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1、第六章第六章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础1uu限制性内切酶限制性内切酶uuDNA连接酶连接酶uuDNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶uuDNA修饰酶修饰酶uu外切核酸酶外切核酸酶uu单链内切核酸酶单链内切核酸酶uuRNA酶酶2uu核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。的磷酸二酯键，从而使核酸分子断链。uu根据水解的不同方式，分为：根据水解的不同方式，分为：外切核酸酶（外切核酸酶（exonuclease）内切核酸酶（内切核酸酶（endonuclease）uu根据作用的核酸底物不同，分为：根据作用的核酸底物不同，分为：
2、RNA酶酶DNA酶酶底物非专一性核酸酶底物非专一性核酸酶36.1 限制性内切酶u定义：定义：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别是识别DNA的特异的特异序列序列,并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。41.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现uu 2020世纪世纪世纪世纪6060年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。uu从天然宿主大肠杆菌从天然宿主大肠杆菌从天然宿主大肠杆菌
3、从天然宿主大肠杆菌KK中分离得到的中分离得到的中分离得到的中分离得到的kk噬菌体，当噬菌体，当噬菌体，当噬菌体，当其感染其感染其感染其感染B B菌株时，感染率仅为菌株时，感染率仅为菌株时，感染率仅为菌株时，感染率仅为1010-4-4，分离得到幸存，分离得到幸存，分离得到幸存，分离得到幸存的子代的子代的子代的子代kk病毒，再用其感染病毒，再用其感染病毒，再用其感染病毒，再用其感染B B菌株，感染率为菌株，感染率为菌株，感染率为菌株，感染率为100%100%；若再用其感染；若再用其感染；若再用其感染；若再用其感染KK菌株，感染率又降为菌株，感染率又降为菌株，感染率又降为菌株，感染率又降为1010-
4、4-4。此现象称为宿主限制现象。此现象称为宿主限制现象。此现象称为宿主限制现象。此现象称为宿主限制现象。一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现5uu各种细菌都能合成一种或几种能够切割双各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源的内切核酸酶，以此来限制外源DNA在自身细胞内的存在。在自身细胞内的存在。uu几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基化相同化相同DNA位点的甲基转移酶共同作用，位点的甲基转移酶共同作用，构成限制构成限制-修饰系统。修饰系统。uu宿主细胞的宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保被甲基转移酶修饰而被保护起
5、来，不被限制性内切酶识别，从而使护起来，不被限制性内切酶识别，从而使自身自身DNA免受降解。免受降解。62.限制酶限制酶HindIII的发现的发现uuSmith等于等于1970年首次从流感嗜血杆菌年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到）中发现并分离到HindIII限制酶。限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制uuNathans（1971年）用年）用HindIII绘制绘制SV40的限制酶谱。的限制酶谱。 7二、限制性内切核酸酶的类型二、限制性内切核酸酶的类型uu已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型
6、：种不同类型：uu型酶：能识别专一的核苷酸序列，并型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的核苷酸切割在识别位点附近的核苷酸切割DNA双链，双链，但切割序列是随即的，无专一性。在基但切割序列是随即的，无专一性。在基因工程中应用不大。因工程中应用不大。uu型酶：能识别专一的核苷酸序列，并型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置切割双链在识别序列的固定位置切割双链DNA分分子，是子，是基因工程中最常用的工具酶基因工程中最常用的工具酶。8uu型酶：有专一的识别序列，但不是对型酶：有专一的识别序列，但不是对称的回文序列，在识别序列旁边的位置称的回文序列，在识别序列旁边的位置上切割双链
7、。切割后产生的上切割双链。切割后产生的DNA片段具片段具有各种单链末端。有各种单链末端。uu型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。用。9uu命名原则：命名原则：属属种种株株分离序号分离序号例如：例如：EcoR属：属：Escherichia种：种：coli株：株：R分离序号：分离序号：三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名10第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字
8、表示发现的先后次序。命名命名Hind属属种种株株序序Haemophilus influenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶11（一）识别序列的特异性（一）识别序列的特异性uu大多数大多数型限制内切酶的识别序列长度为型限制内切酶的识别序列长度为46bp，具有双重旋转对称结构的，具有双重旋转对称结构的回文序列回文序列（palindromicsequence）。）。四、四、型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBamH：v如果识别序列由如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为对碱基组成，其对称轴为中间的一对碱基
9、，如中间的一对碱基，如Mae的识别序列为：的识别序列为：-GTNAC-CANTC-其中，其中，N为任意碱基。为任意碱基。12回文诗回文诗悠悠绿水傍林偎，日落观山四望回。幽林古寺孤明月，冷井寒泉碧映台。鸥飞满浦渔舟泛，鹤伴闲亭仙客来。游径踏花烟上走，流溪远棹一篷开。开篷一棹远溪流，走上烟花踏径游。来客仙亭闲伴鹤，泛舟渔浦满飞鸥。台映碧泉寒井冷，月明孤寺古林幽。回望四山观落日，偎林傍水绿悠悠。1314uu有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，但不影响其作用位二位碱基并非严格专一，但不影响其作用位点，只是增加酶的识别和作用频率。如点，只是增
10、加酶的识别和作用频率。如Hind识别序列为识别序列为-GTYRAC-，其中，其中Y表表示示C或或T，R表示表示A或或G。uu有的酶识别有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀个以上的核苷酸序列，称为稀有限制性内切酶，如有限制性内切酶，如Not，识别序列为，识别序列为（GCGGCCGC）15（二）切割位点的特异性（二）切割位点的特异性1.DNA分子酶切片段的末端分子酶切片段的末端uu切割：水解双链切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产中的磷酸二酯键，产生的生的DNA片段片段5端为磷酸基，端为磷酸基，3端为羟基。端为羟基。16uu酶切后产生的片段末端有酶切后产生的片段末端有黏性末端黏性末端和和平末端
11、平末端等形式。等形式。uu黏性末端黏性末端：DNA分子在限制性内切酶分子在限制性内切酶的作用下形成的具有互补碱基的单链的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。它们能够通过延伸形成的末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。互补碱基间的配对而重新连接起来。17（1）在）在对称轴两侧相对位点对称轴两侧相对位点分别切割一条链。分别切割一条链。靠近靠近5端端切割产生切割产生5端突出的粘性末端端突出的粘性末端，如，如EcoRI：5GAATTC3EcoRI5GAATTC33CTTAAG53CTTAAG55518（2）靠近）靠近3端端切割产生切割产生3端突出的粘性端突出的粘性末端末端
12、。如。如Pst I：5CTGCAG3Pst I5CTGCAG33GACGTC53GACGTC533195CCCGGG3SmaI5CCCGGG33GGGCCC53GGGCCC5 （3）在对称轴中心同时切割双链，产生）在对称轴中心同时切割双链，产生平平末端末端或称或称钝性末端钝性末端（bluntend），如），如SmaI：202.同切点酶（或同裂酶，同切点酶（或同裂酶，isoschizomer）uu同裂酶：同裂酶：是一类来源于不同的微生物、能是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。例：例：SmaCCCGGGXmaCCCGGG识别序列相同，切割
13、位点不同识别序列相同，切割位点不同识别序列相同，切割位点也相同识别序列相同，切割位点也相同例：例：Hpa与与Msp识别顺序都是识别顺序都是CCGG21uu3.同尾酶（同尾酶（isocaudamer）定义：来源不同，识别的靶序列也各不定义：来源不同，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端相同，但切割后能产生相同的黏性末端。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A221.酶的纯度酶的纯度2.DNA样品的纯度样品的纯度uu高纯度高纯度DNA是必需的是必需的uu样品如果残留氯仿、
14、苯酚、乙醇、样品如果残留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS等物质，或蛋白质、多糖等都可能影响等物质，或蛋白质、多糖等都可能影响内切酶的反应活性。内切酶的反应活性。uu如果如果DNA纯度不高时，可采取以下措施：纯度不高时，可采取以下措施：增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应增加酶的用量、扩大反应体系体积、延长反应时间、添加阳离子亚精胺等。时间、添加阳离子亚精胺等。时间、添加阳离子亚精胺等。时间、添加阳离子亚精胺等。五、影响限制内切酶活性的因素五、影响限制内切酶活性的因素233.DNA的甲基化程度的甲基化程度uu识
15、别序列中特定核苷酸的甲基化会影响酶识别序列中特定核苷酸的甲基化会影响酶的活性。的活性。 uu在基因克隆中是使用失去了甲基化在基因克隆中是使用失去了甲基化酶酶的大的大肠杆菌菌株制杆菌菌株制备质粒粒DNA。 uu可根据各种同裂可根据各种同裂酶酶所具有的不同的甲基化所具有的不同的甲基化敏感性研究真核基因敏感性研究真核基因组DNA的甲基化作用的甲基化作用模式。例如，模式。例如，MspI可以切割甲基化的可以切割甲基化的CCGG，而，而HpaII不能切割甲基化的序列。不能切割甲基化的序列。244.酶切反应的温度酶切反应的温度uu大多数限制性内切酶的最适反应温度为大多数限制性内切酶的最适反应温度为37。表表
16、2-3部分限制性内切部分限制性内切酶酶的最适反的最适反应温度温度酶酶酶酶反反反反应应温度温度温度温度酶酶酶酶反反反反应应温度温度温度温度ApaApaI I3030MaeMaeI I4545ApyApyI I3030MaeMaeIIII5050BanBanI I5050MaeMaeIIIIII5555BclBclI I5050SmaSmaI I2525BstBstEIIEII6060TaqTaqI I6565255.DNA分子的构型分子的构型uu某些限制酶，切割超螺旋的质粒某些限制酶，切割超螺旋的质粒DNA或或病毒病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。
17、的高出许多倍。uu还有些限制性核酸内切酶切割它们自己还有些限制性核酸内切酶切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显的差别。有明显的差别。uu大多数内切酶对只含识别序列的寡聚核大多数内切酶对只含识别序列的寡聚核苷酸不具有催化活性。苷酸不具有催化活性。262hr20hruuHindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%uuEcoRIGGAATTCC9090276.反应缓冲液反应缓冲液uupH范围：范围：7.07.6uu缓冲液组份缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）、三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、MgC
18、l2、二硫苏糖醇（、二硫苏糖醇（DTT）或或-巯基乙醇巯基乙醇uu有些酶需要有些酶需要BSA，以防止酶在低浓度蛋，以防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。白质溶液中变性。287.酶的星号活性（酶的星号活性（staractivity）uu当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为导致识别与切割序列的非特异性，称为星号星号活性。活性。uuEcoR正常情况下，其靶子序列为正常情况下，其靶子序列为GAATTC，但若缓冲液，但若缓冲液pH8、盐离子浓度低于、盐离子浓度低于50mm和甘油超过和甘油超过5%（V/V），可在），可在NAATTN处切
19、处切割，以割，以EcoRI*表示表示298.限制性内切酶反应的终止限制性内切酶反应的终止uu消化消化DNA样品后，在进一步处理样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性。样品前往往需要钝化内切酶的活性。uu钝化大多数限制性内切酶的方法是钝化大多数限制性内切酶的方法是65温浴温浴5分钟分钟。uu但有些酶，如但有些酶，如BamHI和和Hae具备对热具备对热稳定性，则需加入稳定性，则需加入终止反应液终止反应液（加入（加入0.5molL的的EDTA使之在溶液中的终浓使之在溶液中的终浓度达到度达到10mmol/L以螯合以螯合Mg2+）。）。301.DNA分子的双酶切消化分子的双酶切消化可以
20、先后分别在不同的反应体系中进行：可以先后分别在不同的反应体系中进行：uu先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子浓度，加入另一种酶切割。盐离子浓度，加入另一种酶切割。uu先用最适反应温度较低的酶切割，升温后先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入第二种酶。再加入第二种酶。六、限制内切酶对六、限制内切酶对DNA的消化的消化31322.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化分子的完全酶切消化和部分酶切消化uu完全酶切消化：内切酶对完全酶切消化：内切酶对DNA序列中全部序列中全部的识别序列进行切割。的识别序列进行切割。uu部位酶切：内切酶对部位酶切：内切酶对D
21、NA序列中所有的识序列中所有的识别序列进行不完全切割。别序列进行不完全切割。3334酶切反应注意事项酶切反应注意事项价格昂贵价格昂贵决不能用水稀释决不能用水稀释, ,以免变性失活。以免变性失活。预先加入预先加入除酶以外除酶以外的所有其他试剂。的所有其他试剂。取酶立即放于冰上。取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。分装小份避免反复冻融。使用无菌的使用无菌的新吸头新吸头。少加水少加水, ,使体积最小使体积最小,但保证酶液体积不超过总但保证酶液体积不超过总体积的体积的1010, ,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。否则酶液中的甘油会抑制酶活性。356.2DNA连接酶连接酶一、一、DNA连接酶的发现连接
22、酶的发现uuDNA连接酶（连接酶（DNAligase）是能催化双链）是能催化双链DNA片段靠在一起的片段靠在一起的3羟基末端与羟基末端与5端磷酸端磷酸基因末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连基因末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。接在一起。“分子黏合剂分子黏合剂”36uu依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：依赖依赖依赖依赖ATPATP的的的的DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶依赖依赖依赖依赖NAD+NAD+的的的的DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶uu依据其来源可分为三类：依据其来源可分为三类：T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA连
23、接酶、连接酶、连接酶、连接酶、大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶热稳定热稳定热稳定热稳定DNADNA连接酶。连接酶。连接酶。连接酶。37二、二、DNA连接酶的特点连接酶的特点uu连接反应需要一条连接反应需要一条DNA链游离的链游离的3-OH，另，另一条链一条链5末端具有磷酸基团。末端具有磷酸基团。uu连接反应中需要连接反应中需要ATP或或NAD+和和Mg2+为辅因为辅因子和激活因子。子和激活因子。uuDNA连接酶并不能够连接两条单链的连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子！分子！uuDNA连接酶只能封闭双螺旋连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的骨架上的缺口（缺口
24、（nick），不能封闭失去核苷酸所形成），不能封闭失去核苷酸所形成的裂口（的裂口（gap）38394041三、三、DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理42四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素uu1.反应温度：反应温度：黏性末端：黏性末端：415比较合适比较合适平末端：平末端：1020uu2.连接酶浓度：连接酶浓度：平末端连接所需酶量较多平末端连接所需酶量较多黏性末端连接所需酶量较少。黏性末端连接所需酶量较少。43uu3.ATP浓度浓度一般情况下一般情况下ATP最适的终浓度为最适的终浓度为0.5mmol/L。当当ATP浓度上升至浓度上升至5.0mmol/L时，将影响酶时，将影响酶对平末
25、端的连接；对平末端的连接；当当ATP浓度上升至浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末时，对黏性末端及平末端的连接均有抑制作用。端及平末端的连接均有抑制作用。44uu4.DNA片段末片段末端端456.3DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶uuDNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）：在引物）：在引物和模板的存在下，把和模板的存在下，把dNTP连续加到连续加到DNA分分子子3-OH末端，催化核苷酸的聚合。末端，催化核苷酸的聚合。uu分为两类：分为两类：依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶-反转录酶反转录酶46一、一、DNA聚合酶聚合酶.E.
26、coli DNA聚合酶聚合酶I（polI）-Kornberg酶酶1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶外切酶活性活性(大片段亦称为大片段亦称为Klenow片段片段,polIK)2）聚合酶活性，聚合酶活性，53,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响，其延续性受反应条件的影响3）外切酶活性：具外切酶活性：具35和和53外切酶活性外切酶活性475-3聚合酶活性聚合酶活
27、性条件条件:Mg2+dNTP3-OH48uu沿沿35方向识别和切除不配对的方向识别和切除不配对的DNA生长生长链末端的核苷酸。链末端的核苷酸。uu在体内在体内DNA复制时起校对作用，保证了复制时起校对作用，保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。复制的真实性，从而降低突变率。3-5外切酶活性外切酶活性49uu可降解可降解可降解可降解DNADNA：RNARNA杂合体中的杂合体中的杂合体中的杂合体中的RNARNA分子分子分子分子uu带切除的核酸分子必须具有带切除的核酸分子必须具有带切除的核酸分子必须具有带切除的核酸分子必须具有55端游离的磷酸端游离的磷酸端游离的磷酸端游离的磷酸基团；基团；基团；
28、基团；uu核酸分子被切除前位于已配对的核酸分子被切除前位于已配对的核酸分子被切除前位于已配对的核酸分子被切除前位于已配对的DNADNA双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋区段上；区段上；区段上；区段上；uu被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸氧核苷酸氧核苷酸氧核苷酸5-3外切酶活性外切酶活性50uuDNA聚合酶聚合酶的的重要用途是用于重要用途是用于缺口平移法制备缺口平移法制备核酸的杂交探针。核酸的杂交探针。5152.Klenow片段片段uuKlenow片段具有片段具有DNA聚合酶聚合
29、酶的聚合酶活性的聚合酶活性和和3-5外切酶活性外切酶活性补平补平3凹端凹端DNA。使用单纯的。使用单纯的DNA合成活性。注意要加足够的合成活性。注意要加足够的dNTP；如果；如果使用带标记的使用带标记的dNTP，则可对，则可对DNA进行末进行末端标记。端标记。53抹平抹平DNA3凸端。在凸端。在35外切活性外切活性作用下，可切除突出的作用下，可切除突出的3凸端。注意必须凸端。注意必须加足量加足量dNTP，否则外切活性不会停止。，否则外切活性不会停止。54用于用于Sanger双脱氧末端终止法进双脱氧末端终止法进行行DNA序列分析序列分析在在cDNA克隆中合成第二链克隆中合成第二链在单链模板上延伸
30、寡核苷酸在单链模板上延伸寡核苷酸55.T4DNA聚合酶聚合酶5353的的的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核酸的核酸的核酸的核酸外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性在无在无在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何时，可以从任何时，可以从任何3-OH3-OH端外切端外切端外切端外切在只有一种在只有一种在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸时，外切至互补核苷酸时，外切至互补核苷酸时，外切至互补核苷酸暴露时停止暴露时停止暴露时停止暴露时停止在四种在四种在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导均存在时，聚合活性占主导
31、均存在时，聚合活性占主导均存在时，聚合活性占主导地位地位地位地位56T4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：DNA片段的片段的同位素末端标记同位素末端标记5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5T4-DNApol5G-C-T-C-A-G-C-T-G33T-C-G-A-C-C-T-C-A5T4-DNApolMg2+5pppdNTPa-32P-dATP5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5575G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G35G
32、-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C53C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C5T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5G-C-T-C-OHP-G-G-A-G35G-C-T-C-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-PHO-C-C-T-C53C-G-A-G-PHO-C-C-T-C5T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的内切酶产生的3粘性末端粘性末端58.T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核酸的核酸外切酶活性
33、外切酶活性已知已知DNA聚合酶中持续合成能力最强聚合酶中持续合成能力最强改造后成为双脱氧终止法对长片段改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的的测序酶测序酶59uuT7噬菌体噬菌体DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：用于拷贝长段模板的引物延伸反应用于拷贝长段模板的引物延伸反应通过补平或交换（置换）反应进行快速通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记末端标记60.耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）uuTaq酶的特点：酶的特点：热稳定性热稳定性离子依赖性离子依赖性5-3聚合酶活性和聚合酶活性和5-3外切酶活性。外切酶活性。在聚合链末端不依赖模板多聚合出在聚合链末端不依赖模板多聚合出
34、一个腺苷（一个腺苷（A）61uu是一种依赖是一种依赖RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。uu商品反转录酶有两种商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。来自能表达来自能表达Moloney鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV反转录酶的基因已克隆到反转录酶的基因已克隆到E.coli中表达中表达二、反转录酶二、反转录酶62(1)5-3聚聚合合酶酶活活性性,能能以以RNA或或DNA模模板合成板合成DNA分子；分子；(2)RNA酶酶H活活性性，对对RNA:DNA杂杂交交体体中中的的RNA特特异异性性地地降降解解，免免除除了了在在反反转转录录完成后再用完成后再用NaOH降解降解RN
35、A模板的步骤。模板的步骤。主主要要用用途途：将将mRNA转转录录成成cDNA以以制制备基因片段。备基因片段。633 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo (dT) oligo (dT) 12-1812-18反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶MgMg2+2+ dNTP dNTP3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNA64反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA
36、3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA3355反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶5 DNA5 DNA33uu反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：双向外切双向外切DNA-RNA杂合杂合链中的链中的RNA链链5365666.4DNA修饰酶修饰酶（一）末端脱氧核苷酸转移酶（一）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）uu简称末端转移酶简称末端转移酶uu来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺uu特点：特点：末端转移酶是一类不依赖于末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的模板的DNA聚合酶。聚合酶。在没有模板链的情况下，可以非特异性的在没有模板链的情况下，可以非特异性的将核苷酸连接到将核苷酸连接到dsDNA或或ssDNA的
37、在的在3-OH。可以同聚物加尾可以同聚物加尾67如果以如果以如果以如果以dATPdATP或或或或dGTPdGTP为同聚物加尾反应的底为同聚物加尾反应的底为同聚物加尾反应的底为同聚物加尾反应的底物则以物则以物则以物则以MgMg2+2+为首选；为首选；为首选；为首选；如果以如果以如果以如果以dTTPdTTP或或或或dCTPdCTP为同聚物加尾，则必需为同聚物加尾，则必需为同聚物加尾，则必需为同聚物加尾，则必需有有有有CoCo2+2+存在。存在。存在。存在。5p3HOOH3p5TdTTdTMgMg2+2+dATPdATP5p3AAAAAAAAAAAA3p568uu主要用途：主要用途：用于克隆用于克隆
38、DNA片段：平末端片段：平末端DNA片段的片段的末端加尾连接法末端加尾连接法用于用于DNA片段片段3末端标记末端标记69平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法33553355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA连接酶连接酶70（二）（二）T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶uu基本特性：催化基本特性：催化ATP的的-磷酸基转移到在磷酸基转移到在DNA或或RNA的的5-OH末端，使末端，使5末端重新磷酸化。末端重新磷酸化。uu用于标记用于标记DNA或或RNA的的5末端末端715OHOH5
39、335PP533T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶ATP单链或双链单链或双链DNA或或RNAA、正向反应、正向反应：足够的酶和：足够的酶和ATP存在，平末端、存在，平末端、5凹陷末端和双链凹陷末端和双链DNA的切（烈）口都能磷的切（烈）口都能磷酸化酸化725P P5335PP533单链或双链单链或双链DNA或或RNAT4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶ATP过量过量ADPB、交换反应、交换反应：过量：过量ADP存在时，存在时，DNA分子的分子的5磷酸转移给磷酸转移给ADP，然后从，然后从ATP那里获得那里获得-32P基团基团73uu能催化核酸分子脱掉能催化核酸分子脱掉5的磷酸基团，从
40、而使的磷酸基团，从而使DNA（或（或RNA）片段的）片段的5-P末端转换成末端转换成5-OH末端。末端。uu来源：来源：从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶(BacterialAlkalinePhosphatase)简称简称BAP，具耐热性；，具耐热性；从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶(CalfIntestinalAlkalinePhosphatase)，简称，简称CIP，70可灭活，使用更可灭活，使用更广泛。广泛。（三）碱性磷酸酶（三）碱性磷酸酶74uu其主要用途有：其主要用途有：在用在用32P标记标记DNA5端之前，去除端之前
41、，去除5端的磷；端的磷；在在DNA重组技术中，去除重组技术中，去除DNA片片段的段的5磷酸，防止载体的自身环化，磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。提高重组子比例。7576uu外切核酸酶：从多核苷酸链的末端开始逐个外切核酸酶：从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。降解核苷酸的酶。uu分类：分类：作用于单链的外切核酸酶作用于单链的外切核酸酶作用于双链的外切核酸酶作用于双链的外切核酸酶6.5外切核酸酶外切核酸酶7778一、大肠杆菌外切核酸酶一、大肠杆菌外切核酸酶VII（exoVII）uu反应不受二价阳离子影响反应不受二价阳离子影响，不需要，不需要Mg2+uu从单链从单链DNA的两端同时消
42、化的两端同时消化DNA79二、大肠杆菌外切核酸酶二、大肠杆菌外切核酸酶（exo）uu催化双链催化双链DNA从从3-OH末端开始水解末端开始水解uu可以作用平末端、可以作用平末端、3凹陷末端或有缺口的凹陷末端或有缺口的DNAuu不能水解单链不能水解单链DNA和和3末端突出的双链末端突出的双链DNA80uu应用：应用：与与Klenow配合使用，制备放射性配合使用，制备放射性探针或探针或3标记标记55-OHOH -55-OHOH -exo81A产生平末端或产生平末端或or3凹端凹端B产生产生3突出端突出端AdigestionBdigestionAexoIIIBBBBBBS1nucleaseKleno
43、wfragment重新连接重新连接TransformationE.coliTargetsequenceUniversalprimerABexoIII可以构建单向可以构建单向缺失缺失Activity!826.6 单链内切核酸酶一、一、S1核酸酶核酸酶S1核酸酶来源于米曲霉，它可以降解单核酸酶来源于米曲霉，它可以降解单链链DNA和和RNA，产生，产生5磷酸化单核苷酸磷酸化单核苷酸或寡聚核苷酸。或寡聚核苷酸。ZnZn2+2+必需必需必需必需最适最适最适最适pHpH范围为范围为范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要需要需要NaCl0.10.4mol/LNaCl0.10.4mol/L降解单链降
44、解单链降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快快快7500075000倍倍倍倍83活活性性：可可以以降降解解单单链链DNA或或RNA或或双链的单链区。双链的单链区。ssDNA或或RNA53SI酶、酶、Zn2+、pH4.55dNMPs或或5rNMPsSI酶、酶、Zn2+、pH4.5+带缺口的带缺口的DNA或或RNASI酶、酶、Zn2+、pH4.5黏性末端黏性末端平末端平末端84uuS1核酸酶的重要用途：核酸酶的重要用途：去除去除DNA片段的单链突端，使之成为平端片段的单链突端，使之成为平端去除去除cDNA合成时形成的发夹结构合成
45、时形成的发夹结构成熟成熟mRNA与基因组与基因组DNA杂交后，结合此杂交后，结合此酶水解，可定位内含子酶水解，可定位内含子S1核酸作图法可测定杂交核酸分子的杂交核酸作图法可测定杂交核酸分子的杂交程度程度85二、二、Bal31核酸酶核酸酶uu来源：从埃氏互生单胞菌来源：从埃氏互生单胞菌BAL31中分离中分离uu活性：活性：对单链对单链DNA具有内切酶活性具有内切酶活性对双链对双链DNA具有具有35和和53的外切活性的外切活性对两端的水解速度不一定相等对两端的水解速度不一定相等对两端的水解速度不一定相等对两端的水解速度不一定相等产生产生产生产生5 5 5 5- - - -单磷酸核苷和缩短的单磷酸核
46、苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的ds-DNAds-DNAds-DNAds-DNAuu具有核糖核酸酶的作用，催化核糖体和具有核糖核酸酶的作用，催化核糖体和tRNAtRNA的降解的降解86CaCa2+2+ssDNAorRNA5dNMPs或或5NMPsCaCa2+2+CaCa2+2+Bal31核酸酶的活性核酸酶的活性加入螯合剂加入螯合剂EGTA（乙二醇双（乙二醇双-氨基乙醚四乙酸）终止反应。氨基乙醚四乙酸）终止反应。87三、脱氧核糖核酸酶三、脱氧核糖核酸酶（DNase）uu有有Mg2+存在时，能在双链存在时，能在双链DNA上随机独立上随机独立地产生切口；地产生切口；uu在在Mn2+存在
47、时，能在双链存在时，能在双链DNA的大致同一的大致同一位置切割产生平末端位置切割产生平末端DNA片段片段88应用：应用：uu与大肠杆菌与大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶联合参与切口平移联合参与切口平移法标记法标记DNA分子分子uu在在Mn2+存在下，随机裂解双链存在下，随机裂解双链DNA分子，分子，构建大片段插入的基因组文库构建大片段插入的基因组文库uu用于用于DNase足迹法分析足迹法分析DNA结合蛋白在结合蛋白在DNA上的精确结合部位上的精确结合部位uu使用无使用无RNase的的DNase去除转录产物中的模去除转录产物中的模板板DNA89一、核糖核酸酶一、核糖核酸酶A（RNaseA）来源：牛胰脏
48、来源：牛胰脏活性：切割胞嘧啶（或尿嘧啶）与相邻核苷活性：切割胞嘧啶（或尿嘧啶）与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是嘧啶酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是嘧啶3磷酸和末端带嘧啶磷酸和末端带嘧啶3磷酸的寡核苷酸。磷酸的寡核苷酸。反应条件极宽，极难失活，具有热稳定性反应条件极宽，极难失活，具有热稳定性6.7 RNA酶90低盐溶液下（低盐溶液下（0-100mmol/LNaCl），），RNaseA切切割单链或双链割单链或双链RNA，也能切割，也能切割DNA：RNA杂合杂合体中的体中的RNA；高盐溶液下（高盐溶液下（300mmol/LNaCl）水解单链）水解单链RNA去除去除RNaseA要用蛋白酶要用
49、蛋白酶K处理，再用酚处理，再用酚/氯仿反氯仿反复抽提复抽提降解降解DNA样品中的样品中的RNA，需使用无，需使用无DNA酶的酶的RNase91uu应用：应用：去除去除DNA：RNA或或RNA：RNA杂合杂合体中未杂合的体中未杂合的RNA区域；区域；降解降解DNA中中RNAase分子分子确定确定DNA（或（或RNAase）中单碱基突）中单碱基突变的位置。变的位置。92二、核糖核酸酶二、核糖核酸酶H（RNaseH）uu特异性降解特异性降解DNA：RNA杂合链中的杂合链中的RNAuu不能降解单链或双链的不能降解单链或双链的DNA（或（或RNA）uu应用：与应用：与E.coliDNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶一起参与一起参与cDNA的第二条链的合成的第二条链的合成93水解产生含水解产生含5磷酸基的产物磷酸基的产物水解产生含水解产生含3磷酸基的产物磷酸基的产物94
