《基因工程的操作过程课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的操作过程课件（104页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章第四章第四章第四章 基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程一、一、一、一、DNADNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）二、重组二、重组二、重组二、重组DNADNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）切切切切接接接接转转转转增增增增检检检检一、一、一、一、DNADNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）的体外
2、重组（切与接）1 1、相同粘性末端的连接、相同粘性末端的连接、相同粘性末端的连接、相同粘性末端的连接2 2、平末端的连接、平末端的连接、平末端的连接、平末端的连接3 3、不同粘性末端的连接、不同粘性末端的连接、不同粘性末端的连接、不同粘性末端的连接4 4、人工粘性末端的连接、人工粘性末端的连接、人工粘性末端的连接、人工粘性末端的连接5 5、酶切位点的定点更换、酶切位点的定点更换、酶切位点的定点更换、酶切位点的定点更换6 6、重组率、重组率、重组率、重组率同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接同尾酶产生的粘端的连接同尾酶产生的粘端
3、的连接同尾酶产生的粘端的连接同尾酶产生的粘端的连接1、相同粘性末端的连接：、相同粘性末端的连接：同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接同种限制酶产生的粘端的连接EcoEcoR IR IGCTTAA 55 AATTCG目的基因目的基因5 GCTTAA 55 AATTCG5 EcoEcoR IR I5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG目的基因目的基因5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG目的基因目的基因同尾酶产生的粘端的连接同尾酶产生的粘端
4、的连接同尾酶产生的粘端的连接同尾酶产生的粘端的连接5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG目的基因目的基因5 TGATCAACTAGT5 5GCCTAG5 GATCCG5 TACTAG 55 GATCAT5 目的基因目的基因BamBamH IH IBclBcl I IT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT目的基因目的基因2、平末端的连接：、平末端的连接：提高平端连接效率的方法：提高平端连接效率的方法：提高平端连接效率的方法：提高平端连接效率的方法： 加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（
5、1010倍于粘端连接倍于粘端连接倍于粘端连接倍于粘端连接, 1-2U, 1-2U）；）；）；）；加大平端加大平端加大平端加大平端DNADNA片段的浓度；片段的浓度；片段的浓度；片段的浓度； 加入加入加入加入10% 10% PEG 8000PEG 8000； 加入加入加入加入单价单价单价单价阳离子阳离子阳离子阳离子( (NaCl)NaCl)，终浓度终浓度终浓度终浓度150-200 150-200 mMmM。1616连接过夜（粘端连接连接过夜（粘端连接连接过夜（粘端连接连接过夜（粘端连接16 4hr16 4hr或或或或44过夜）；过夜）；过夜）；过夜）；3 3、不同粘性末端的连接：、不同粘性末端的
6、连接：、不同粘性末端的连接：、不同粘性末端的连接：两种两种两种两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有55突出末端；突出末端；突出末端；突出末端；两种两种两种两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有33突出末端；突出末端；突出末端；突出末端；两种两种两种两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有2 2个不同的粘性末端。个不同的粘性末端。个不同的粘性末端。个不同的粘性末端。一种一种一种一种DNADNA分子有分子有分子有分子有55突出末端，另一种有突出末端，另一种有突出末端，另一种有突出末端，另一种有33突出末端；突出末端；突出末端；突出末端；可将其可将其转化为平末端转化为平
7、末端后再进行连接。后再进行连接。5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGBamBamH IH IEcoEcoR IR I目的基因目的基因1 1）两种）两种）两种）两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有55突出末端：突出末端：突出末端：突出末端：Klenow Klenow dNTPsdNTPs补平补平补平补平Klenow Klenow dNTPsdNTPs补平补平补平补平5GGATC CCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAG目的基因目的基因T4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5GAATTGA
8、TCCCTTAACTAGGGGATCAATTCCCTAGTTAAG目的基因目的基因CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGPst Pst IISphSph I I目的基因目的基因 T4 DNA pol T4 DNA pol切平切平切平切平 T4 DNA pol T4 DNA pol切平切平切平切平2 2）两种）两种）两种）两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有33突出末端：突出末端：突出末端：突出末端：CGGC5 G C5CG目的基因目的基因T4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5GGCCGG目的基因目的基因CC T4 DNA pol
9、 T4 DNA pol切平切平切平切平Klenow Klenow dNTPsdNTPs补平补平补平补平3 3）一种）一种）一种）一种DNADNA分子有分子有分子有分子有55突出末端，另一种有突出末端，另一种有突出末端，另一种有突出末端，另一种有33突出末端：突出末端：突出末端：突出末端：BamBamH IH IPstPst I I3 5GCCTAG5 GATCCG5 CTGCAG5 GACGTC3 目的基因目的基因T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC目的基因目的基因5 CG5 GC5GGATCCCTAGGATCC5 CTAG
10、G目的基因目的基因4 4）两种）两种）两种）两种DNADNA分子都有分子都有分子都有分子都有2 2个不同的粘性末端：个不同的粘性末端：个不同的粘性末端：个不同的粘性末端：切平切平切平切平 T4 DNA polT4 DNA pol补平补平补平补平 Klenow Klenow dNTPsdNTPs T4 DNA pol T4 DNA pol切平切平切平切平补平补平补平补平 Klenow Klenow dNTPsdNTPs5GCATG 3C 55 GATTC 3G BamBamH IH ISph I5CTGCA 35 AATTCG目的基因目的基因GEcoEcoR IR IPstPst I IC 3G
11、AATCC5 TTAGG目的基因目的基因5G 3C55 GATTCCTAAGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATCCCTTAGG55CGATTCGCTAGC目的基因目的基因4 4、人工粘性末端的连接：、人工粘性末端的连接：、人工粘性末端的连接：、人工粘性末端的连接：55突出末端突出末端突出末端突出末端33突出末端突出末端突出末端突出末端平末端平末端平末端平末端1 1）平末端）平末端）平末端）平末端人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接TdTTdTdATPdATPCAAAAAAAAAA 3 GG3AAAAAAAAAAC目的基因目的基因C
12、3 GG5 GC5CGC3 目的基因目的基因3 3 TdTTdTdTTPdTTPGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTG5 5T4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG目的基因目的基因2 2） 55突出末端突出末端突出末端突出末端人工粘性末端人工粘性末端人工粘性末端人工粘性末端的的的的连接连接连接连接TdTTdTdCTPdCTPGGATCCCCCCCCCTAG5 GATCCCCCCCCCTAGG5目的基因目的基因5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555
13、AATTCGBamBamH IH IEcoEcoR IR I目的基因目的基因5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAG目的基因目的基因TdTTdTdGTPdGTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAG5 5 55T4-DNA ligaseT4-DNA ligase保留两侧的保留两侧的BamH I位点位点BamBamH IH IBamBamH IH I5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG目的基因目的基因Klenow
14、Klenow dNTPs dNTPs补平补平补平补平KlenowKlenow dNTPs dNTPs补平补平补平补平3 3） 3 3 突出末端突出末端突出末端突出末端人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接TdTTdTdGTPdGTPCTGCAGGGGGG 3 GG3GGGGGGACGTC目的基因目的基因CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGPst Pst IISphSph I I目的基因目的基因TdTTdTdCTPdCTPGCATGCCCCCCCC CCCCCCGTACG5 5T4-DNA ligaseT4-DNA ligas
15、eKlenowKlenow、dNTPsdNTPs5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG目的基因目的基因保留两侧的保留两侧的Pst I位点位点PstPst I IPst Pst II5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG目的基因目的基因退火退火退火退火5 5、酶切位点的定向更换、酶切位点的定向更换、酶切位点的定向更换、酶切位点的定向更换KlenowKlenow补平补平补平补平5 5GGATCCCCTAGGB
16、amBamH IH IBamBamH IH IGATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoEcoR IR IGGAATTCCCCTTAAGGEcoEcoR I R I linkerlinker6 6、重、重、重、重 组组组组 率率率率在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%25-75%。 重组率重组率重组率重组率= =含外源含外
17、源含外源含外源DNADNA的重组分子数的重组分子数的重组分子数的重组分子数/ /载体分子总数。载体分子总数。载体分子总数。载体分子总数。重组率是衡量重组率是衡量重组率是衡量重组率是衡量连接反应效率连接反应效率连接反应效率连接反应效率的重要指标。的重要指标。的重要指标。的重要指标。提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：加装同聚尾加装同聚尾。提高外源提高外源DNA片段与载体的分子比：片段与载体的分子比：5:1-10:1；载体载体DNA分子在连接前分子在连接前去除去除5-P；载体载体载体载体DNADNA分子在连接前先去除分子在连接前先去除分子在连接前先去除分子在连接
18、前先去除5-5-P P： T4 DNA ligase5 G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G目的基因目的基因55 G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A GOHHOOHHO目的基因目的基因退火退火CIPCIP5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HOOHP5 G A-A-T-T-CC-T-T-A-A GG A-A-T-T-CC-T-T-A-A G目的基因目的基因5PHOT4-PNP -ATP5GCTTAA 5 AATTCG目的基因目的基因5 GCTTAA P 5EcoR I5 AATTC
19、G5 PEcoR I5GCTTAA 5 AATTCG目的基因目的基因5 GCTTAA P 5EcoR I5 AATTCG5 PCIPCIP5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HOEcoR IT4 DNA ligase5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A GOHHO目的基因目的基因OHPE.coli转化转化加装同聚尾：加装同聚尾：加装同聚尾：加装同聚尾： TdTTdTdGTPdGTPCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTCCTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGTdTTdTdCTPd
20、CTPGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACG5 退火退火退火退火5 5GCATGCCCCCC GG GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseKlenowKlenow、dNTPsdNTPs二、重组二、重组二、重组二、重组DNADNA分子的转化和扩增（转与增）分子的转化和扩增（转与增）分子的转化和扩增（转与增）分子的转化和扩增（转与增）转化技术及其原理转化技术及其
21、原理转化技术及其原理转化技术及其原理转化率转化率转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化：转化：转化：转化： 将将DNA重重组组分分子子导导入入特特定定的的受受体体细细胞胞，使使之之无无性性繁繁殖殖，高高效效表表达达外外源源基基因因，或或直直接接改改变变其其遗遗传传性性状状，这这一一过过程程及及操操作作称称为为DNA重组分子的转化重组分子的转化(transformation)。CaCa2+2+诱导转化法诱导转化法诱导转化法诱导转化法原生质体转化法原生质体转化法原生质体转化法原生质体转化法 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染的转染的转染电穿孔转化法电
22、穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法三亲本杂交转化法三亲本杂交转化法三亲本杂交转化法三亲本杂交转化法1 1、重组、重组、重组、重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞分子导入原核细胞分子导入原核细胞1 1）CaCa2+2+诱导转化法：诱导转化法：诱导转化法：诱导转化法： Ca Ca2+2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，后者经热脉冲发生收缩作用，使
23、细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态称为细菌细胞此时的状态称为细菌细胞此时的状态称为细菌细胞此时的状态称为感受态感受态感受态感受态。 适用于适用于适用于适用于革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌（如（如（如（如E.coliE.coli）。）。）。）。感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞的制备的制备的制备的制备100ml菌体培养至菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体离心收集菌体用用10ml冰冷的冰冷的10mM CaCl2悬浮菌体，离心收集菌体悬浮菌体，离心收集菌体用用1ml冰冷的冰冷的75mM CaCl2悬浮菌体悬浮菌体 冰浴冰浴12-24hr，备用，备用 感受态细胞的转化感
24、受态细胞的转化感受态细胞的转化感受态细胞的转化取取100 l感受态细胞，加入感受态细胞，加入10 l DNA连接液，混匀连接液，混匀 冰浴冰浴0.5hr 42热热 脉脉 冲冲2min快速将转化细胞移至冰浴中快速将转化细胞移至冰浴中1-2min 加入加入1ml新鲜培养基，新鲜培养基，37振荡振荡1hr取转化液涂于合适的固体培养基平板上筛选取转化液涂于合适的固体培养基平板上筛选制备感受态菌必须使用制备感受态菌必须使用对数生长期对数生长期的菌；的菌；必须在冰冷的条件下制备；必须在冰冷的条件下制备；CaCl2悬浮菌体要充分；悬浮菌体要充分；储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下；以下；使用感受态菌
25、时，必须在手里或水浴迅速融化，使用感受态菌时，必须在手里或水浴迅速融化，融化后不能再次冻存使用。融化后不能再次冻存使用。注意事项：注意事项：2 2）原生质体转化法：）原生质体转化法：）原生质体转化法：）原生质体转化法： 革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌（如如枯枯草草杆杆菌菌、链链霉霉菌菌等等）接接纳纳外外源源DNA的的主主要要屏屏障障是是细细胞胞壁壁，常常采采用用原生质体（细胞去壁后形态）转化法。原生质体（细胞去壁后形态）转化法。 也适用于也适用于酵母酵母、真菌真菌、植物细胞植物细胞。细菌原生质体转化流程细菌原生质体转化流程细菌原生质体转化流程细菌原生质体转化流程细菌原生质体的制备细菌原生质体的制备细
26、菌原生质体的制备细菌原生质体的制备 细菌生长于高渗培养基（如细菌生长于高渗培养基（如细菌生长于高渗培养基（如细菌生长于高渗培养基（如34%34%蔗糖溶液）中，蔗糖溶液）中，蔗糖溶液）中，蔗糖溶液）中， 加入甘氨酸以增加细胞壁对加入甘氨酸以增加细胞壁对加入甘氨酸以增加细胞壁对加入甘氨酸以增加细胞壁对溶菌酶溶菌酶溶菌酶溶菌酶的敏感性。的敏感性。的敏感性。的敏感性。 制备过程中，菌体始终悬浮在制备过程中，菌体始终悬浮在制备过程中，菌体始终悬浮在制备过程中，菌体始终悬浮在10.3%10.3%蔗糖等渗溶液。蔗糖等渗溶液。蔗糖等渗溶液。蔗糖等渗溶液。 细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化
27、细菌原生质体的转化 取取取取0.2-10.2-1mlml原生质体，加入原生质体，加入原生质体，加入原生质体，加入10-2010-20 l DNAl DNA连接液，连接液，连接液，连接液，加入含加入含加入含加入含PEG1000PEG1000和和和和CaCa2+2+的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。 细菌原生质体的再生细菌原生质体的再生细菌原生质体的再生细菌原生质体的再生细菌重新长出细胞壁，细菌重新长出细胞壁，细菌重新长出细胞壁，细菌重新长出细胞壁，在含脯氨酸和微量元素的特殊固体培养基上进行。在含脯氨酸和微量元素的特殊固体培养基上进行。在含脯氨酸和微量元素的特
28、殊固体培养基上进行。在含脯氨酸和微量元素的特殊固体培养基上进行。3 3） 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA的转染：的转染：的转染：的转染： 必必必必须须须须先先先先在在在在体体体体外外外外将将将将重重重重组组组组 - -DNADNA包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力的重组噬菌体颗粒。力的重组噬菌体颗粒。力的重组噬菌体颗粒。力的重组噬菌体颗粒。 用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白已已商商品品化化，通通常常为为互互补补两两部部分分：一一部部分分缺缺少少E组组份份，另另一一部部分分缺缺少少D组组份份。当当这这两两部部分分同同时时与与重重组组 -DNA混混合合时时，包包装装才能有
29、效进行。才能有效进行。 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA转染流程转染流程转染流程转染流程感受态细胞的培养感受态细胞的培养感受态细胞的培养感受态细胞的培养 将将将将E.coliE.coli培养至培养至培养至培养至ODOD600600=0.5=0.5。 吸吸 附附加入体外包装好的重组噬菌体，加入体外包装好的重组噬菌体，30保温保温10min。 转染裂解转染裂解 加入加入20倍体积的新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，30培养，直至培养，直至培养液中菌体裂解、培养液澄清度增加，涂板筛选。培养液中菌体裂解、培养液澄清度增加，涂板筛选。4 4）电穿孔转化法）电穿孔转化法）电穿孔转化法）电穿孔转化法(el
30、ectroporation)(electroporation)： 几几几几乎乎乎乎对对对对所所所所有有有有含含含含细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁结构结构结构结构的细胞有效。的细胞有效。的细胞有效。的细胞有效。 将将重重组组DNA加加入入电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池，两两极极施施加加瞬瞬时时高高压压电电场场。在在强强大大电电场场作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜产产生生缝缝隙隙，重重组组DNA分子进入细胞。分子进入细胞。电穿孔转化的流程电穿孔转化的流程电穿孔转化的流程电穿孔转化的流程取重组取重组DNA，加入，加入40 l电转化感受态细菌中电转化感受态细菌中将混合物转入预冷的
31、电转杯中将混合物转入预冷的电转杯中将电转仪调为将电转仪调为1.5kV 25 F，施以电脉冲施以电脉冲4.6ms立即加立即加1ml LB培养液，培养液，37振荡振荡2-4hr取取10-100 l转化液涂于合适的固体培养基平板上筛选转化液涂于合适的固体培养基平板上筛选5 5）三亲本杂交法）三亲本杂交法）三亲本杂交法）三亲本杂交法(triparental mating)(triparental mating)： 被被转转化化的的受受体体菌菌、含含重重组组DNA分分子子的的供供体体菌菌、含含广广泛泛宿宿主主辅辅助助质质粒粒的的辅辅助助菌菌共共培培养养，在在辅辅助助质质粒粒的的作作用用下下，重重组组DN
32、A分分子子被被转转移移到到受受体菌细胞内。体菌细胞内。 当当重重组组DNA分分子子不不能能直直接接转转化化受受体体菌菌时时，可采用三亲本杂交转化法。可采用三亲本杂交转化法。 2、重组、重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞根癌农杆菌介导的根癌农杆菌介导的根癌农杆菌介导的根癌农杆菌介导的TiTi质粒转化法质粒转化法质粒转化法质粒转化法植物病毒介导的转染植物病毒介导的转染植物病毒介导的转染植物病毒介导的转染电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法基因枪转化法基因枪转化法基因枪转化法基因枪转化法激光微束穿孔法激光微束穿孔法激光微束穿孔法激光微束穿孔法多聚物介导法多聚物介导法多聚物介导法多
33、聚物介导法花粉管通道法花粉管通道法花粉管通道法花粉管通道法 根根癌癌农农杆杆菌菌(A.tumefaciens)是是普普遍遍存存在在土土壤壤中中的的革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌，能能在在自自然然条条件件下下特特异异性性感感染染几几乎乎所所有有双双子子叶叶植植物物（尤尤其其豆豆科科类类植植物物）的的根根部部和和受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。 1）根癌农杆菌介导的）根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法质粒转化法 根根癌癌农农杆杆菌菌的的致致瘤瘤特特性性是是由由其其细细胞胞内内的的野野生生型型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。质粒介导的。 根根癌癌农农杆杆菌菌通通过过侵侵
34、染染植植物物伤伤口口进进入入细细胞胞后后，将将T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。插入植物基因组中，随其复制而复制。 用用携携带带外外源源基基因因的的Ti质质粒粒转转化化植植物物原原生生质质体体，外外源源DNA与与植植物物染染色色体体DNA整整合合，通通过过原原生生质质体体的的培培养养分分化化成成愈愈伤伤组组织织，最最后后发发育育成成具具有有新新性性状状的的完整植株完整植株-转基因植物转基因植物。 病病毒毒载载体体能能将将外外源源基基因因导导入入植植物物所所有有组组织织和和细胞中，且不受单子叶或双子叶的限制。细胞中，且不受单子叶或双子叶的限制。 如如：以以花花椰椰菜菜花花斑斑病病毒毒(
35、CaMV)基基因因组组为为载载体体，去去除除致致病病基基因因，换换上上外外源源基基因因，体体外外包包装装成成有有感感染染力力的的病病毒毒颗颗粒粒，转转染染植植物物细细胞胞原原生生质质体体，由由此此再生成完整植株。再生成完整植株。 2）植物病毒介导的转染）植物病毒介导的转染3）电穿孔转化法：）电穿孔转化法： 将将重重组组DNA加加入入植植物物细细胞胞原原生生质质体体中中，在在200-600V/cm电电场场中中处处理理若若干干秒秒，然然后后将将原原生生质质体体在在组组织织培培养养基基中中生生长长1-2w，再再生生出出完整植株。完整植株。 4）基因枪转化法：）基因枪转化法： 又又称称微微弹弹轰轰击击
36、法法，1987年年由由美美国国康康奈奈尔尔大学的大学的Sanford发明。发明。 将将外外源源DNA包包裹裹在在微微小小的的钨钨粉粉或或金金粉粉颗颗粒粒的的表表面面，借借助助高高压压动动力力射射入入受受体体细细胞胞或或组组织，整合到植物基因组中并得以表达。织，整合到植物基因组中并得以表达。基因枪工作原理基因枪工作原理真真空空加加速速管管压缩氨气压缩氨气吸附微粒的膜吸附微粒的膜包包裹裹DNA的的金属颗粒金属颗粒目标细胞目标细胞枪的威力枪的威力430 m/s 5）激光微束穿孔法：激光微束穿孔法： 利利用用直直径径小小、能能量量高高的的激激光光微微束束可可引引起起细细胞胞膜膜可可逆逆性性穿穿孔孔的的
37、原原理理，在在荧荧光光显显微微镜镜下下用用激激光光处处理理细细胞胞，处处于于细细胞胞周周围围的的重重组组DNA随随之之进进入细胞。入细胞。 最最适适于于活活细细胞胞中中线线粒粒体体和和叶叶绿绿体体等等细细胞胞器器的基因转移。的基因转移。6）多聚物介导法）多聚物介导法 聚聚乙乙二二醇醇(PEG)、多多聚聚赖赖氨氨酸酸、多多聚聚鸟鸟氨氨酸酸等等是是协协助助DNA转转移移的的常常用用多多聚聚物物，以以PEG应用最广。应用最广。 这这些些多多聚聚物物同同二二价价阳阳离离子子和和DNA混混合合，可可在在原原生生质质体体表表面面形形成成颗颗粒粒沉沉淀淀，促促使使DNA进入细胞内。进入细胞内。7）花粉管通道
38、法）花粉管通道法 授授粉粉后后向向子子房房注注射射外外源源DNA，利利用用植植物物在在开开花花、受受精精过过程程中中形形成成的的花花粉粉管管通通道道，将将外外源源DNA导导入入受受精精卵卵细细胞胞，整整合合到到基基因因组组中中，随随受受精卵发育而成为转基因植物。精卵发育而成为转基因植物。 1983年，由我国中科院周光宇提出。年，由我国中科院周光宇提出。 我我国国推推广广面面积积最最大大的的抗抗虫虫棉棉即即是是花花粉粉管管通通道道法法培培育育出出来来的的，占占黄黄河河、长长江江流流域域棉棉区区种种植植面面积积的的78.6%，占占全国种植面积的全国种植面积的60%以上。以上。3、重组、重组DNA分
39、子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法脂质体介导法脂质体介导法病毒颗粒转染法病毒颗粒转染法显微注射法显微注射法电穿孔法电穿孔法1）DEAE-葡聚糖转染法：葡聚糖转染法： DEAE-dextran（二二乙乙胺胺乙乙基基葡葡聚聚糖糖）是是一一种种高高分分子子多多聚聚阳阳离离子子试试剂剂，能能促促进进哺哺乳乳动物细胞捕获外源动物细胞捕获外源DNA。2）磷酸钙转染法：）磷酸钙转染法： 哺哺乳乳动动物物细细胞胞能能捕捕获获粘粘附附在在细细胞胞表表面面的的DNA-磷酸钙沉淀磷酸钙沉淀，使，使DNA进入细胞。进入细胞。 将将DNA和和CaCl2溶
40、溶液液混混合合，然然后后缓缓慢慢滴滴入入磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液PBS中中，形形成成DNA-磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，粘附到细胞膜并通过胞饮进入细胞。粘附到细胞膜并通过胞饮进入细胞。3）脂质体介导法：）脂质体介导法： 脂脂质质体体是是人人工工构构建建的的、由由磷磷脂脂双双分分子子层层组组成成的的膜膜状状结结构构，将将外外源源DNA包包裹裹其其中中，通通过过脂脂质质体体与细胞膜接触，可将外源与细胞膜接触，可将外源DNA导入受体细胞。导入受体细胞。 转转染染率率比比裸裸DNA高高100倍倍。如如用用PEG预预处处理理受受体体细细胞胞，可可提提高高转染率转染率10-20倍。倍。4）显微注射法）显微注射法
41、(microinjection) 鉴鉴于于哺哺乳乳动动物物细细胞胞便便于于注注射射的的特特性性，常常利利用用显显微微注注射射法法，直直接接把把外外源源DNA注注射射到到宿宿主主细细胞核里，使其整合到染色体上。胞核里，使其整合到染色体上。显微注射法的流程显微注射法的流程显微注射法的流程显微注射法的流程卵裂后挑选整合有外源基因的受精卵卵裂后挑选整合有外源基因的受精卵将外源基因显微注射入雄原核将外源基因显微注射入雄原核植入代孕母亲子宫内发育植入代孕母亲子宫内发育收集雄原核与雌原核尚未融合的受精卵收集雄原核与雌原核尚未融合的受精卵5）病毒颗粒转染法：）病毒颗粒转染法：病病毒毒基基因因组组为为缺缺陷陷型
42、型，需需辅辅助助病病毒毒一一起起感感染染受受体细胞；体细胞；病病毒毒直直接接感感染染受受体体细细胞胞，目目的的基基因因随随病病毒毒DNA整合到其染色体整合到其染色体DNA上；上；病病毒毒基基因因组组为为缺缺陷陷型型，但但受受体体细细胞胞基基因因组组中中整整合了病毒缺失的基因，合了病毒缺失的基因，无需辅助病毒无需辅助病毒。腺病毒（腺病毒（adenovirus）腺相关病毒（腺相关病毒（adeno-associated virus）逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirus）慢病毒（慢病毒（lentivirus）杆状病毒（杆状病毒（baculovirus） 痘病毒（痘病毒（poxvirus）常用的
43、病毒载体：常用的病毒载体：4 4、转化率、转化率、转化率、转化率 在在在在一一一一般般般般的的的的转转转转化化化化实实实实验验验验规规规规模模模模下下下下，每每每每个个个个受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞最最最最多多多多只只只只能能能能接接接接受受受受1 1个个个个载载载载体体体体分分分分子子子子，因因因因此此此此转转转转化化化化率率率率的的的的定定定定义义义义也也也也可可可可表表表表征征征征为为为为：1 1 g g载载载载体体体体DNADNA转转转转化化化化后后后后，受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞接纳接纳接纳接纳DNADNA的个数，即的个数，即的个数，即的个数，即克隆数克隆数克隆数克隆数。
44、转化率是衡量转化率是衡量转化率是衡量转化率是衡量转化效率转化效率转化效率转化效率的重要指标。的重要指标。的重要指标。的重要指标。转化率转化率转化率转化率=1=1 g g载体载体载体载体DNADNA进入受体细胞的分子数。进入受体细胞的分子数。进入受体细胞的分子数。进入受体细胞的分子数。 按按按按转转转转化化化化1 1 g g pUC18pUC18需需需需2 2 10101010个个个个感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞，则每则每则每则每 个细胞中有个细胞中有个细胞中有个细胞中有1 1个细胞接纳个细胞接纳个细胞接纳个细胞接纳pUC18 DNApUC18 DNA。 34003400如如如如：p
45、UC18pUC18对对对对E.coliE.coli细细细细胞胞胞胞的的的的转转转转化化化化率率率率为为为为101088，则则则则1 1 g g pUC18pUC18中有中有中有中有101088个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。 按按按按1 1 g g含含含含3.43.4 10101111个个个个分分分分子子子子，则则则则每每每每 个个个个pUC18pUC18分子中有分子中有分子中有分子中有1 1个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。 200200影响转化率的因素：影响转化率的因素：影响转化率的因素：影响转化
46、率的因素：载体及载体及DNA重组子方面重组子方面受体细胞方面受体细胞方面转化方法方面转化方法方面1 1、载体及、载体及、载体及、载体及DNADNA重组子方面：重组子方面：重组子方面：重组子方面： 载体本身的性质载体本身的性质载体本身的性质载体本身的性质载体的空间构象载体的空间构象载体的空间构象载体的空间构象插入片段的大小插入片段的大小插入片段的大小插入片段的大小1 1）载体本身的性质：）载体本身的性质：）载体本身的性质：）载体本身的性质：不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。 2
47、2）载体的空间构象：）载体的空间构象：）载体的空间构象：）载体的空间构象：经经经经切切切切、接接接接操操操操作作作作后后后后的的的的载载载载体体体体DNADNA，因因因因空空空空间间间间构构构构象象象象难难难难以以以以恢恢恢恢复复复复，转转转转化化化化率率率率比比比比超超超超螺螺螺螺旋旋旋旋结结结结构构构构的的的的质质质质粒粒粒粒低低低低2 2个数量级。个数量级。个数量级。个数量级。 质粒的超螺旋构象转化率最高；质粒的超螺旋构象转化率最高；质粒的超螺旋构象转化率最高；质粒的超螺旋构象转化率最高；3 3）插入片段的大小：）插入片段的大小：）插入片段的大小：）插入片段的大小： 重重重重组组组组质质
48、质质粒粒粒粒分分分分子子子子量量量量越越越越大大大大，转转转转化化化化效效效效率率率率越越越越低低低低。大于大于大于大于20kb20kb的重组质粒很难进行转化。的重组质粒很难进行转化。的重组质粒很难进行转化。的重组质粒很难进行转化。 2 2、受体细胞方面：、受体细胞方面：、受体细胞方面：、受体细胞方面： 如如如如：pBR322pBR322转转转转化化化化大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌JM83JM83，转转转转化化化化率率率率很很很很低低低低（101033/ / g g DNADNA）；但但但但对对对对ED8767ED8767株株株株的的的的转转转转化化化化率则较高（率则较高（率则较高（率则较
49、高（101066/ / g DNAg DNA）。）。）。）。 受体细胞必须与载体匹配。受体细胞必须与载体匹配。受体细胞必须与载体匹配。受体细胞必须与载体匹配。3 3、转化方法方面：、转化方法方面：、转化方法方面：、转化方法方面：受体细胞的预处理受体细胞的预处理受体细胞的预处理受体细胞的预处理供受体的比例供受体的比例供受体的比例供受体的比例转化方法转化方法转化方法转化方法1 1）受体细胞的预处理：）受体细胞的预处理：）受体细胞的预处理：）受体细胞的预处理： 对对对对CaCa2+2+转转转转化化化化而而而而言言言言，菌菌菌菌龄龄龄龄、CaCa2+2+处处处处理理理理时时时时间间间间、感感感感受受受
50、受态态态态细细细细胞胞胞胞的的的的保保保保存存存存期期期期、热热热热脉脉脉脉冲冲冲冲时时时时间间间间等等等等均均均均为为为为影影影影响响响响因因因因素素素素。感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞在在在在12-24h12-24h内内内内转转转转化化化化率率率率最最最最高高高高，分分分分装后可在装后可在装后可在装后可在-70-70保存几个月。保存几个月。保存几个月。保存几个月。 感受态细胞的制备对转化率感受态细胞的制备对转化率感受态细胞的制备对转化率感受态细胞的制备对转化率影响最大影响最大影响最大影响最大。2 2）供受体的比例：）供受体的比例：）供受体的比例：）供受体的比例： 通通通通常常常常
51、5050-100ng-100ng的的的的DNADNA对对对对应应应应于于于于101099个个个个受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞或或或或原原原原生生生生质质质质体体体体，加加加加大大大大DNADNA量量量量并并并并不不不不能能能能线线线线性性性性提提提提高高高高转化率，甚至使转化率下降。转化率，甚至使转化率下降。转化率，甚至使转化率下降。转化率，甚至使转化率下降。 DNADNA分分分分子子子子数数数数与与与与受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞数数数数的的的的比比比比例例例例对对对对转转转转化化化化率也有影响。率也有影响。率也有影响。率也有影响。3 3）转化方法：）转化方法：）转化方法：）转化方法
52、：不同转化方法的转化率不同。不同转化方法的转化率不同。CaCa2+2+诱导转化诱导转化诱导转化诱导转化 10 107 7 - 10- 108 8 原生质体转化原生质体转化原生质体转化原生质体转化 10 1055 - 10 - 1066 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体转染转染转染转染 10 1077 - 10- 1088电穿孔转化电穿孔转化电穿孔转化电穿孔转化 10 1066 - - 101099三亲本杂交转化三亲本杂交转化三亲本杂交转化三亲本杂交转化 10 1044 - 10 - 1055方方 法法 转化子转化子/ g DNA5 5、转化细胞的扩增、转化细胞的扩增、转化细胞的扩增、转化细胞的扩增 指
53、转化完成后细胞的短时间培养，往往指转化完成后细胞的短时间培养，往往指转化完成后细胞的短时间培养，往往指转化完成后细胞的短时间培养，往往与转化偶联在一起。与转化偶联在一起。与转化偶联在一起。与转化偶联在一起。 如：如：Ca2+诱导转化后的诱导转化后的37培养培养1hr； 原生质体转化后的再生过程；原生质体转化后的再生过程； -噬菌体转染后的噬菌体转染后的30培养。培养。扩增的目的：扩增的目的：扩增的目的：扩增的目的：增殖转化增殖转化增殖转化增殖转化细胞细胞细胞细胞，以获得足量的细胞用于筛选；，以获得足量的细胞用于筛选；，以获得足量的细胞用于筛选；，以获得足量的细胞用于筛选；扩增和表达载体分子上的
54、扩增和表达载体分子上的扩增和表达载体分子上的扩增和表达载体分子上的标记基因标记基因标记基因标记基因，便于筛选；，便于筛选；，便于筛选；，便于筛选；表达表达表达表达外源基因外源基因外源基因外源基因，便于筛选和鉴定。，便于筛选和鉴定。，便于筛选和鉴定。，便于筛选和鉴定。三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）根据载体遗传标记检测根据载体遗传标记检测根据载体遗传标记检测根据载体遗传标记检测外源基因产物检测外源基因产物检测外源基因产物检测外源基因产物检测目的基因序列检测目的基因序列检测 重重重重组组组组率率率率和和和和转转转转化化
55、化化率率率率不不不不可可可可能能能能达达达达到到到到100%100%的的的的理理理理想想想想极极极极限限限限，必必必必须须须须借借借借助助助助各各各各种种种种筛筛筛筛选选选选和和和和鉴鉴鉴鉴定定定定方方方方法法法法区区区区分分分分转转转转化化化化子子子子与与与与非非非非转转转转化化化化子子子子、重重重重组组组组子子子子与与与与非非非非重重重重组组组组子子子子、目目目目的的的的重重重重组组组组子子子子与非目的重组子。与非目的重组子。与非目的重组子。与非目的重组子。转化子转化子转化子转化子重组子重组子重组子重组子目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子非转化子非转化子非转化子非转化子非转化子非转化
56、子：转化子转化子：重组子重组子：非重组子非重组子：非目的重组子非目的重组子：目的重组子目的重组子：接纳载体或重组接纳载体或重组DNA的转化细胞；的转化细胞；未接纳载体或重组未接纳载体或重组DNA的转化细胞。的转化细胞。含重组含重组DNA的转化子；的转化子；仅含空载体的转化子。仅含空载体的转化子。含目的基因的重组子；含目的基因的重组子；不含目的基因的重组子。不含目的基因的重组子。1 1、根据载体标记筛选：、根据载体标记筛选：、根据载体标记筛选：、根据载体标记筛选：抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法显色筛选法显色筛选法1
57、 1）抗药性筛选法：）抗药性筛选法：）抗药性筛选法：）抗药性筛选法：ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAmprpBR3224363 bpori将外源将外源将外源将外源DNADNA片段插入片段插入片段插入片段插入BamBamH IH I、Sal Sal I I位点：位点：位点：位点： 非重组子：非重组子：非重组子：非重组子：重组子：重组子：重组子：重组子：可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。AmpAmprr、TcTcr r AmpAmprr、TcTcs
58、 s 将转化液涂布含将转化液涂布含将转化液涂布含将转化液涂布含AmpAmp的平板的平板的平板的平板AmpAmp再将再将再将再将AmpAmp平板上的转化子影平板上的转化子影平板上的转化子影平板上的转化子影印至含有印至含有印至含有印至含有AmpAmp和和和和TcTc的平板上的平板上的平板上的平板上 AmpAmp+ +TcTc影影影影印印印印挑挑挑挑选选选选在在在在 AmpAmp平平平平 板板板板 上上上上 生生生生 长长长长 、 但但但但 在在在在AmpAmp+ +TcTc平平平平板板板板上上上上不不不不长长长长的的的的转转转转化化化化子为重组子子为重组子子为重组子子为重组子基本操作：基本操作：2
59、 2）营养缺陷型筛选法：）营养缺陷型筛选法：）营养缺陷型筛选法：）营养缺陷型筛选法：原理：原理：原理：原理： 载载载载体体体体分分分分子子子子携携携携带带带带某某某某种种种种营营营营养养养养组组组组份份份份的的的的合合合合成成成成基基基基因因因因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份。而受体细胞本身不能合成这一营养组份。而受体细胞本身不能合成这一营养组份。而受体细胞本身不能合成这一营养组份。 在在在在不不不不含含含含此此此此营营营营养养养养组组组组份份份份的的的的培培培培养养养养基基基基上上上上长长长长出出出出的的的的便便便便是是是是转化子转化子转化子转化子。 可区分转化子与非转化子。可区分转化
60、子与非转化子。可区分转化子与非转化子。可区分转化子与非转化子。转化子转化子常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记： E.coliE.coli：常常常常选选选选用用用用色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸生生生生物物物物合合合合成成成成基基基基因因因因trptrp，相相相相应应应应的受体细胞则选择的受体细胞则选择的受体细胞则选择的受体细胞则选择trptrp缺陷型缺陷型缺陷型缺陷型( (trptrp-) )。哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞：常常常常使使使使用用用用胸胸胸胸腺腺腺腺嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶核核核核苷苷苷苷激激激激酶酶酶酶基
61、基基基因因因因tktk，相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择tktk缺陷型缺陷型缺陷型缺陷型( (tktk-) )。dCDPdCDPdTDPdTDPdTTPdTTP（脱氧胞苷二磷酸）（脱氧胞苷二磷酸） （脱氧胸苷二磷酸）（脱氧胸苷二磷酸） （脱氧胸苷三磷酸）（脱氧胸苷三磷酸）TRTRdTMPdTMPdTDPdTDPdTTPdTTP（胸腺嘧啶核苷）（胸腺嘧啶核苷） （脱氧胸苷一磷酸）（脱氧胸苷一磷酸） （脱氧胸苷二磷酸）（脱氧胸苷二磷酸） （脱氧胸苷三磷酸）（脱氧胸苷三磷酸） 哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细
62、胞中存在两条dTTPdTTP的合成途径：的合成途径：的合成途径：的合成途径： APAPAPAP 氨基喋呤氨基喋呤氨基喋呤氨基喋呤TK TK 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶TKTK3 3）显色筛选法：）显色筛选法：）显色筛选法：）显色筛选法： 可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。原理：原理：原理：原理：载体携带显色酶基因，其表达产物能使细胞载体携带显色酶基因，其表达产物能使细胞载体携带显色酶基因，其表达产物能使细胞载体携带显色酶基因
63、，其表达产物能使细胞 产生颜色反应。产生颜色反应。产生颜色反应。产生颜色反应。 链霉菌质粒链霉菌质粒链霉菌质粒链霉菌质粒pIJ702pIJ702携带的携带的携带的携带的melCmelC基因基因基因基因- -黑色黑色黑色黑色反应。反应。反应。反应。 如：如：如：如：E.coliE.coli质粒质粒质粒质粒pUC18pUC18携带的携带的携带的携带的lacZlacZ基因基因基因基因- -蓝色蓝色蓝色蓝色反应；反应；反应；反应；基本操作：基本操作：pUC18lacZoriAmpAmprr 外外外外源源源源基基基基因因因因插插插插入入入入pUC18pUC18的的的的lacZlacZ基因内部，使之灭活。
64、基因内部，使之灭活。基因内部，使之灭活。基因内部，使之灭活。重组子：重组子：重组子：重组子：非重组子：非重组子：非重组子：非重组子：Amp + X-galAmp + X-galAmpAmprr、lacZlacZ+，蓝色菌落。蓝色菌落。蓝色菌落。蓝色菌落。 重组子重组子重组子重组子AmpAmprr、lacZlacZ-，淡黄色菌落；淡黄色菌落；淡黄色菌落；淡黄色菌落；2 2、目的基因序列检测：、目的基因序列检测：、目的基因序列检测：、目的基因序列检测：限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法PCRPCR法法法法DNADNA序列测定序列
65、测定序列测定序列测定1 1）限制性酶切图谱法：）限制性酶切图谱法：）限制性酶切图谱法：）限制性酶切图谱法： 区分重组子与非重组子、鉴定区分重组子与非重组子、鉴定区分重组子与非重组子、鉴定区分重组子与非重组子、鉴定目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子。 提提提提取取取取转转转转化化化化子子子子DNADNA用用用用合合合合适适适适的的的的限限限限制制制制酶酶酶酶酶酶酶酶切切切切琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳获获获获得得得得酶酶酶酶切切切切图图图图谱谱谱谱如如如如酶酶酶酶切切切切片片片片段段段段数数数数量量量量和大小同预期一致，则可能是目的重组子。和大小同预期一致，则可
66、能是目的重组子。和大小同预期一致，则可能是目的重组子。和大小同预期一致，则可能是目的重组子。缺点：缺点：用于数千规模的转化子筛选时，工作量极用于数千规模的转化子筛选时，工作量极 大、成本高。大、成本高。区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子BamBamH IH I酶切转化子酶切转化子酶切转化子酶切转化子重组子重组子重组子重组子：非重组子非重组子非重组子非重组子：如如如如外外外外源源源源DNADNA也也也也是是是是2.72.7kbkb，最最最最好好好好选选选选用用用用单单单单一一一一切切切切口口口口的的的的酶酶酶酶将将将将质质质质粒粒粒粒线线线线型型型型
67、化化化化，通通通通过过过过长长长长度度度度鉴鉴鉴鉴定其是否为重组子。定其是否为重组子。定其是否为重组子。定其是否为重组子。2.72.7kb + 4.0kbkb + 4.0kb 2.7 2.7kbkbpUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kb Hin HindIIIdIII Sph SphI I PstPstII Sal SalII BamBamHIHI Sma SmaI I KpnKpnI I Eco EcoRIRIAmpAmprrlacZlacZorioriBamBamH IH I4.0 kb4.0 kbBamBamH IH IpUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbAmpAm
68、prrlacZlacZorioriSphSph I ISph Sph II4.0 kb4.0 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子 用用用用 HinHind d IIIIII和和和和 EcoEcoR R I I联联联联合合合合酶酶酶酶切切切切同同同同样样样样可可可可达达达达目目目目的的的的，而而而而 这这这这 两两两两 种种种种 酶酶酶酶 的的的的 价价价价 格格格格 只只只只 及及及及SphSph I I的的的的1 1/50/50。 HinHindIIIdIII SphSphII PstPstI I SalSalII Bam BamHIHI S
69、ma SmaI I KpnKpnI I EcoEcoRIRI 如如如如 外外外外 源源源源 DNADNA插插插插 在在在在pUC18pUC18的的的的SphSph I I位位位位点点点点，原原原原则则则则上上上上可可可可用用用用SphSph I I酶酶酶酶切切切切鉴鉴鉴鉴定定定定，但但但但其价格昂贵、不经济。其价格昂贵、不经济。其价格昂贵、不经济。其价格昂贵、不经济。 pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHinHindIIIdIII Sph SphI I PstPstI I SalSalI I BamBamHI HI SmaSmaII Kpn KpnI I EcoEcoRIRIAm
70、pAmprrlacZlacZorioriBamBamH IH IBamBamH IH IEcoEcoR IR IPst Pst II4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用用用EcoEcoR IR I酶切转化子：酶切转化子：酶切转化子：酶切转化子：目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子：用用用用PstPst I I酶切转化子：酶切转化子：酶切转化子：酶切转化子：目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子： 3.2 3.2kb + 3.5kbkb +
71、 3.5kb或：或：或：或： 0.8 0.8kb + 5.9kbkb + 5.9kb 3.0 3.0kb + 3.7kbkb + 3.7kb 或：或：或：或：1.01.0kb + 5.7kbkb + 5.7kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子 对对对对图图图图示示示示的的的的克克克克隆隆隆隆片片片片段段段段，EcoEcoR R I I酶酶酶酶切切切切转转转转化化化化子子子子后后后后，只只只只出出出出现现现现2.02.0kbkb和和和和2.72.7kbkb两两两两条条条条带带带带，实实实实际际际际上上上上2.02.0
72、kbkb条条条条带带带带中中中中含含含含2 2种种种种不不不不同的分子。同的分子。同的分子。同的分子。2.7 kb2.7 kb2.0 kb2.0 kbpUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHinHindIIIdIII Sph SphI I Pst PstI I SalSalII Bam BamHIHI Sma SmaI I Kpn KpnI I EcoEcoRIRIApAprrlacZlacZorioriBamBamH IH IEcoEcoR IR I4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kbEcoEcoR IR IBamBamH IH I2 2）分子杂
73、交法：）分子杂交法：）分子杂交法：）分子杂交法：原理：原理：原理：原理： 根根根根据据据据目目目目的的的的基基基基因因因因序序序序列列列列设设设设计计计计并并并并合合合合成成成成探探探探针针针针，以此筛选目的重组子以此筛选目的重组子以此筛选目的重组子以此筛选目的重组子。菌落菌落/噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交Southern blot3）PCR法：法： 根根据据目目的的基基因因的的序序列列，设设计计合合成成上上、下下游游引引物物，以以待待鉴鉴定定克克隆隆的的DNA为为模模板板，进进行行扩扩增增，若若获获得得特特异异性性DNA片片段段，表表明明其含有目的基因。其含有目的基因。4 4）DNADNA序
74、列测定：序列测定：序列测定：序列测定：是精确鉴定目的基因的重要手段。是精确鉴定目的基因的重要手段。是精确鉴定目的基因的重要手段。是精确鉴定目的基因的重要手段。 目前采用目前采用目前采用目前采用SangerSanger发明的双脱氧末端终止法。发明的双脱氧末端终止法。发明的双脱氧末端终止法。发明的双脱氧末端终止法。3 3、外源基因产物检测：、外源基因产物检测：、外源基因产物检测：、外源基因产物检测：目的基因转录产物的检测目的基因转录产物的检测目的基因翻译产物的检测目的基因翻译产物的检测目的基因翻译产物的检测目的基因翻译产物的检测1）目的基因转录产物检测：）目的基因转录产物检测：常用常用Northe
75、rn blot法。法。2）目的基因翻译产物的检测：）目的基因翻译产物的检测：蛋白质印迹法蛋白质印迹法蛋白质生物学功能测定法蛋白质生物学功能测定法蛋白质印迹法蛋白质印迹法(Western blot)： 提提取取目目的的基基因因表表达达产产物物聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)转转印印至至硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上加加入入特特异异性性抗抗体体加加入入酶酶标标二二抗抗显显色色反反应应结果分析。结果分析。用特异性抗体检测用特异性抗体检测蛋白质蛋白质样品。样品。蛋白质生物学功能测定法：蛋白质生物学功能测定法：蛋白质生物学功能测定法：蛋白质生物学功能测定法：如：如：如：如：淀粉酶基
76、因的鉴定：淀粉酶基因的鉴定：淀粉酶基因的鉴定：淀粉酶基因的鉴定： 将难溶于水的淀粉加入培养基（呈混浊状）。将难溶于水的淀粉加入培养基（呈混浊状）。将难溶于水的淀粉加入培养基（呈混浊状）。将难溶于水的淀粉加入培养基（呈混浊状）。 将将将将待待待待鉴鉴鉴鉴定定定定重重重重组组组组子子子子涂涂涂涂在在在在培培培培养养养养基基基基上上上上，目目目目的的的的重重重重组组组组子子子子表表表表达达达达的的的的淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶分分分分泌泌泌泌并并并并均均均均匀匀匀匀扩扩扩扩散散散散，将将将将淀淀淀淀粉粉粉粉降降降降解解解解为为为为可可可可溶溶溶溶性性性性多多多多糖糖糖糖或或或或单单单单糖，菌落周围形成
77、透明圈。糖，菌落周围形成透明圈。糖，菌落周围形成透明圈。糖，菌落周围形成透明圈。如：如：如：如：抗生素抗性基因的鉴定：抗生素抗性基因的鉴定：抗生素抗性基因的鉴定：抗生素抗性基因的鉴定： 理理理理论论论论上上上上，只只只只需需需需往往往往培培培培养养养养板板板板中中中中加加加加入入入入适适适适量量量量抗抗抗抗生生生生素素素素，长出的菌落即是目的重组子。长出的菌落即是目的重组子。长出的菌落即是目的重组子。长出的菌落即是目的重组子。 实实实实际际际际上上上上，抗抗抗抗生生生生素素素素会会会会诱诱诱诱导导导导受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生抗抗抗抗性性性性，需需需需从从从从抗抗抗抗性性性性克克克克隆隆隆隆中中中中抽抽抽抽提提提提质质质质粒粒粒粒，二二二二次次次次转转转转化化化化受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞。若若若若此此此此时时时时平平平平板板板板上上上上出出出出现现现现大大大大量量量量抗抗抗抗性性性性菌菌菌菌落落落落，则则则则可可可可认认认认为为为为该该该该抗抗抗抗性确由目的基因表达产物产生。性确由目的基因表达产物产生。性确由目的基因表达产物产生。性确由目的基因表达产物产生。诱导抗性诱导抗性诱导抗性诱导抗性 目的重组子目的重组子目的重组子目的重组子 抽取重组质粒抽取重组质粒抽取重组质粒抽取重组质粒二次转化二次转化二次转化二次转化
