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1、PCRPCR技术原理及人技术原理及人SRYSRY基因扩增基因扩增 1DNA的结构2DNA的复制模板：基因组模板：基因组DNADNA原料：游离的核苷酸原料：游离的核苷酸 A A、G G、C C、T T催化剂：催化剂：DNADNA聚合酶聚合酶需要的条件：需要的条件：活细胞内的微观环境活细胞内的微观环境3DNA的复制4 体内in vivo 体外in vitroDNA的复制5PCR技术的发明Kary B. Mullis Californian highway6Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNADNA变性变性, ,与适当引物杂交与适当引物杂交, ,再用
2、再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克克隆隆DNADNA的设想。的设想。 19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。 19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大科学发明之首为十余项重大科学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获
3、19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。78PCR技术的特点1 1 1 1 ）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性2 2 2 2 ）特异性）特异性）特异性）特异性3 3 3 3 ）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行4 4 4 4 ）用途广泛）用途广泛）用途广泛）用途广泛30303030轮循环扩增量达轮循环扩增量达轮循环扩增量达轮循环扩增量达2 2 2 230303030个拷贝（个拷贝（个拷贝（个拷贝（101010109 9 9 9拷贝）拷贝）拷贝）拷贝）9生命科学：生命科学：DNADNA重组、转基因生物重组、转基因生物医学工程：基因疫苗、产前诊
4、断医学工程：基因疫苗、产前诊断疾病诊断：艾滋病、禽流感疾病诊断：艾滋病、禽流感法医学：血迹、精斑等痕迹法医学：血迹、精斑等痕迹DNADNA考古学：远古人类、猛犸考古学：远古人类、猛犸DNADNAPCR技术的应用10人的性别决定人的性别决定11人的性别决定人的性别决定 Father Mother22pairs+XY22pairs+XX22+X22+Y22+Xspermegg22pairs+XX22pairs+XY GirlBoy12 1959 1959年生物学家发现年生物学家发现Y Y染色体决定人（和老鼠）的男性特征染色体决定人（和老鼠）的男性特征; ; 1975 1975年，年，Wachtel
5、Wachtel等提出等提出Y Y染色体上有一个组织相容性抗原的基因染色体上有一个组织相容性抗原的基因H-YH-Y和男性决和男性决定有关定有关; ; 1987 1987年年, David Page, David Page认为认为Y Y染色体上一个特定的基因染色体上一个特定的基因ZFYZFY是决定男性的基因是决定男性的基因; ; 1988 1988年年, ,澳大利亚的澳大利亚的SinclairSinclair实验室发现袋鼠类的实验室发现袋鼠类的ZFYZFY基因不在基因不在Y Y染色体上，而染色体上，而是在常染色体上是在常染色体上; ; 1990 1990年，澳大利亚女科学家年，澳大利亚女科学家Ma
6、rshall Graves Marshall Graves 和英国的和英国的Lovell-BadgeLovell-Badge两个实验两个实验室发现另外一个基因室发现另外一个基因SRYSRY。13人的性别决定人的性别决定YSRY男性男性14利用PCR技术检测SRY基因男性，有男性，有SRYSRY阳性结果阳性结果女性，无女性，无SRYSRY阴性结果阴性结果应用：奥运会运动员的性别鉴定应用：奥运会运动员的性别鉴定 犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定 野生动物的性别鉴定野生动物的性别鉴定 男男 女女15 总体积总体积 25 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Pr
7、imer 引物引物 DNA分子分子 模板模板 Taq酶酶 DNA聚合酶聚合酶 反应体系16移液器（移液器（pipettepipette）枪头（枪头（tipstips）反应管（反应管（tubetube）1795 3min95 3min； 94 30s 94 30s、 52 30s 52 30s、 72 30s 72 30s3030个循环；个循环； 72 72 延伸延伸5min. 5min. 18核酸电泳1. 1. 根据欲分离根据欲分离DNADNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电
8、泳缓冲液。称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液。 192. 2. 放入到微波炉内加热熔化放入到微波炉内加热熔化 203.3.冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽槽中，待其凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内内 214.4.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm1mm为宜，如样品孔内有气为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。泡，应设法除去。 225.5.在在
9、DNADNA样品中加入样品中加入1010体积的载样缓冲液（体积的载样缓冲液（loading bufferloading buffer），混匀后，），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内 。236.6.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNADNA样品由负极往正极泳动样品由负极往正极泳动 ( (靠近加样孔的一端为负靠近加样孔的一端为负) )；根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。；根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。 247.7.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置。电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置。 25
