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1、质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化1技能教育内 容n n一.质粒的概念和提取原理n n二.碱裂解法的实验操作和原理n n三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理n n四.实验室使用的方法n n五.质粒纯化后的检测2技能教育一.质粒的概念和提取原理n n质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有
2、它们也可以正常存活 .3技能教育一.质粒的概念和提取原理n n质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control)4技能教育一.质粒的概念和提取原理n n在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚
3、、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 5技能教育实验中使用的三个溶液n n1,溶液： 葡萄糖葡萄糖使使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部. . Tris.Cl (pH8.0)提供反应的最佳环境提供反应的最佳环境. . EDTA (pH8.0) Ca2+Ca2+和和Mg2+Mg2+等二价金属离子的螯合等二价金属离子的螯合剂剂,抑制抑制DNase(DNase(脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶) )的活性和抑制微生物生长的活性和抑制微生物生长. 6技能教育实验中使用的三个溶液2,溶液：NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释) 1 SDS 注注:
4、:要新从浓要新从浓NaOHNaOH稀释制备稀释制备NaOHNaOH，是为了保证，是为了保证NaOHNaOH没有吸收空没有吸收空气中的气中的COCO2 2而减弱了碱性而减弱了碱性. NaOHNaOH细胞膜发生了从细胞膜发生了从bilayerbilayer（双层膜）结（双层膜）结构向构向micellemicelle（微囊）结构的相变化（微囊）结构的相变化,瞬间就溶解瞬间就溶解. 当然当然SDSSDS也是碱性的也是碱性的, ,但是很弱但是很弱, ,只能抽提得到少量质粒只能抽提得到少量质粒 . .7技能教育实验中使用的三个溶液3,溶液： KAc 冰醋酸 ddH2O注注: :冰醋酸的作用是为了中和过量的
5、冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH.NaOH.KAcKAc是提供是提供K K+ +和和SDSSDS反应反应, ,取代取代NaNa离子离子, ,形成十二烷基硫酸钾形成十二烷基硫酸钾 (PDS),(PDS),而而PDSPDS是难溶于水的是难溶于水的. SDS. SDS易和蛋白质结合，平均两易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个个氨基酸上结合一个SDSSDS分子，钾钠离子置换所产生的大分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了 , ,同时长长的基因同时长长的基因组组DNADNA也一起被共沉淀了也一起被共沉淀了. .但是但是SDSSDS并不与并
6、不与DNADNA分子结合分子结合 . .8技能教育二，碱裂解法的操作步骤n n1,1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液, ,高速离心高速离心, ,弃上清弃上清, ,将离心管倒置使上清液全部流尽。将离心管倒置使上清液全部流尽。 2, 2, 加入溶液加入溶液I, I,充分悬浮菌体细胞。充分悬浮菌体细胞。 3,3,加入新配制的溶液加入新配制的溶液II, II, 盖紧瓶盖盖紧瓶盖, ,缓缓地颠倒离心缓缓地颠倒离心管数次管数次, ,以充分混匀内容物以充分混匀内容物, ,冰浴冰浴5 5分钟。分钟。 4,4,加用冰预冷的溶液加用冰预冷的溶液III, III,
7、摇动离心管数次以混匀内摇动离心管数次以混匀内容物容物, ,冰上放置冰上放置1515分钟分钟, ,此时应形成白色絮状沉淀。此时应形成白色絮状沉淀。5,45,4下离心下离心1515分钟。分钟。 9技能教育二，碱裂解法的操作步骤n n6,6,取上清液取上清液, ,加入加入 RNARNA酶酶A, 37A, 37水浴水浴2020分钟。分钟。 7,7,加入等体积的饱和酚加入等体积的饱和酚/ /氯仿氯仿, ,振荡混匀振荡混匀,4,4下高速离心下高速离心1010分钟。分钟。 8,8,取上层水相取上层水相, , 加入等体积氯仿加入等体积氯仿, ,振荡混匀振荡混匀,4,4下高速离心下高速离心1010分钟。分钟。9
8、,9,取上层水相取上层水相, ,加入加入2 2倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇 , ,室温放置几分钟室温放置几分钟 , ,离心。离心。 10,410,4下高速离心下高速离心1515分钟分钟, , 沉淀用数沉淀用数ml 70%ml 70%冰冷乙醇洗涤冰冷乙醇洗涤,4,4下高速离心下高速离心5 5分钟。分钟。 11,11,吸除上清液吸除上清液, ,将管倒置于卫生纸上使液体流尽将管倒置于卫生纸上使液体流尽, ,真空干燥真空干燥1010分钟或室温干燥分钟或室温干燥 。 12,12,得到的质粒样品一般用得到的质粒样品一般用TETE缓冲液或者缓冲液或者ddHddH2 2O O进行溶解进行溶解. .10技能
9、教育注意的事项n n一一, ,在加溶液在加溶液后后: :. .时间不能过长，因为在这样时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组的碱性条件下基因组DNADNA片断会慢慢断裂；片断会慢慢断裂；. .必必须温柔混合须温柔混合, ,不然基因组不然基因组DNADNA也会断裂。也会断裂。n n二二, ,加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净, ,否则对否则对后面的实验有影响后面的实验有影响. .n n三三, ,沉淀沉淀DNADNA也可用异丙醇也可用异丙醇( (一般使用等体积一般使用等体积), ),且沉且沉淀完全淀完全, ,速度快速度快, ,但常把盐沉淀下来但常把盐沉淀下来,
10、 ,所以多数还是所以多数还是用乙醇。用乙醇。 n n四四, ,提取质粒提取质粒DNADNA过程中除去蛋白很重要过程中除去蛋白很重要, ,采用酚采用酚/ /氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好, ,要将蛋白要将蛋白尽量除干净需多次抽提尽量除干净需多次抽提 . .11技能教育三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤 n n（1 1） 将将 2ml 2ml 含相应抗生素的含相应抗生素的 LB LB 培养基加入到容量为培养基加入到容量为 15ml 15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在 37 37 剧剧烈震荡（烈震荡（ 250rp
11、m 250rpm ）培养过夜。）培养过夜。 （2 2） 将将 1.5ml 1.5ml 培养物转入离心管中，在培养物转入离心管中，在 4 4 条件下离心条件下离心 30 30 秒。秒。 （3 3） 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 200 m l STET 缓冲液（缓冲液（ 8% 8% 蔗糖，蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris ） ，用涡旋混合器充分混匀
12、。，用涡旋混合器充分混匀。 （4 4） 加入加入 4 m l 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下 5min 5min 。 （5 5） 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时 45 45 秒，取出后立刻离心秒，取出后立刻离心 10min 10min 。 12技能教育三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤n n（6 6） 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入上清液中加入 8 m l 5%CTAB(8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨十六烷基三甲
13、基溴化氨) ) ，用混合器混匀后，高速离心用混合器混匀后，高速离心 5min 5min ，弃上清液，用滤纸吸，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。干离心管中的液体。 （7 7） 加入加入 1.2M 1.2M 氯化钠氯化钠 300 m l 300 m l ，充分溶解沉淀物，再，充分溶解沉淀物，再加入加入 750 m l 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min 15min ，弃，弃上清液。上清液。 （8 8） 取取 1ml 70% 1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管
14、壁上的液体，置室温中。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥使核酸沉淀自然干燥 5-10min 5-10min 。 （ 9 9 ） 沉淀物溶于沉淀物溶于 50 m l TE 50 m l TE 缓冲液中，缓冲液中， 混合器混匀混合器混匀 。 （1010） 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用. .13技能教育四，实验室使用的操作步骤n n1,1,取取1.5ml1.5ml含细菌的培养液含细菌的培养液, ,离心离心, ,弃上清弃上清, ,将离心管将离心管倒置使上清液全部流尽。倒置使上清液全部流尽。 n n2,2,加入溶液加入溶液
15、I, I,充分悬浮菌体细胞。充分悬浮菌体细胞。n n 3,3,加入新配制的溶液加入新配制的溶液II, II, 盖紧瓶盖盖紧瓶盖, ,缓缓地颠倒离缓缓地颠倒离心管数次心管数次, ,以充分混匀内容物以充分混匀内容物, ,冰浴冰浴5 5分钟。分钟。n n4,4,加用冰预冷的溶液加用冰预冷的溶液III, III, 摇动离心管数次以混匀内摇动离心管数次以混匀内容物容物, ,冰上放置冰上放置1515分钟分钟, ,此时应形成白色絮状沉淀。此时应形成白色絮状沉淀。 n n5,45,4下离心下离心1515分钟。分钟。14技能教育四，实验室使用的操作步骤n n6,取上清液加新的离心管中.n n7,加入纯化树脂,混匀,放置10min.n n8,将溶液转移到离心纯化柱中,高速离心.n n9,倒掉下管中的溶液,再加80%异丙醇,洗涤两次,每次离心30s,再干甩一次,20min.n n10,将离心纯化柱内管取出,放入新的离心管中,加入30l的ddH2O 洗涤,静置10min,高速离心5min.n n11.离心管中即得到溶于ddH2O的质粒.15技能教育五，质粒纯化后的检测超螺旋开环复制中间体 可能会出现的RNA带注:碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA. 16技能教育
