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1、遗 传 学数理与生物工程学院第七章细菌和病毒的遗传学分析n n细菌和病毒在遗传研究中的优越性细菌和病毒在遗传研究中的优越性n n细菌的遗传分析细菌的遗传分析* *n n噬菌体的遗传分析噬菌体的遗传分析一一 细菌和病毒在遗传研究中的优越性细菌和病毒在遗传研究中的优越性n繁殖世代所需时间短；繁殖世代所需时间短；n易于管理和进行化学分析；易于管理和进行化学分析；n遗传物质较简单，便于用作研究基因结构、遗传物质较简单，便于用作研究基因结构、功能及调控机制的材料。功能及调控机制的材料。 n便于研究基因的突变；便于研究基因的突变；n便于研究基因的作用；便于研究基因的作用；n可作为研究高等生物的简单模型；可
2、作为研究高等生物的简单模型；二 细菌的接合与染色体作图1.接合现象的发现细菌的接合首先是莱德伯格（ Lederberg ）和塔特姆（ Tatum ）在1946大肠杆菌杂交试验中发现的。a+bab+a+b+问题：得到的重组子ab的频率很低（10-7）和回复突变频率相近（10-6），两者难以区别。莱德伯格解决方法：采用了大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株的两个营养缺陷型品系：品系品系A met bio thi leu thr 品系B met bio thi leu thr 接合现象 质疑：细菌的杂交实验获得重组子可能原因： 1950年戴维斯（Davis）设计了一种U型管实验，证
3、实了A和B菌株之间确实是发生了杂交。n细菌的杂交实验获得的重组子可能是转化的结果。n培养基中含有某些代谢产物，混合后这些产物互相补充了对方的不足而得以在基本培养基上生长。结论:原养型不是转化或互养产生的;两菌株细胞的直接接触是产生原养型菌株的前提。 2.海斯（W.Hayes）的实验（1952）海斯在重复莱德伯格和泰特姆的细菌杂交实验之前，分别用高剂量的链霉素来处理A菌株和B菌株。 A Str B出现原养型菌落 A B Str 不出现原养型菌落基本培养基+str大肠杆菌的两种类型Hayes(1952)研究表明：n大肠杆菌两种不同菌株(品系)接合过程中遗传物质的转移是单向的；n从而认为大肠杆菌存在
4、两种类型：雌性与雄性，分别作为接合过程中遗传物质的受体与供体。3.致育因子（fertility factor，F）细菌染色体外的一个决定细菌雄性性别的共价环状DNA分子，称为致育因子 (fertility factor)，又称为F因子或F质粒。n携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F表示。n未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F表示。致育基因(fertility gene):(接合转移区)配对区(pairing region):(重组区)F因子结构原点(origin):(复制区)细菌含有F因子，并且F因子通过交换整合到主染色体上，这样的细菌叫Hfr细菌。Hfr的主染色体进入F-中的频率高，比F
5、+F-高1000倍。Hfr细菌（高频重组菌株）F+、F-和Hfr菌株4.供体将F因子传递给受体的过程接合管形成n直接将F因子通过接合管传递给受体菌nF因子整合到细菌染色体后通过接合管传递给受体菌5.低频重组与高频重组低频重组(low frequency recombination）： F+与F-的杂交中，F因子的转移频率很高，但供受体细菌染色体的重组频率却很低，约为10-6，因此F+品系称为低频重组品系(菌株)。 F因子整合到了细菌染色体上，与F-细胞接合后将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同的遗传标记时，可观察到它们之间发生重组，频率可达到10-2以上，称
6、为高频重组品系（菌株）高频重组(High frequence recombination, Hfr)Hfr和F+的异同相同n都能和F-进行杂交产生重组后代；n杂交时都要通过接合管和受体菌相连接；n用高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。不同n产生的重组子频率不同；10-4，10-7n F+F-后代常为F+，而HfrF-后代绝大多数为F- ；n F+ 经吖啶橙处理后会变成F-，Hfr经吖啶橙处理后仍为Hfr。6.6.部分二倍体：部分二倍体：当当HfrHfr菌的部分染色体进入菌的部分染色体进入F F细胞后，细胞后，F F细胞中细胞中就成为部分二倍体（就成为部分二倍体（parti
7、al diploidpartial diploid）或部分合子）或部分合子（merozygotemerozygote）。）。外基因子内基因子7.细菌重组的特点 供体DNA片段受体细胞染色体细胞死亡n只有偶数次的交换才能保持细菌染色体的完整性，产生有活性的重组子。n偶数次交换得到的重组子只有一种类型，相反重组子是一个线状片段，不能复制，随着细胞分裂而丢失8.中断杂交与重组作图雅科(Jacob，F)和沃尔曼 (Wollman，E.)在五十年代设计了一个著名的中断杂交试验(interrupted mating experiment)。他们采用的菌株基因型为：Hfr: thr+ leu+ azis t
8、ons lac+ gal+ strsF: thr leu azir tonr lac gal- strr中断杂交的过程n上述事实说明，Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F菌株的，染色体从原点以直线方式进入F细胞。基因位点离原点愈近，进入F细胞愈早，反之则晚。n根据中断杂交的实验，用Hfr基因在F细胞中出现的时间为标准，可以作出大肠杆菌的遗传连锁图。 8 8.5 9 11 18 25 gal用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验所作出的大肠杆菌基因连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序大不相同。重组作图 当转移时间间隔在两分钟之内， 如已知lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，中断杂交作图就不
9、可靠，须用传统的重组作图(recombination mapping)(1)不用亲本类型 (2)两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。(3)部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。(4)接合重组不产生相反的重组类型 接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别）紫红色菌落：lac+ade+ 780（亲本型）白色或粉红色菌落：lac- ade+ 220（重组型）Hfr: lac+ade+strs X F-: lac-ade-strr 混合混合60min F-：ade+strr 1000 MM+str影印影印EMBlac- ade+ strrlac+ ade+ strrlac+
10、 ade+ strs lac- ade- strrlac- ade- strslac+ ade+ strs lac- ade- strrlac+ ade- strsn重组子的产生n重组频率的计算RFlac-ade = *100% lac-ade+ lac+ade+lac-ade+ = *100%=22%=22cM 220 1000 1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cM三 细菌转化 是指某些细菌(或其他生物)能通过其细胞膜摄取周围供体(donor)的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。1.转化(transformation) 大部分的转化工作是用肺炎双球
11、菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)进行的。n受体细胞的生理状态-感受态：感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态。以大肠杆菌为例，如用Ca2+(如Cacl2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。2.转化应具备的条件nDNA片段的大小，形态和浓度大小：肺炎双球菌转化(800bp); 枯草杆菌的转化(16KB)。形态：双链浓度：在细胞膜上感受位点未饱和前，浓度和转化率
12、成正比n外源DNA片段与受体DNA的同源程度3 转化的过程n供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合(binding)结合发生在受体细胞特定部位；结合过程是一个可逆过程。nDNA的穿入和摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA；往往只有一条DNA单链进入细胞，另一条链在膜上降解。n联会(synapsis)与外源DNA片段整合(integration)：整合就是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，稳定地掺入到受体DNA中的过程。整合是一个遗传重组的过程。n杂合DNA复制后，形成一个亲代类型的DNA和一个重组类型的DNA并导致转化细胞的形成与表达。转化的进程4
13、 共转化与遗传图谱绘制共转化：供体的一条DNA片段上的两个基因同时转换的现象。利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：n相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。n因此可能通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。DNADNA浓度浓度下降比率下降比率A A转化率下转化率下降比率降比率B B转化率转化率下降比率下降比率A A与与B B共转化共转化率下降比率率下降比率A A与与B B关系关系1/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/21/2连锁连锁连锁连锁1/21/21/21/2
14、1/21/21/21/21/21/21/21/21/41/41/41/4不连锁不连锁不连锁不连锁判断两个基因是否连锁例如：黎德伯格等人用枯草杆菌:以trp2+ his2+ tyr1+为供体，以trp2- his2- tyr1- 为受体进行转化，结果如表trp2+ his2+ tyr1+trp2- his2- tyr1- 转化子数转化子数转化子数转化子数( ( ( (重组体数重组体数重组体数重组体数) ) ) ) 亲组合数亲组合数亲组合数亲组合数+ + + +转化子数转化子数转化子数转化子数 (+ -)+(- +)(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(
15、- +) 重组值重组值= = = =计算重组率及作图RF(trp2his2) =34%RF( trp2tyr1) =40%RF( his2tyr1) =13%四 性导 F因子整合到宿主细菌染色体的过程是可逆的，当发生环出(looping out)时，F因子又重新离开染色体。然而F因子偶然在环出时不够准确，它携带有染色体的一些基因。F-plasmidHfrchromosomeaF-plasmidRecombinationpointachromosomewith deletiona这种带有宿主染色体基因的F因子称为F因子。性导(sexduction)：是指接合时由F因子所携带的外源DNA转移到细菌
16、染色体的过程。性导的遗传重组nF因子以极高的比率转移它的基因，如同F +细菌以极高的比率转移它的F +因子一样；nF因子有极高的自然整合率，而且整合在一定的座位上，因为它有与细菌染色体的同源区段。 F因子使细菌带有某些突出的特点：n不同的F因子带有不同的细菌DNA 片段，利用不同的F的性导可以测定不同基因在一起转移的频率。n观察由性导形成的杂合部分二倍体中某一性状的表现，可以确定这一性状的等位基因的显隐关系。n性导形成的部分二倍体也可用作互补测验，确定两个突变型是同属于一个基因还是不同基因。性导在大肠杆菌的遗传学研究中意义：互补测验：根据基因的功能确定两个基因是否等位的测验方法。互补作用：两个
17、突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合子时，野生型基因补偿突变基因的缺陷而使表型恢复正常。否则，两种突变型一定具有相同的功能损伤。顺式构型：两个突变分别位于一同源染色体上的基因组合。反式构型：两个突变分别位于两条同源染色体上的基因组合。病毒分三类：植物病毒、动物病毒和噬菌体。噬菌体:指侵染细菌、放线菌以及真菌的病毒。包括温和、烈性两种。单一核酸分子（DNA或RNA）称为基因带或染色体。五 噬菌体的遗传学分析1.噬菌体的结构和形态T噬菌体的结构蛋白质外壳核酸2 噬菌体的繁殖和感染周期烈性噬菌体: 如T噬菌体吸附细菌裂解,释放出子代噬菌体颗粒细菌染色体降解噬菌体DNA和蛋白质外壳包装成子代噬菌体
18、颗粒烈性噬菌体的感染周期噢，一只倒霉的大肠杆菌遇了细菌病毒T4噬菌体！ 病毒马上抓住猎物不放，但是大肠杆菌体积是病毒的1000倍。病毒怎么办呢？T4 噬菌体的生命旅程请看： 病毒的蛋白质外壳发挥作用，将病毒的核酸物质注入大肠杆菌体内，请注意病毒的外壳最后会被弃在寄主体外。左图：病毒核酸链接入到寄主核酸链中左图：病毒核酸链接入到寄主核酸链中右图：病毒核酸链指挥大量复制自己右图：病毒核酸链指挥大量复制自己 病毒的核酸链（蓝色部分）经过一系列作用，接入寄主的核酸链（橙色部分）中，进而控制寄主的生命活动。利用寄主本身的营养物质复制出成千上万的病毒核酸，同时新产生的病毒核酸链（黄色部分）又指挥寄主的细胞
19、，利用寄主的营养物质大量地生产病毒外壳蛋白质，最后把外壳与病毒核酸一起装配成完整的新病毒。最后: 大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程 随着时间的推移，细菌的数量变得越来越少，这是因为它们被细菌病毒杀死了，这种现象也称为“溶菌”现象。温和噬菌体吸附溶菌周期-uv诱导细菌裂解溶源周期原噬菌体如噬菌体: 温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的基因组上，并随后者的复制而进行同步复制，因此，这种温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，此即称溶源性或溶源现象。溶源性（溶源性（lysogenylysogeny）原噬菌体（prophage） 当温和噬菌体侵入其敏
20、感宿主的细胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因组（genome，即核染色体）上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作原噬菌体（prophage）。 凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体，而其宿主就称溶源菌。 溶源菌是一类能与温和噬菌体长期共存，一般不会出现有害影响的宿主细胞。溶源菌（lysogen或lysogenic bacteria）温和噬菌体的溶源性反应：温和噬菌体的溶源性反应：3 噬菌体的突变型n条件致死突变型: (1). 温度敏感突变 (2). 抑制因子敏感突变n宿主范围突变型: E.coli B E.coli B2 E.coli B+E.coli B2 h+ + - 半透明噬菌斑 h-
21、+ + 透明噬菌斑n噬菌斑形态突变型:(1). r+ 小噬菌斑,边缘模糊(2). r- 大噬菌斑,边缘清晰: 快速溶菌(rapid lysis)4 烈性噬菌体与基因定位双重感染：是指用两种噬菌体同时感染某一菌株。例如：噬菌体：hr+即能感染B和B2菌株产生噬菌斑小而边缘模糊，即透明、小噬菌斑。噬菌体：h+r能感染B株，产生约大两倍的边缘清楚的噬菌斑，即为半透明、大的噬菌斑。用hr+和h+r两种噬菌体同时感染B株，进行双重感染 。hr 半透明，大 42hr 半透明，小 12hr 透 明，小 34hr 透 明，大 12重组率=(h+r+h-r-) 100% 总噬菌斑数T2 phage重组试验结果有
22、四种可能的排列顺序六 转导 (transduction)以噬菌体为媒介，把某一细菌的DNA转移到另一细菌，进行基因重组的过程。转导的遗传重组n普遍性转导普遍性转导 (generalized transduction)(generalized transduction)：供体的任何一个基因都可能被转移，且几率相供体的任何一个基因都可能被转移，且几率相等。等。n局限性局限性( (特异性特异性) )转导转导 (specialized transduction) (specialized transduction) ：噬菌体只把细菌基因组中特定部分的基因整合噬菌体只把细菌基因组中特定部分的基因整合到自己的到自己的DNADNA中，并传递给受体的过程。中，并传递给受体的过程。n n采集志愿者的少量静脉血（35毫升）， EB病毒转化B淋巴细胞为永生细胞，经过技术处理的数千株细胞被保存在零下196摄氏度的液氮中，在需要的时候将冻存的细胞复苏，可以保存志愿者基因供永久性研究。
