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1、食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验标准的修订志贺氏菌检验标准的修订志贺氏菌检验标准的修订志贺氏菌检验标准的修订GB 4789.5GB 4789.5GB 4789.5GB 4789.5GB 4789.5GB 4789.51;.n主要的肠道病原菌之一主要的肠道病原菌之一, 引起人类细菌性痢疾引起人类细菌性痢疾 尽管大量的分类学资料认为这类细菌应包括在大肠杆菌 （E.coli）内，但一些临床微生物学家往往仍当作一个独立的菌属来对待。n伯杰手册伯杰手册(1984)中将其分为中将其分为4个血清群个血清群(种种) A群痢疾志贺氏菌（S.dysent
2、eriae） B群福氏志贺氏菌（S.flexneri） C群鲍氏志贺氏菌（S.boydii） D群宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。 这些菌群还可根据血清学再进一步分型。志志 贺贺 氏氏 菌菌2;.培培 养养 特特 性性n志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌；n无芽孢、无荚膜、无鞭毛、不运动n需氧或兼性厌氧，营养要求不高，能在普通培养基上生长n能利用葡萄糖与其他碳水化合物，产酸不产气。n除A群外，B 、 C 、 D群均能发酵甘露醇，除D群外，A 、 C和D群均不发酵乳糖； D群具有鸟氨酸脱羧酶3;.n对可疑的食品，包括在使用前需用手处理的或轻微加热的产品，且其酸度范围由PH5.5至6.5之间。一般来
3、说，当食品中含有大量的大肠菌群，大肠杆菌与沙门氏菌时，同时即可疑含有志贺氏菌。4;.现行现行GB/T 4789.5-2003GB/T 4789.5-2003标准不足处标准不足处1. 采用的GN增菌肉汤,37需氧培养,4小时后大肠菌 的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异5;.修修 订订 原原 则则1.1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性以原国标为基础，保持与原标准的连续性 考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法2.2.与国际接轨的原则与国际接轨
4、的原则 该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参考采用了美国FDA、NMKL等标准6;.3.3.与现有已颁布的新版国家标准协调统一与现有已颁布的新版国家标准协调统一 参考了已颁布的2008版国标，在样品的前处理步骤，培养条件的选择，文字描述等方面尽量 保持一致。 7;.修修 订订 依依 据据1. GB/T 4789.520032. 国际标准化组织 ISO 21567-2004 Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for detection of Shigella spp. 3. 美国食
5、品药品管理局FDA Bacteriological Analytical Manual (8th Edition，2001年) Chapter 6 Shigella8;.4.北欧食品分析委员会NMKL The Nordic committee on food analysis NO.151 1995 shigella bacteria detecyion in foods5.卫生防疫检验1979年3月第一版6.痢疾防治手册2006年9月第一版9;.增菌：用增菌：用GN增菌液使增菌液使处于濒死状态的细菌处于濒死状态的细菌恢复活力恢复活力选择性平板分离培养：选择性平板分离培养：XLD+MAC/显色
6、培显色培养基养基生化试验：可采用生化试验：可采用API 20E或或VITEK2血清学鉴定：特异性血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种。诊断血清鉴定到种。 志贺氏菌操作流程10;.检验检验方法“食品卫生微生物学志贺氏菌检验方法”GB/T4789.5200311;.修修 改改 的的 内内 容容 增菌部分增菌部分志贺氏菌增菌液（新生霉素志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL 0.5 g/mL ） 原国标：GN ISO ：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL ） FDA：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL 和3 g/mL ） NMKL：志贺氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL ）12;.培养
7、条件：培养条件：41.51 41.51 厌氧培养厌氧培养 原国标： 37需氧培养 ISO： 41.5厌氧培养 FDA： 42（除宋内其他志贺菌)和44（宋内）厌氧培养 NMKL： 42厌氧培养 13;. 分离用平板分离用平板 原国标：HE或SS; MAC或EMB ISO： MAC、 XLD 、 HE FDA： MAC NMKL： MAC、 XLD 、 HE14;.验证实验n我们通过人工布菌：用宋内氏志贺氏菌ATCC 9290、福氏志贺杆菌 ATCC 12022、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、鲍氏志贺氏菌 ATCC 8704的标准菌株制成混悬液然后分别用原国标方法和志贺氏增菌液42，厌氧培养
8、做方法的检出限。15;.16;.17;.18;.19;.实验结论实验结论n1.通过对五种不同染菌浓度0.1 cfu/g、0.5 cfu/g、 1 cfu/g 、5 cfu/g、 10 cfu/g的样品测定，用GN增菌液需氧培养，宋内氏志贺菌的最低检出限为5 cfu/g；福氏志贺氏菌的最低检出限为5 cfu/g；痢疾志贺氏菌的最低检出限为10 cfu/g；鲍氏志贺氏菌的最低检出限为10 cfu/g ；所以方法的检出限为5-20 cfu/25g。n2.用志贺氏增菌液厌氧培养，宋内氏志贺菌的最低检出限为0.5 cfu/g；福氏志贺氏菌的最低检出限为1 cfu/g；痢疾志贺氏菌的最低检出限为5cfu/
9、g；鲍氏志贺氏菌的最低检出限为1 cfu/g ；所以方法的检出限为0.5-5 cfu/25g。20;.n 实验操作步骤21;.增增 菌菌 培培 养养用志贺氏菌增菌液增菌, 41.5 ，16 h20 h厌氧培养。22;.分分 离离 培培 养养n取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或R&F志贺氏菌显色培养基平板上，n于36 1 培养20 h24 h，观察各个平板上生长的菌落形态，n若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48 h再进行观察。23;.菌菌 落落 特特 征征 nMAC琼脂 ：无色至浅粉红色，半透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐
10、，直径2 3 mm nXLD琼脂 ：粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐，直径1 2 mm 24;.R&F志贺氏菌显色琼脂 ：白色，不透明、圆形、边缘不整齐，直径1 mm3 mm，菌落周围琼脂颜色变为紫红色25;.志志 显显1 1 宋内氏典型菌落宋内氏典型菌落XLD26;.2 2 福氏典型菌落福氏典型菌落志显志显XLD27;.XLD3 3 鲍氏典型菌落鲍氏典型菌落志显志显28;.XLD4 4 痢疾典型菌落痢疾典型菌落志显志显29;.5 5 熟肉制品中宋内的分离效果熟肉制品中宋内的分离效果R&F志显志显XLD30;.志显志显6 6 蔬菜制品中宋内分离效果蔬菜制品中宋内分离效果X
11、LD31;.志显志显7 7 鲍氏在生肉中的分离效果鲍氏在生肉中的分离效果XLD32;.8 8 熟肉制品中福氏的分离效果熟肉制品中福氏的分离效果志志 显显33;.初初 步步 生生 化化n选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固体、营养琼脂斜面，36 1 培养20 h24 h， 观察结果。n培养物中出现以下情况可以弃去 a.在三糖铁琼脂斜面上蔓延生长 b.发酵乳糖或蔗糖 c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的 d.产气的 e.产生硫化氢 f.有动力的培养物34;.初步生化初步生化初步生化初步生化: : : :三糖铁（三糖铁（三糖铁（三糖铁（TSITSITSITSI）现象现象说说 明明
12、底层底层黄色黄色葡萄糖阳性葡萄糖阳性红色或红色或不变色不变色葡萄糖阴性葡萄糖阴性黑色黑色产产H2S气泡气泡产气产气斜面斜面黄色黄色乳糖和（或）蔗糖阳性乳糖和（或）蔗糖阳性红色或红色或不变色不变色乳糖和（或）蔗糖阴性乳糖和（或）蔗糖阴性志贺氏菌都能分解葡萄糖，志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生乳糖，不产生H H2 2S S。 如图如图中中2 2号管的反应号管的反应. .35;.双管糖nH2S阳性就是 纸条变黑 反之不色nH2S纸条为白色 n吲哚阳性就是 纸条变红 反之不变色n吲哚纸条为黄色 湿软感 36;.生化试验37;.38;.生化反应A群：痢疾志
13、贺氏菌B群：福氏志贺氏菌C群：鲍氏志贺氏菌D群：宋内氏志贺氏菌-半 乳 糖 苷酶cc尿素赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶a水杨苷七叶苷靛基质/()/甘露醇b棉子糖甘油()()d注：+阳性；-阴性；-/+多数阴性；+/-多数阳性；（+）迟缓阳性；d有不同生化型。a 鲍氏13型为鸟氨酸阳性。b福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。c痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。志贺氏菌属四个群的生化特征志贺氏菌属四个群的生化特征39;.附加生化实验 由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，
14、并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 培养24 h48 h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3 40;.41;.n西蒙氏柠檬酸盐实验西蒙氏柠檬酸盐实验n葡萄糖铵实验葡萄糖铵实验n粘液酸盐实验粘液酸盐实验 挑取少量琼脂培养物接种，于361培养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。鉴别细菌能否利用铵盐作为唯一氮源并分解葡萄糖产酸，溴麝香草酚兰是指示剂，产酸时培养基由绿色变为黄色。 细菌如能利用粘液酸盐，则可分解而产酸，使培养基中的溴麝香草酚兰呈黄
15、色。阴性(1,2)阳性(3)123阳性阴性阴性阳性42;.生化鉴定生化鉴定n增加了API 20E诊断试剂条和全自动细菌生化鉴定仪VITEK；43;.44;.45;.血清学鉴定血清学鉴定1.抗原的准备抗原的准备 志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。 O抗原为糖脂蛋白复合物，可分为型特异性抗原和群特异性抗原。志贺氏菌分为4个群，48个血清型（包括亚型及变种）。K抗原在志贺菌属分类上无意义。46;.菌体（菌体（0）抗原）抗原n1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常
16、随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分为A、B、C、D四个群及39个抗原型。n2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。47;.表面抗原（表面抗原（K抗原）抗原） 在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热1001小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。2.2.凝集反应凝集反应48;.菌痢的流行型别变迁史菌痢的流行型别变迁史1950-1950-n20世纪40年代以前,A群是主要的流行菌，60年代消声灭迹，1969-1970年在中美地区暴发，1972-
17、1978年又在南亚地区流行。国内从90年代后期鲜有报道，偶有暴发。nB群一直是国内的优势群。有资料表明，北京地区从1950-1989年，F1a和F2a一直是主要的交替流行菌株（其中1986年以5型、y变种、1988-1989年以F2a、3a为主）。n上海宝山区1990-2000年一直以F2a为主，2001年以宋内为主，2002-2003年又以F2b为主，2004年至今一直是F4c为流行菌型。49;.20052005年上海市菌痢型别分析年上海市菌痢型别分析来源菌株数福氏志贺菌型分布宋内志贺菌B:DF1aF1cF2aF2bF3aF4F4aF4cFxFy宝山区52338295322141841652
18、.17静安区3511165210.67市疾控3421115240.42其它5232224111029_合计64444233791132352542191.94构成(%)1006.830.315.1212.270.160.160.4736.493.880.6234.0150;.51;.3.3.血清学分型（选做项目）血清学分型（选做项目） 先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查，福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实
19、验，如呈现凝集，则用其相和相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及112各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用118各型因子血清检查。 52;.志贺氏菌的志贺氏菌的志贺氏菌的志贺氏菌的OO抗原抗原抗原抗原n人们原来的认识认为血清学试验是特异性的，但是志贺氏菌的人们原来的认识认为血清学试验是特异性的，但是志贺氏菌的 O抗原和大肠抗原和大肠埃希氏菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些埃希氏菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同。抗原完全相同。相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。因此，生化
20、试验对于属的鉴定是非相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。因此，生化试验对于属的鉴定是非常重要的。常重要的。53;.志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的志贺氏菌属与大肠埃希氏菌的OO抗原关系抗原关系抗原关系抗原关系 O抗原完全相同的抗原完全相同的： O抗原部分相同抗原部分相同的的: : 志贺氏菌属 大肠埃希氏菌 志贺氏菌属 大肠埃希氏菌 A2 。112ac A1 1, 120. A3 。124 A2 149 A4 3588-51 A3 164. A5 58 A4 88，159. A12 (3341-55) 152 A6 130 B2b 147ab A7
21、121 B3a 5444-80 A8 38, 23 B4b 135 A10 . 144 B5 129 A11 29 C1 149 A12 3 C4 53 B 群 1,2,13,16,17,19, 62,69,73,3438-51 C5 79 C1 2, (50) C7 4838-69 C2 87ab, 96 C8 143 C3 85 C11 105ab C4 149 C14 32 C6 76 C15 112ab C9 102 C10 105ac C12 7 C13 28ac, 98 C15 83 C16 47 C17 124 C18 29, 可能 54;.结果报告结果报告n综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌属。55;.56;.
