light Chainight Chain）和两和两和两和两条相同的条相同的条相同的条相同的重链重链重链重链（H Heavy eavy chainchain）通过链间二硫通过链间二硫通过链间二硫通过链间二硫键连结形成。键连结形成。键连结形成。键连结形成。 分子式为：分子式为：分子式为：分子式为：H H2 2L L2 2四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的NHNH2 2和和和和COOHCOOH方向一致
5、分方向一致分方向一致分方向一致分别命名为别命名为别命名为别命名为N N端和端和端和端和C C端端端端（一）轻链和重链（一）轻链和重链轻链（轻链（L链）链） 链链 链链轻链决定型别轻链决定型别 型型 型型正常人：2 ：1重链（重链（重链（重链（H H链）链）链）链）: :根据其抗原性的差异，人类根据其抗原性的差异，人类根据其抗原性的差异，人类根据其抗原性的差异，人类IgIg的的的的H H链分链分链分链分为为为为 链链链链 链链链链 链链链链 链链链链 链链链链重链决定重链决定重链决定重链决定IgIg类别类别类别类别 IgG IgA IgM IgD IgG IgA IgM IgD IgEIgE（二
6、）可变区和恒定区（二）可变区和恒定区（Variable region and Constant region）V区：区：VL、VH 可变区（可变区（V区）区）：氨基酸种氨基酸种类、排列顺序差异较大，类、排列顺序差异较大，构成抗体的多样性构成抗体的多样性。恒定区（恒定区（C区）区） 氨基酸种类、氨基酸种类、排列顺序恒定排列顺序恒定C区：区：CL、CH 高变区高变区（hypervariable region，HVR） 抗体与抗原结合的位抗体与抗原结合的位置置，又称为决定簇互，又称为决定簇互补区补区(complementarity-determinant region, CDR)，也是抗体分子，也是
7、抗体分子的的独特型决定簇独特型决定簇的主的主要存在部位要存在部位。骨架区骨架区(Framework,FR)(三）铰链区（三）铰链区（hinge region） 位于位于位于位于CHCH1 1和和和和CHCH2 2之间，富含脯氨酸，易发生伸之间，富含脯氨酸，易发生伸之间，富含脯氨酸，易发生伸之间，富含脯氨酸，易发生伸展和一定程度的移动，展和一定程度的移动，展和一定程度的移动，展和一定程度的移动，便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合。二、免疫球蛋白的功能区二、免疫球蛋白的功能区IgIg分子通过链内二硫键分子通过链内二硫键分子通过链内二硫键
8、分子通过链内二硫键折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，每个球形单位为一个每个球形单位为一个每个球形单位为一个每个球形单位为一个功功功功能区。能区。能区。能区。L L链：链：链：链：VLVL区区区区 CLCL区区区区H H链：链：链：链：VHVH区区区区 CHCH1 1区区区区 CHCH2 2区区区区 CHCH3 3区区区区 CHCH4 4区区区区(IgM,IgE )(IgM,IgE )V V区区区区C区区V VL L+V+VHH功能区：功能区：功能区：功能区：抗原结抗原结抗原结抗原结合部位合部位合部位合部位CH3CH3功能区功能区功能区功能区
9、：是：是：是：是IgIg与其与其与其与其FcFc受受受受体结合的部位体结合的部位体结合的部位体结合的部位( (固定细胞）固定细胞）固定细胞）固定细胞）C CL L和和和和C CH H 区区区区：具有同种异型抗体：具有同种异型抗体：具有同种异型抗体：具有同种异型抗体的遗传标记。的遗传标记。的遗传标记。的遗传标记。CHCH2 2区区区区：IgGIgG的补体结合点和通的补体结合点和通的补体结合点和通的补体结合点和通过胎盘的部位过胎盘的部位过胎盘的部位过胎盘的部位功能区的作用功能区的作用V VL L+V+VH H功能区：抗原结合部位功能区：抗原结合部位功能区：抗原结合部位功能区：抗原结合部位IgG C
10、HIgG CH3 3区区区区：可于单核：可于单核：可于单核：可于单核-M-M 细胞、细胞、细胞、细胞、B B细胞、细胞、细胞、细胞、NKNK细细细细胞、中性粒细胞上的胞、中性粒细胞上的胞、中性粒细胞上的胞、中性粒细胞上的IgG-FcIgG-Fc受体受体受体受体结合结合结合结合调理调理调理调理吞噬、吞噬、吞噬、吞噬、ADCCADCC。三、免疫球蛋白的水解片段三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶-水解水解水解水解裂解部位：铰链区近裂解部位：铰链区近裂解部位：铰链区近裂解部位：铰链区近N N端端端端裂解片段：裂解片段：裂解片段：裂解片段：2Fab+Fc 2Fab+Fc F
11、abFab结合价结合价结合价结合价 ：单价：单价：单价：单价 FabFab为抗原结合片段（为抗原结合片段（为抗原结合片段（为抗原结合片段（F Fragment of ragment of a antigen ntigen b bindinginding）FcFc为可结晶片段（为可结晶片段（为可结晶片段（为可结晶片段（F Fragment of ragment of c crystallinerystalline）胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶-水解水解水解水解裂解部位：铰链区端裂解部位：铰链区端裂解部位：铰链区端裂解部位：铰链区端裂解片段裂解片段裂解片段裂解片段 F(ab)F(ab)2 2+
12、pFc+pFc FabFab结合价：二价结合价：二价结合价：二价结合价：二价 IgG水解水解 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶裂解部位裂解部位裂解部位裂解部位 铰链区近铰链区近铰链区近铰链区近N N端端端端 铰链区近铰链区近铰链区近铰链区近C C端端端端裂解片段裂解片段裂解片段裂解片段 2Fab+Fc F(ab)2Fab+Fc F(ab)2 2 +pFc+pFc FabFab结合价结合价结合价结合价 单价单价单价单价 二价二价二价二价同种型抗原同种型抗原同种型抗原同种型抗原决定簇决定簇决定簇决定簇 存在存在存在存在 消失消失消失消失免疫动物免疫动物免疫
13、动物免疫动物 产生抗产生抗产生抗产生抗IgG IgG 不产生抗不产生抗不产生抗不产生抗IgGIgG超敏反应的超敏反应的超敏反应的超敏反应的可能性可能性可能性可能性 大大大大 小小小小 J链链由浆细胞合成 SC链由粘膜上皮细胞合成和分泌四、四、J链和分泌片（链和分泌片（SP） Joining chain and secretory piece单体、二聚体、五聚体单体、二聚体、五聚体单体结构二聚体结构五聚体结构IgG、 IgA、 SIgA IgM IgD、IgE 分子式: H2L2 (H2L2)2SCJ (H2L2)5J第二节第二节 免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能 （一）特异性结合抗原（一）特异
14、性结合抗原（一）特异性结合抗原（一）特异性结合抗原（二）激活补体（二）激活补体（二）激活补体（二）激活补体 （三）与细胞表面（三）与细胞表面（三）与细胞表面（三）与细胞表面FcFc受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞） IgE IgE FcFc受受受受体体体体（FcFc R R）：存存存存在在在在于于于于肥肥肥肥大大大大细细细细胞胞胞胞和和和和嗜碱性粒嗜碱性粒嗜碱性粒嗜碱性粒 细胞膜上。细胞膜上。细胞膜上。细胞膜上。 IgG FcIgG Fc受体（受体（受体（受体（FcFcR R）：存在于单核存在于单核存在于单核存在于单核- -吞噬细吞噬细吞噬细吞噬细
15、胞、胞、胞、胞、NKNK细胞、细胞、细胞、细胞、B B细胞上细胞上细胞上细胞上。（四）通过胎盘和粘膜（四）通过胎盘和粘膜（四）通过胎盘和粘膜（四）通过胎盘和粘膜（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能注射破伤风抗毒素之前注射破伤风抗毒素之前需要先做皮试，为什么？需要先做皮试，为什么？抗毒素可以中和毒素抗毒素是动物血清，对人来说是抗原物质，重复注射会引起超敏反应胃蛋白酶水解片段（pFc）抗原性消失应用何种酶水解抗毒素可以应用何种酶水解抗毒素可以防止超敏反应，为什么防止超敏反应，为什么?紧急预防破伤风需要注射紧急预防破伤风需要注射破伤风抗毒素，为什么？破伤风抗毒素，
16、为什么？第三节第三节 各类各类Ig的特性与功能的特性与功能1 1、 由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。2 2、 在血清中含量最高，在血清中含量最高，在血清中含量最高，在血清中含量最高，占血清占血清占血清占血清IgIg总量的总量的总量的总量的75-80%75-80%。3 3、 是是是是血血血血液液液液循循循循环环环环中中中中主主主主要要要要的的的的防防防防御御御御性性性性抗抗抗抗体体体体，能能能能激激激激活活活活补补补补体体体体、中和病毒、中和毒素、调理吞噬。中和病毒、中和毒素、调理吞噬。中和病毒、中和毒素、调理吞噬。
17、中和病毒、中和毒素、调理吞噬。4 4、能通过胎盘能通过胎盘能通过胎盘能通过胎盘，对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用。5 5、 再次免疫应答再次免疫应答再次免疫应答再次免疫应答产生产生产生产生IgGIgG，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。6 6、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。IgG功能功能 亚类亚类 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4特异性结合抗原
18、特异性结合抗原 + + + + 激活补体（经典激活补体（经典） + + + -通过胎盘通过胎盘 + + +结合结合SPA + + +结合结合FcrR + - /+ + +/-占血清中占血清中Ig总量总量( %) 60-70 15-20 5-10 1-7 人人IgG亚类比较亚类比较 Ig M 1 1、分子量最大分子量最大分子量最大分子量最大，血清，血清，血清，血清IgMIgM为为为为5 5聚体聚体聚体聚体（巨球蛋白）（巨球蛋白）（巨球蛋白）（巨球蛋白）2 2、由由由由脾脾脾脾脏脏脏脏中中中中的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生，是是是是个个个个体体体体发发发发育育育育过过过过程程程程
19、中中中中出出出出现现现现最最最最早早早早的的的的抗抗抗抗体体体体，胚胚胚胚胎胎胎胎晚晚晚晚期期期期已已已已能能能能合合合合成成成成。如如如如新新新新生生生生儿儿儿儿血血血血清清清清IgMIgM含含含含量量量量增增增增高高高高，则则则则表表表表示宫内感染。示宫内感染。示宫内感染。示宫内感染。3 3、血血血血清清清清IgMIgM：能能能能激激激激活活活活补补补补体体体体，通通通通过过过过补补补补体体体体裂裂裂裂解解解解产产产产生生生生C C3b3b、C C4b4b发发发发挥挥挥挥调调调调理吞噬理吞噬理吞噬理吞噬作用。抗全身感染的作用较强。作用。抗全身感染的作用较强。作用。抗全身感染的作用较强。作用
20、。抗全身感染的作用较强。4 4、在在在在免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答的的的的早早早早期期期期发发发发生生生生，是是是是重重重重要要要要的的的的早早早早期期期期防防防防御御御御性性性性抗抗抗抗体体体体，对对对对感感感感染染染染的的的的早早早早期期期期诊诊诊诊断断断断有有有有意意意意义义义义。成成成成人人人人血血血血清清清清IgMIgM含含含含量量量量增增增增高高高高，则则则则表表表表示示示示有有有有近近近近期感染。期感染。期感染。期感染。5 5、 B B细细细细 胞胞胞胞 膜膜膜膜 表表表表 面面面面 IgMIgM（ mIgMmIgM） 是是是是 B B细细细细 胞胞胞胞 识识识识 别别别别
21、 抗抗抗抗 原原原原 的的的的 受受受受 体体体体（BCRBCR），为单体），为单体），为单体），为单体IgMIgM。只表达。只表达。只表达。只表达mIgMmIgM是未成熟是未成熟是未成熟是未成熟B B细胞的标志。细胞的标志。细胞的标志。细胞的标志。IgA与与SIgA 血血血血清清清清IgAIgA：由由由由肠肠肠肠系系系系膜膜膜膜淋淋淋淋巴巴巴巴结结结结中中中中的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生存存存存在在在在于于于于血血血血清清清清中中中中，含含含含量量量量占占占占血血血血清清清清IgIg总总总总量量量量的的的的10-20%10-20%。为为为为单单单单体体体体。具具具具抗抗抗
22、抗菌菌菌菌、抗抗抗抗毒毒毒毒、抗抗抗抗病毒作用，对支原体和某些真菌也有作用。病毒作用，对支原体和某些真菌也有作用。病毒作用，对支原体和某些真菌也有作用。病毒作用，对支原体和某些真菌也有作用。 分分分分泌泌泌泌性性性性IgAIgA（SIgASIgA）：由由由由粘粘粘粘膜膜膜膜固固固固有有有有层层层层的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生，在在在在浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞内内内内已已已已有有有有J J链链链链连连连连结结结结成成成成二二二二聚聚聚聚体体体体，通通通通过过过过粘粘粘粘膜膜膜膜上上上上皮皮皮皮细细细细胞胞胞胞时时时时获获获获得得得得分分分分泌泌泌泌片片片片. . 存存存存在在
23、在在于于于于外外外外分分分分泌泌泌泌液液液液中中中中，为为为为二二二二聚聚聚聚体体体体。SIgASIgA是是是是重重重重要要要要的的的的局局局局部部部部防御性抗体防御性抗体防御性抗体防御性抗体。 Ig D 1 1、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。2 2、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清IgIg总量的总量的总量的总量的0.2%0.2%。3 3、是成熟是成熟是成熟是成熟B B细胞膜表面细胞膜表面细
24、胞膜表面细胞膜表面IgD IgD 分子（分子（分子（分子（SmIgDSmIgD）。）。）。）。4 4、血清、血清、血清、血清IgDIgD分子：功能未明确。分子：功能未明确。分子：功能未明确。分子：功能未明确。 Ig E 1 1、由由由由鼻鼻鼻鼻咽咽咽咽部部部部、扁扁扁扁排排排排腺腺腺腺、支支支支气气气气管管管管、胃胃胃胃肠肠肠肠道道道道粘粘粘粘膜膜膜膜固固固固有层的淋巴组织中的浆细胞产生。有层的淋巴组织中的浆细胞产生。有层的淋巴组织中的浆细胞产生。有层的淋巴组织中的浆细胞产生。2 2、在血清中、在血清中、在血清中、在血清中含量最低含量最低含量最低含量最低， g/mlg/ml3 3、为单体结构。
25、、为单体结构。、为单体结构。、为单体结构。4 4、亲亲亲亲细细细细胞胞胞胞性性性性：与与与与肥肥肥肥大大大大细细细细胞胞胞胞和和和和嗜嗜嗜嗜碱碱碱碱性性性性粒粒粒粒细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜上上上上的的的的FcFc R R结合。结合。结合。结合。5 5、介导介导介导介导型超敏反应型超敏反应型超敏反应型超敏反应。 IgG IgA SIgA IgM IgD IgG IgA SIgA IgM IgD IgEIgE全身性防御抗体全身性防御抗体 + + -+ + - + - + - - -局部性防御抗体局部性防御抗体 - - +- - + - - - - - -早期性防御抗体早期性防御抗体 - - - -
26、 - + + - - - -介导介导型超敏反应型超敏反应 - - - - - - - - - + +介导介导、型超敏反应型超敏反应+ - -+ - - + - - + - -B B细胞膜抗原受体细胞膜抗原受体 - - - - - + + + -+ -（SmIgSmIg）各类免疫球蛋白的主要区别各类免疫球蛋白的主要区别第四节第四节 单克隆抗体单克隆抗体*每一种浆细胞克隆产生一种特异性抗体分子每一种浆细胞克隆产生一种特异性抗体分子*由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体称为细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody，Mc
27、Ab）*由多种由多种B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的不同抗体，称为细胞克隆产生的针对多种抗原表位的不同抗体，称为多克隆抗体多克隆抗体（Polyclonal antibody，pAb）*单克隆抗体技术单克隆抗体技术 即即杂交瘤技术杂交瘤技术，系将产生抗体的，系将产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，产生的杂交瘤细胞，既可在体外大量无限生产繁殖又能合成和分泌抗体。杂交，产生的杂交瘤细胞，既可在体外大量无限生产繁殖又能合成和分泌抗体。 PcAbPcAb McAb McAb产生细胞产生细胞产生细胞产生细胞 多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆 一种浆细
28、胞克隆一种浆细胞克隆一种浆细胞克隆一种浆细胞克隆抗体抗体抗体抗体 非均一性非均一性非均一性非均一性 均一性均一性均一性均一性纯度纯度纯度纯度 不高不高不高不高 高高高高特异性特异性特异性特异性 不强不强不强不强 强强强强PcAb与与McAb的主要区别的主要区别SkWoZr%v)y0C4F7JbNeQiUmXp!t*w-A2D5H9LcOgSkVnZr$u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOgRjVnYq$u(x+B3F6IaMePhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRjUmYq$t*x+B2E6I9LdPhSkWo#r%v)z0C4G7JbNfQiUmYp!t*x
29、-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiUlXp!s&w-A1D5H9KcOgSjVnZq$u(y+B3F7IaMeQhTlXo#s&w)z1D5G8KcNfRjVmYq$u*x+B3E6IaLdPhTkWo#s%v)z1C4G8JbNfRiUmYq!t*x+A2E6H9LdPgSkWoZr%v(y0C4F7JbNeQiUmXp!t&w-A2D5H9LcOgSkVnZr$u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRjUmYq$t*x+A2E6I9LdPhSkWo#r%
30、v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiTlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F7IaMePhTlXo#s&w)z1D5G8KcNfRjVmYq$u*x+B2E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbNfRiUm!t*w-A2D5H9LcOgSkVnZr%u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOgRjVnYq$u(x+B3F6IaMePhTlWo#s&v)z1D4G8KcNfRjUmYq$t*x+B2E6I9LdPhSkWo#r%v)z0C4G7JbNfQiUmYp!t
31、*x-A2E5H9LdOgSkWnZr%v(y0C3F7JbMeQiUlXp!s&w-A1D5H9KcOgSjVnZq$u(y+B3F7IaMeQhTlXo#s&w)z1D5G8KcOfRjVmYq$u*x+B3E6IaLdPhTkWo#s%v)z1C4G8JbNfRiUmYq!t*x+A2E6H9LdPgSkWoZr%v)y0C4F7JbNeQiUmXp!t&w-A2D5H9LcOgSkVnZr$u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRjUmYq$t*x+B2E6I9LdPhSkWo#
32、r%v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiUlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F7IaMePhTlXo#s&w)z1D5G8KcNfRjVmYq$u*x+B3E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbNfRiUmYq!t*x-A2E6H9LdPgSkWoZr%v(y0C4F7JbNeQiUmXp!t&w-A2D5H9LcOgSjVnZr$u(y0B3F7JaMeQhTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1C4G8KbNfRjUm
33、Yq$t*x+A2E6I9LdPhSkWo#r%v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkVnZr%u(y0C3F7JbMeQiTlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F6IaMePhTlXo#s&w)z1D4G8KcNfRjVmYq$u*x+B2E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbNfRiUmYp!t*x-A2E6H9LdPgSkWnZr%v(y0C4F7JbNeQiUlXp!t&w-A2D5H9LcOgSjVnZr$u(y0B3F7IaMeQhTlXp#s&w-z1D5G8KcOfRjVnYq$u(x+B3E6IaMdPhT
34、lWo#s&v)z1C4G8KbNfRjUmYq!t*x+A2E6I9LdPhSkWoZr%v)y0C4G7JbNfQiUmXp!t*w-A2E5H9LdOgSkVnZr%u(y0C3F7JaMeQiTlXp!s&w-A1D5H8KcOgRjVnZq$u(y+B3F6IaMePhTlXo#s&w)z1D4G8KcNfRjVmYq$t*x+B2E6IaLdPhTkWo#r%v)z0C4G8JbNfRiUmYp!t*x-A2E6H9LdPgSkWnZr(y0B3F7JaMeQhTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRj
35、UmYq$t*x+A2E6I9LdPhSkWo#r%v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiTlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F7IaMePhTlXo#s&w)z1D4G8KcNfRjVmYq$u*x+B2E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbNfRiUmYq!t*x-A2E6H9LdPgSkWnZr%v(y0C4F7JbNeQiUlXp!t&w-A2D5H9LcOgSjVnZr$u(y0B3F7JaMeQhTlXp#s&w-z1D5G8KcOfRjVnYq$u(x+B3E6IaMdP
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44、6IaLdPhSkWo#r%v)z0C4G8JbNfQiUmYp!t*x-A2E6H9LdOgSkWnZr%v(y0C3F7JbMeQiUlXp!t&w-A1D5H9KcOgSjVnZr$u(y+B3F7IaMeQhTlXp#s&w)z1D5G8KcOfRjVmYq$u*x+B3E6IaMdPhTkWo#s%v)z1C4G8KbNfRiUmYq!t*x+A2E6I9LdPgSkWoZr%v)y0C4F7JbNeQiUmXp!t*w-A2D5H9LcOgSkVnZr%u(y0B3F7JaMeQiTlXp!s&w-z1D5H8KcOgRjVnYq$u(x+B3F6IaMePhTlWo#s&v)z1D4G8KcNfRjUmYq$t*x+B2E6IaLdPhS
