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1、目目 录录实验三-离心技术及酶学实验Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望目目 录录v概念概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒的离心力作用，使悬浮的微小颗粒( (细胞器、细胞器、生物大分子的沉淀等生物大分子的沉淀等) )以一定的速度沉降，从以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于颗粒的质量、大小和密度，
2、离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。于各种生物样品的分离和制备。目目 录录第一节第一节 基本原理基本原理v离心力离心力 当一个粒子当一个粒子( (生物大分子或细胞器生物大分子或细胞器) )在高速在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”“F”由下式定义，即：由下式定义，即：目目 录录v相对离心力（相对离心力（RCF） 通常离心力常用地球的引力的倍数来表通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，所以称为相对离心力。示，所以称为相对离心力。 在离心场中，作用于颗粒的离心力相当在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度于地球重力的倍数，单
3、位是重力加速度g（980cm/s2）。）。目目 录录v RCF = 1.11910-5(rpm)2rv(rpm-revolutions per minute为每分钟转数，r/min)v低速离心时常以转速低速离心时常以转速“rpm”来表示来表示v高速离心时则以高速离心时则以“g”表示表示目目 录录第二节第二节 离心机的主要构造和类型离心机的主要构造和类型 工业用离心机工业用离心机离心机离心机 制备性离心机制备性离心机 实验用离心机实验用离心机 分析性离心机分析性离心机 目目 录录v一、制备性离心机的三类一、制备性离心机的三类1 1 普通离心机：最大转速普通离心机：最大转速6000rpm6000r
4、pm左右左右2 2 高速冷冻离心机：最大转速为高速冷冻离心机：最大转速为2000020000 25000rpm 25000rpm（r/minr/min）3 3超速离心机：转速可达超速离心机：转速可达500005000080000rpm80000rpm， 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离超速离心机装有真空系统，这是它与高速离 心机的主要区别。心机的主要区别。 目目 录录二、转头二、转头v1 1角式转头角式转头 目目 录录v2 2荡平式转头：荡平式转头： 这种转头是由吊着的这种转头是由吊着的4 4或或6 6个自由活动个自由活动 的吊桶的吊桶( (离心套管离心套管) )构成。构成。 v3 3区
5、带转头：区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子区带转头无离心管，主要由一个转子 桶和可旋开的顶盖组成。桶和可旋开的顶盖组成。 v4 4 垂直转头：垂直转头： 其离心管是垂直放置的。其离心管是垂直放置的。 v5 5 连续流动转头：连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口 的转头盖及附属装置组成。的转头盖及附属装置组成。目目 录录三、离心管三、离心管 v塑料离心管常用材料有聚乙烯塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)(PE)，聚碳酸，聚碳酸酯酯(PC)(PC)，聚丙烯，聚丙烯(PP)(PP)等，其中等，其中PPPP管性能较好。管性能较好
6、。塑料离心管的优点是透明塑料离心管的优点是透明( (或半透明或半透明) )，硬度，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。目目 录录v不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。的化学药品，如强酸、强碱等。v离心管盖离心管盖离心前必须盖严，配平时需带管盖重量离心前必须盖严，配平时需带管盖重量防止样品外泄、挥发防止样品外泄、挥发支持离心管，防止离心管变形支持离
7、心管，防止离心管变形目目 录录v制备性超速离心的分离方法制备性超速离心的分离方法差速沉降离心法差速沉降离心法 逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。下分批分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的颗粒用途：分离沉降系数相差较大的颗粒优点：操作简便优点：操作简便缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活目目 录录密度梯度区带离心法（区带离心法）密度梯度区带离心法（区带离心法）定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉定义：将样品加在惰性
8、梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。的分离方法。优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤压变形保持活性压变形保持活性缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、操作严格不易掌握操作严格不易掌握目目 录录五、离心操作的注意事项五、离心操作的注意事项v使用各种离心机时，使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物平衡离心管和其内容物，转
9、头中绝对不能装载，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必管子必须互相对称地放在转头中须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地，以便使负载均匀地分布在转头的周围。分布在转头的周围。v每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。目目 录录v装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管的离心管，有的离心管无
10、盖，有的离心管无盖，液体不得装得过多，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀蚀; ;而制备性超速离心机的离心管，则常常而制备性超速离心机的离心管，则常常要求要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。凹陷变形。v若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷预冷。 v离心过程中不得随意离开离心过程中不得随意离开目目 录录实验内容实验内容v酶的提取及比活性测定酶的提取及
11、比活性测定目目 录录一、碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline (alkaline phosphatase, AKP)phosphatase, AKP)的分离纯化的分离纯化及比活性测定及比活性测定 目的目的 1 1掌握掌握AKPAKP分离纯化的实验原理、方法分离纯化的实验原理、方法 及注意事项及注意事项 2 2了解检测了解检测AKPAKP活性测定的原理和方法。活性测定的原理和方法。目目 录录v方法方法酶的本质：蛋白质酶的本质：蛋白质p盐析法盐析法p有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法p层析法层析法p电泳电泳目目 录录酶酶组织细胞：先破碎细胞，组织细胞：先破碎细胞， 再用一定的试剂提取再用一定的试剂提取
12、体液：直接提取体液：直接提取方法方法物理方法物理方法化学方法化学方法目目 录录v原则原则p制备的原料制备的原料p初期采用、后期采用方法初期采用、后期采用方法p影响因素影响因素目目 录录p影响因素影响因素pH：最适：最适pH温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷氧化：氧化：SH对某些酶的活性必需，加入还原剂对某些酶的活性必需，加入还原剂重金属离子污染：与重金属离子污染：与SH发生作用而失活：发生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，蛋白酶的污染，PMSF、DFP介质的极性和离子强度：疏水介质的极性和离子强度：疏水最稳定最稳定pHpH目目 录录v评估指标评估指标p
13、酶的纯度用比活性代表酶的纯度用比活性代表定义：单位重量（定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位）蛋白样品中所含酶的活性单位表示方法：每表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位蛋白质所具有酶的活性单位测定方法：测定方法：每每mlml样品中的蛋白质样品中的蛋白质mgmg数数 每每mlml样品中酶的活性单位样品中酶的活性单位酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。目目 录录p酶的回收率酶的回收率 提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴
14、随提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随部分酶的损失。部分酶的损失。 在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收率。率。目目 录录 原理原理 机械破碎法制备肝匀浆机械破碎法制备肝匀浆 匀浆液匀浆液 低浓度醋酸钠：低渗破膜低浓度醋酸钠：低渗破膜 低浓度醋酸镁：保护和稳定低浓度醋酸镁：保护和稳定AKPAKP 有机溶剂沉淀法分离纯化有机溶剂沉淀法分离纯化AKPAKP 加入不同有机溶剂，重复离心加入不同有机溶剂，重复离心 正丁醇：沉淀部分除正丁醇：沉淀部分除AKPAKP的蛋白质的蛋白质 33 33丙酮丙酮(30(30乙醇乙醇) )：AKPAKP溶解溶解 50 50丙酮
15、丙酮(60(60乙醇乙醇) )：AKPAKP不溶解不溶解 ( (一一) )碱性磷酸酶的分离提纯碱性磷酸酶的分离提纯目目 录录 操作步骤操作步骤 25g25g肝组织剪碎肝组织剪碎 +0.01M +0.01M醋酸镁醋酸镁- -醋酸钠溶液醋酸钠溶液75ml75ml，匀浆机中匀浆，匀浆机中匀浆取肝匀浆取肝匀浆4ml(A4ml(A液）液） A1A1：取：取0.1mlA0.1mlA液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性缓冲液，待测比活性A2A2：取：取0.1mlA0.1mlA液液+4.9ml+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度生理盐水，待测蛋白浓度 +2ml+2m
16、l正丁醇，混匀正丁醇，混匀2min2min，室温置，室温置30min30min，离心，离心 （2500rpm)5min2500rpm)5min下清液（吸取）下清液（吸取） 沉淀（弃）沉淀（弃） + +等体积丙酮，等体积丙酮，离心离心（2000rpm)5min2000rpm)5min 上清液（弃）上清液（弃） 沉淀沉淀 +0.5M +0.5M醋酸镁醋酸镁2ml2ml溶解（溶解（B B液）液）目目 录录 操作步骤操作步骤 B B 液液 +95% +95%冷乙醇至冷乙醇至30%30%，离心（，离心（2500rpm2500rpm）5min5min上清液（吸取）上清液（吸取） 沉淀（弃）沉淀（弃） +
17、95% + 95%冷乙醇至冷乙醇至60%60%，离心（，离心（2500rpm2500rpm）5min5min上清液（弃）上清液（弃） 沉淀沉淀 +0.01M +0.01M 醋酸镁醋酸镁- -醋酸钠醋酸钠2ml,2ml,溶解（溶解（C C液）液） C1 C1：取：取0.1mlC0.1mlC液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性缓冲液，待测比活性 C2 C2：取：取0.1mlC0.1mlC液液+0.1ml+0.1ml生理盐水，待测蛋白浓度生理盐水，待测蛋白浓度 B1B1：取：取0.1mlB0.1mlB液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.
18、8Tris缓冲液，待测比活性缓冲液，待测比活性B2B2：取：取0.1mlB0.1mlB液液+0.9ml+0.9ml生理盐水，待测蛋白浓度生理盐水，待测蛋白浓度目目 录录加入有机溶剂计算公式加入有机溶剂计算公式设加入设加入Xml95%Xml95%乙醇乙醇至终浓度至终浓度30%30% 30% 30%（B B液体积液体积+X+X）=95%=95%X X X=30%B X=30%B液体积液体积95%-30%=0.462B95%-30%=0.462B液体积液体积至终浓度至终浓度60%60% 60% 60%（上清液体积（上清液体积+X+X）30%30%上清液体积上清液体积=95%X=95%X X= X=（
19、60%-30%60%-30%）上清液体积）上清液体积 95%-60%=0.867 95%-60%=0.867上清液体积上清液体积目目 录录 注意事项注意事项 l各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。l操作要在低温下进行操作要在低温下进行l加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。和变性。l加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。l离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的离心析
20、出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。丧失。目目 录录( (二二) )碱性磷酸酶的比活性测定碱性磷酸酶的比活性测定 原理原理 比活性的定义比活性的定义l单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。l通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。l用用以鉴定酶的纯化程度以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一与否的评价指标之一。目目 录录测定样品的比活性必须测定：测定样品的比活性必须测定：l每毫升样品中的酶活性单位数。每毫升样品中的酶活性单位数。l每毫升样品中的蛋
21、白质毫克数。每毫升样品中的蛋白质毫克数。目目 录录磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性 AKP 4- AKP 4-氨基安替比林氨基安替比林l磷酸苯二钠磷酸苯二钠 酚酚 醌衍生物（红色）醌衍生物（红色） 铁氰化钾铁氰化钾 根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。l3737保温保温1515分钟产生分钟产生1g1g酚者为酚者为1 1个酶活性单位。个酶活性单位。 目目 录录目目 录录考马斯亮蓝法测定蛋白质含量考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 回顾实验原理（实验讲义第回顾实验原理（实验讲义第6060页）。页）。目目 录录 操作步骤操作步骤 1.AKP1.
22、AKP活性单位测定活性单位测定 取试管取试管5 5支，按下表操作：支，按下表操作：试剂（试剂（mlml）空白管空白管标准管标准管A AB BC0.04mol/L0.04mol/L基质液基质液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0pH10pH10碳酸缓冲液碳酸缓冲液0.50.50.50.50.50.50.50.50.53737水浴保温水浴保温5 5分钟分钟蒸馏水蒸馏水0.10.1_ _ _ _酚标准液（酚标准液（0.1mg/ml0.1mg/ml）_ _0.10.1_ _ _测定液测定液_ _ _A1A1液液0.10.1B B液液0.10.1C1液液0.1混匀，立即置于混匀，立即置
23、于37 37 水浴保温水浴保温1515分钟分钟目目 录录 加加0.2M NaOH0.2M NaOH溶液溶液1ml1ml加加0.3%4-0.3%4-氨基安替比林氨基安替比林1ml, 0.5%1ml, 0.5%铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液2ml2ml，混匀，室，混匀，室温温10min10min，各溶液进行，各溶液进行A510A510测定测定计算：酶活性单位计算：酶活性单位/ml=A/ml=A标本标本/A/A标准标准CC标准（标准（0.10.1）稀释倍数稀释倍数 操作步骤操作步骤 目目 录录 2. 2. 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 取试管取试管5 5支，按下表操作支，按下表操作试剂（试剂（mlml）空
24、白管空白管标准管标准管A AB BC C生理盐水生理盐水0.10.1标准蛋白溶液标准蛋白溶液0.10.1样品样品A2A2液液0.10.1B2B2液液0.10.1C2C2液液0.10.1考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0 室温室温5min5min，各管进行，各管进行A595A595测定测定计算：样品中蛋白质的含量（计算：样品中蛋白质的含量（ll）=A=A样品样品/A/A标准标准CC标准标准稀释倍数稀释倍数目目 录录 3. 3. 结果处理与分析结果处理与分析 结果处理表结果处理表体积体积(ml)(ml)酶活性计算酶活性计算蛋白含量计算蛋白含量计算比活比活性性(U/mg(U/mg) )酶的酶的得率得率A A值值稀稀释释倍倍数数酶活性酶活性(U/ml)(U/ml)酶的总酶的总活性活性（U U）A A值值稀稀释释倍倍数数蛋白浓度蛋白浓度(mg/ml)(mg/ml)A A液液4 4100%100%B B液液2.22.2C C液液2 2目目 录录（三）思考题（三）思考题l 酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提 取与纯化成功与否？取与纯化成功与否？l测定酶的比活性有何意义？测定酶的比活性有何意义？
