植物组织培养培养基及操课件

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1、第三章第三章 培养基及一般培养技培养基及一般培养技术（4学学时）3.1 3.1 培养基的种培养基的种类和成份（和成份（1 1学学时）3.2 3.2 培培养养基基的的制制备（母母液液的的配配制制和和保保存存；MSMS培培养养基基的的配配制制）（融融入入实验课）；一般操作技）；一般操作技术（灭菌、接种、培养、移栽菌、接种、培养、移栽驯化）（化）（2 2学学时）3.3 3.3 组培常培常见问题与与对策（策（污染、褐化、玻璃化）（染、褐化、玻璃化）（1 1学学时）1植物组织培养培养基及操第一节第一节 培养基的培养基的成分成分和和种种类2植物组织培养培养基及操一、培养基的成分3植物组织培养培养基及操1

2、1、无机营养元素、无机营养元素(inorganic element) (inorganic element) 1)1)大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等 。2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，ClCl等等 。 4植物组织培养培养基及操在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、 VB6(

3、盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、（抗坏血酸）、 VH(生物素生物素)、 VB11(叶酸叶酸)、 VB12（钴胺素（钴胺素)等。等。使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.11.0mgL。2 2、维生素、维生素、维生素、维生素(vitamin) (vitamin) 5植物组织培养培养基及操又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度使用浓度：一般为：一般为lOOmglOOmgL L，作用作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的

4、繁殖、分化有促进作用，对和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。细胞壁的形成也有作用。 3、肌醇、肌醇 培养基及其配制培养基及其配制6植物组织培养培养基及操作用作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度使用浓度：为：为1010200mg200mgL L。4、氨基酸、氨基酸 (amino acid）培养基及其配制培养基及其配制7植物组织培养培

5、养基及操5、有机附加物 （天然复合物）10%20%10%20%150-200ml150-200mlL L150200g150200gL L0.01%-0.05%0.01%-0.05%浓度：浓度：浓度：浓度：培养基及其配制培养基及其配制8植物组织培养培养基及操6 6、植物生长调节物质、植物生长调节物质(hormone) (hormone) l赤霉素（赤霉素（赤霉素（赤霉素（gibberellic acidgibberellic acid）l细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类 ( cytokinin )( cytokinin )l生长素类生长素类生长素类生长素类(auxin)(aux

6、in)培养基及其配制培养基及其配制9植物组织培养培养基及操 * *作作用用：主主要要被被用用于于诱诱导导愈愈伤伤组组织织形形成成；促促进进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。 在在促促进进生生长长方方面面，根根对对生生长长素素最最敏敏感感。在在极极低低的的浓浓度度下下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就就可可促促进进生生长，其次是茎和芽。长，其次是茎和芽。（1）生长素类）生长素类 培养基及其配制培养基及其配制10植物组织培养培养基及操吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalen

7、e acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（indolebutyric acid）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 生长素种类：生长素种类：培养基及其配制培养基及其配制11植物组织培养培养基及操生长素作用强弱顺序：生长素作用强弱顺序：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制12植物组织培养培养基及操种类：种类：6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Kt (kinetin 激动素激动素)Zt (zea

8、tin 玉米素玉米素)（2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类 细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化。培养基及其配制培养基及其配制13植物组织培养培养基及操细胞分裂素作用强弱顺序细胞分裂素作用强弱顺序Kt ( 激动素激动素)6

9、BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt (玉米素玉米素)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制14植物组织培养培养基及操GAGA3 3（赤霉酸）：（赤霉酸）：作作用用：促促进进幼幼芽芽伸伸长长生生长长，促促进进不不定定胚胚发发育育成成小小植株。植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当有影响：当生长素赤霉素比值高生长素赤霉素比值高时有利于时有利于木质木质部部分化，分化，比值低比值低时有利于时有利于韧皮部韧皮部分化。分化。（3 3）赤霉素）赤霉素）赤霉素）赤霉素培养基及其配制培养基及其配制15植物组织培养培养基及操7、培养材料的支持物 -琼脂(aga

10、r) 固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。 用量：用量：6 610g10gL L。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40 40 即凝固为固体状即凝固为固体状凝胶。凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时高压灭菌时的温度、时间、的温度、时间、pHpH值值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之

11、高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。 培养基及其配制培养基及其配制16植物组织培养培养基及操固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点优点: :操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点缺点: :培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触( (即吸收即吸收) )面积小，各种面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织培养物排出

12、的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。产生毒害作用。固体培养固体培养液体培养液体培养培养基及其配制培养基及其配制17植物组织培养培养基及操8、抗生物质(antibiotic) 种种类类：卡卡那那霉霉素素、头头孢孢霉霉素素、青青霉霉素素、链链霉霉素素、庆庆大霉素等。大霉素等。浓度：浓度：520mg/L。作用：作用：可可防止菌类污染防止菌类污染。培养基及其配制培养基及其配制18植物组织培养培养基及操9 9、活性炭、活性炭(active carbon) (active carbon) 目的：目的：是是利用其吸附能力，减少一些有毒物质利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响的影响；利于生根。；

13、利于生根。使用浓度：使用浓度：15gL。它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。减弱，甚至不吸附。培养基及其配制培养基及其配制19植物组织培养培养基及操10、水（water)作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。代谢过程的介质和溶媒。 注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水

14、。培养基及其配制培养基及其配制20植物组织培养培养基及操二、培养基的二、培养基的PHPH值值 (pH value)(pH value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节. .3、注意：注意：p经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH会下降会下降0.2-0.8,0.2-0.8,故故调整调整pHpH值时值时, ,应高于应高于0.50.5；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，当的大小会影响琼脂的凝固能力，当pHpH6.06.0时，培养基将会变硬，时，培养基将会变硬，pH 5.0pH 5.0时，琼脂凝固时，琼脂

15、凝固不好。不好。培养基及其配制培养基及其配制21植物组织培养培养基及操种种类最适最适pH值种种类最适最适pH值杜杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡胡萝卜、石刁柏卜、石刁柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7培养基及其配制培养基及其配制不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表)22植物组织培养培养基及操 培养基培养基(culture medium) ：是植物组织培养的重要基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要同的要求

16、，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功合适的培养基，培养才有可能成功。 三、培养基的种类、配方及特点三、培养基的种类、配方及特点培养基及其配制培养基及其配制23植物组织培养培养基及操1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根

17、据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。改良培养基。（一）培养基的种类（一）培养基的种类（一）培养基的种类（一）培养基的种类培养基及其配制培养基及其配制24植物组织培养培养基及操F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为的培养基，称为基本培养基基本培养基。F 在基本培养基的基础上，添加各种各样的生在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫长调节物质和其他有机附加物

18、的培养基叫完全完全培养基。培养基。初代培养基：初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基。指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：继代培养基：指用来接种初代培养之后培养物的培养基指用来接种初代培养之后培养物的培养基 。培养基及其配制培养基及其配制25植物组织培养培养基及操1 1、MSMS培培养养基基：它它是是19621962年年由由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为为培培养养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。 特特点点：是是无无机机盐盐离离子子浓浓度度较较高高，有有高高含含量量的的N N、K K，硝硝酸盐量

19、大，营养丰富。酸盐量大，营养丰富。（三）常用的培养基及特点（三）常用的培养基及特点（三）常用的培养基及特点（三）常用的培养基及特点培养基及其配制培养基及其配制26植物组织培养培养基及操成分名称成分名称药品品名称名称原配方量原配方量(mg)/L大量元素大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170微量元素微量元素MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl26H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MoO42H2O0.25KI0.83铁盐FeSO47H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物有机

20、物烟酸烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素酸硫胺素0.1肌醇肌醇100甘氨酸甘氨酸2（二二二二） MMS S培培培培养养养养基基基基配配配配方方方方27植物组织培养培养基及操2 2、WhiteWhite培培养养基基：19431943年年由由WhiteWhite为为培培养养番番茄茄根根尖而设计的。尖而设计的。特点：特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。无机盐浓度较低，适于生根培养。3 3 3 3、N6N6N6N6培养基：培养基：培养基：培养基：1974197419741974年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作物

21、花药培养而设计的。物花药培养而设计的。物花药培养而设计的。物花药培养而设计的。特点：特点：特点：特点：成分较简单，成分较简单，成分较简单，成分较简单，KNOKNOKNOKNO3 3 3 3和（和（和（和（NHNHNHNH4 4 4 4）2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4含量高，含量高，含量高，含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。植物的花粉和花药培养。植物的花粉和花药培养。植物的花粉和花药培养。培养基及其配制培养基及其配制28

22、植物组织培养培养基及操(4)B(4)B5 5培培养养基基: :是是19681968年年由由GalmborgGalmborg等等为为培培养养大大豆豆根细胞而设计的。根细胞而设计的。特特点点：是是含含有有较较低低的的铵铵盐盐，较较高高的的硝硝酸酸盐盐和和盐盐酸酸硫胺素。硫胺素。(5)KM(5)KM8P8P培养基培养基: :它是它是19741974年为原生质体培年为原生质体培养而设计的。养而设计的。特点：特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。单糖和维生素。培养基及其配制培养基及其配制29植物组织培养培养基及操2 2、WhiteWhite培养基培养基 19

23、431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素含量含量(mg/L）微量元素微量元素含量含量铁盐含量含量有机物有机物含量含量(mg/L其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂脂8000MgS

24、O4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素酸硫胺素0.1 NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆醇酸吡哆醇0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO420030植物组织培养培养基及操3 3、B5B5培养基培养基 19681968年由年由GamborgGamborg等为培养大豆根细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分组成成分数量数量(mg/l）组成成分组成成分数量数量(mg/l)KNO32500FeSO47H2O27.8CaCl22H2O150CuS

25、O45H2O0.025MgSO47H2O250蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇肌醇100H3BO43.0烟酸烟酸1.0MnSO44H2O10盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇1.0ZnSO47H2O2.0激动素激动素0.1Na2MoO42H2O0.252,4D0.11.0CoCl26H2O0.025盐酸硫铵素盐酸硫铵素10Na2-EDTA37.3B5培养基的组成和配方31植物组织培养培养基及操4 4、N6N6培养基培养基 19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KH2PO4和（和（NH4NH4）SO4SO4含量高，不含钼

26、含量高，不含钼组成成分组成成分数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l)KNO32.3Na2EDTA37.3CaCl22H2O166FeSO47H2O27.8MgSO47H2O185蔗糖蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸甘氨酸2.0MnSO44H2O4.4盐酸硫铵盐酸硫铵1.0ZnSO47H2O1.5N6培养基组成及配方32植物组织培养培养基及操第二节第二节 培养基的培养基的配制配制33植物组织培养培养基及操 一、一、 培养基的配培养基的配制制 （一）、母液（一）、母液(stock solu

27、tion)的配制和保存的配制和保存所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液。意义意义: 保证各物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取配制时的快速移取 便于低温保藏。便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-10010-100倍。倍。母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等盐、有机物和激素类等。培养基及其配制培养基及其配制34植物组织培养培养基及操单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用度的母液。一般用mg/m

28、l mg/ml 或或mg/Lmg/L表示。表示。混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。数称量，分别溶解后再混合成母液。配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒精助酒精助溶溶。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.5-1N盐酸加热溶盐酸加热溶解解。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。培养基及其配制培养基及其配制母液的配制方法：母液的配制方法：35植物组织

29、培养培养基及操母液名称母液名称药品品名称名称原配方量原配方量(mg)/L扩大倍数大倍数称取量称取量(mg)母液体母液体积(ml)移取量移取量(ml)/L大量元素母液大量元素母液NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl22H2O440104400MgSO47H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液微量元素母液MnSO4H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860CoCl26H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MoO42H2O0.25

30、10025KI0.8310083铁盐母液母液FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液烟酸烟酸(Vpp)0.5502550010盐酸吡哆醇酸吡哆醇0.55025盐酸硫胺素酸硫胺素0.1505肌醇肌醇100505000甘氨酸甘氨酸250100培养基及其配制培养基及其配制36植物组织培养培养基及操配制方法：配制方法：1 1）、将母液按）、将母液按顺序顺序摆放摆放2 2）、取适量的蒸馏水）、取适量的蒸馏水( (所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3）、按需要量依次取母液及生长调节物质）、按需要量依次取母液及生

31、长调节物质4 4）、加入蔗糖）、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5）、加琼脂）、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5）、）、定容定容6)6)、调、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7)7)、分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口8)8)、高压灭菌、高压灭菌培养基及其配制培养基及其配制37植物组织培养培养基及操38植物组织培养培养基及操第三节第三节 组培技培技术（灭菌、接种、培养、移栽菌、接种、培养、移栽驯化化）39植物组织培养培养基及操消毒消毒:是指杀死、消除或充分是指杀死、消除或充分抑制抑制部分微生物，部分微生物，使之不

32、再发生危害作用。使之不再发生危害作用。灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的体表面和孔隙内的一切微生物或生物体一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。即把所有生命的物质全部杀死。培养基及其配制培养基及其配制一、培养基的灭菌一、培养基的灭菌40植物组织培养培养基及操常用的灭菌方法常用的灭菌方法物理方法物理方法化学方法化学方法干热灭菌干热灭菌(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)湿热灭菌湿热灭菌(常压或高压蒸煮常压或高压蒸煮)射线处理射线处理(紫外线、超声波、微波紫外线、超声波、微波)过滤除菌过滤除菌大量无菌水冲洗大量无菌水冲洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛

33、甲醛(福尔马林福尔马林)过氧化氢过氧化氢高锰酸钾高锰酸钾来苏儿来苏儿漂白粉漂白粉次氯酸钠次氯酸钠酒精酒精培养基及其配制培养基及其配制41植物组织培养培养基及操培养基的灭菌湿热灭菌法培养基的灭菌湿热灭菌法培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭菌。内完成灭菌。高压灭菌的原理高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa108kPa的压力的压力下，锅内下，锅内温度达温度达121121。在此蒸气温度下，可以很快杀。在此蒸

34、气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。死各种细菌及其高度耐热的芽孢。培养基及其配制培养基及其配制42植物组织培养培养基及操将锅内将锅内空气空气完全排除后，关闭完全排除后，关闭放气阀。放气阀。当压力表上升达当压力表上升达108kPa108kPa时，锅内温度达时，锅内温度达121121（在此蒸气温度下，可（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持耐热的芽孢），维持15-30min15-30min。培养基及其配制培养基及其配制灭菌方法：灭菌方法：43植物组织培养培养基及操44植物组织培养培养基及操 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸灭

35、菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；灭菌效果；45植物组织培养培养基及操4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；、排气降压时应缓慢进行；6

36、、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。、高压锅工作时，应有专人看守。46植物组织培养培养基及操高压灭菌的原理在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达的压力下，锅内温度达121。在。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。热的芽孢。 47植物组织培养培养基

37、及操注意事项注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到表上升达到0.1MPa时时,开始计时，维持

38、压力开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。分钟。 48植物组织培养培养基及操在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三其原因有三：一是湿热中细菌菌体：一是湿热中细菌菌体吸收水分，吸收水分，蛋白质较易凝固蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大湿热的穿透力比干热大；三是；三是湿热的蒸汽有潜热湿热的蒸汽有潜热存在，每存在，每1克水在克水在100时，由时，由气态变为液态时可放出气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌（千焦）的热量。

39、这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养使容器内的培养基由于内外压

40、力不平衡而冲出烧瓶口或试管口基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污，造成棉塞沾染培养基而发生污染，需逐渐减压。染，需逐渐减压。 49植物组织培养培养基及操过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ）一些生长调节剂一些生长调节剂( (赤霉素、玉米素赤霉素、玉米素) )、某些维生素是不耐热的，常用某些维生素是不耐热的，常用过滤灭过滤灭菌菌- -细菌过滤器细菌过滤器方法。方法。防细菌滤膜网孔的直径为防细菌滤膜网孔的直径为0.45m0.45m以以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。过。培养基及其配制培养基及其配制50植物组织培养培养基及操空间及物体表面

41、灭菌空间及物体表面灭菌培养基及其配制培养基及其配制l熏蒸剂熏蒸剂: :甲醛甲醛和和高锰酸钾，高锰酸钾，1 1周后通风周后通风1 1天天。(1)紫外线灭菌紫外线灭菌(2)熏蒸灭菌熏蒸灭菌l10-2010-20分钟分钟51植物组织培养培养基及操 灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。 检验方法：检验方法： 将培养基置于培养室中将培养基置于培养室中3 3天，若没有污染现象，说明灭菌可天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和

42、避光处理。 保存时间不可过长。保存时间不可过长。培养基的保存培养基的保存52植物组织培养培养基及操二、外植体的选择和灭菌二、外植体的选择和灭菌 1、 外植体的选择外植体的选择 2、 外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 3、 污染原因和预防措施污染原因和预防措施 53植物组织培养培养基及操 1 1、外植体的选择、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、外植体外植体的选择的选择、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1 1）、选择优良的种质）、选择优良的种质 无无论论是是离离体体培培养养繁繁殖

43、殖种种苗苗，或或者者是是进进行行生生物物技技术术研研究究，选选取取性性状状优优良良的的种种质质，或或特特殊殊的的基基因因型型。对对材材料料的的选选择择要要有有明明确确的的目目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 54植物组织培养培养基及操2 2）、选择健壮的植株）、选择健壮的植株 组组织织培培养养用用的的材材料料，最最好好从从生生长长健健壮壮的的无无病病虫虫的的植植株株上上，选选取取发发育育正正常常的的器器官官或或组组织织。因因为为这这些些器器官官或或组组织织代代谢谢旺旺盛盛，再再生生能能力力强强，比较容易培养成功。比较容易培

44、养成功。3 3）、选择最适的时期）、选择最适的时期 组组织织培培养养选选择择材材料料时时，要要注注意意植植物物的的生生长长季季节节、植植物物的的生生长长发发育育阶阶段段。如如快快速速繁繁殖殖时时应应在在植植株株生生长长的的最最适适时时期期取取材材，这这样样不不仅仅成成活活率率高，而且生长速度快，增殖率高高，而且生长速度快，增殖率高。55植物组织培养培养基及操4 4）、选取适宜的大小）、选取适宜的大小 培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。大易污染，也不需要；材料太小

45、，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。毒培养的材料，则应更小。56植物组织培养培养基及操三、外植体的灭菌方法三、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法57植物组织培养培养基及操1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌菌剂使用使用浓度（度（% %）清除的清除的难易易消毒消毒时间效效 果果次次氯酸酸钙910910易易530530很好很好次次氯酸酸钠2 2易易5

46、30530很好很好漂漂 白白 粉粉饱和和浓度度易易530530很好很好氯 化化 汞汞0.110.11较难210210最好最好酒酒 精精70757075易易0.220.22好好过氧化氧化氢10121012最易最易515515好好溴溴 水水1212易易210210很好很好硝硝 酸酸 银1 1较难530530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L450mg/L中中30603060较好好58植物组织培养培养基及操2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处预处理理。植物材料一般采取的预处理方法是：。植物材料一般采取的预

47、处理方法是：先对植物组织进行先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌细菌和和真菌真菌，因此还需进一步灭菌。，因此还需进一步灭菌。 59植物组织培养培养基及操常规的表面灭菌处理方法常规的表面灭菌处理方法把材料放进把材料放进70%的酒精中约的酒精中约30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡510min 。 或用或用10%的的次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液浸浸泡泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗35次

48、。次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。的接触。在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%的的Tween20（吐温）（吐温） 或或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。湿润剂，则灭菌效果更好。 60植物组织培养培养基及操四、污染原因和预防措施四、污染原因和预防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。养失败的现象。污染的原因：污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类

49、；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。作人员未遵守操作规程等引起的。61植物组织培养培养基及操细菌污染的特点细菌污染的特点：在外植体附近的培养基中出现在外植体附近的培养基中出现浑浊浑浊和和云雾状云雾状痕痕迹。迹。一般在接种后一般在接种后12天即可发现。天即可发现。原因：材料带菌；原因：材料带菌； 培养基灭菌不彻底；培养基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在酒精擦洗，镊

50、子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。使用前必须在火焰上烧红。62植物组织培养培养基及操真菌污染的特点真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌菌丝丝块。块。在接种后在接种后310天才能发现。天才能发现。原因：周围环境不清洁；原因：周围环境不清洁； 超净工作台的过滤装置失效；超净工作台的过滤装置失效； 培养瓶等器皿的口径过大。培养瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。的发生。 63植物组织培养培养基及操2 2、污染的预防措施、污染的预

51、防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭集中进行高压灭菌菌，再清除污染物，然后洗净备用。，再清除污染物，然后洗净备用。64植物组织培养培养基及操1）防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件

52、下对 枝条先进行枝条先进行预培养预培养。u枝条枝条 水洗净水洗净 插入无糖的营养液或自来水插入无糖的营养液或自来水 抽枝抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。接种。这样便可大大减少材料的污染。u在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。显减少污染。 65植物组织培养培养基及操 （2）选择合适的时间去田间采取外植体）选择合适的时间去田间采取外植体避免避免阴雨天阴雨天去田间采取外植体。去田间采取外植体。

53、在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌真菌。66植物组织培养培养基及操 但但目目前前对对材材料料内内部部污污染染还还没没有有令令人人满满意意的的灭灭菌菌方方法法。在在菌菌类类长长入入组组织织内内部部时时，不不但但要要除除去去上上年年生生的的鳞鳞片片，甚甚至至要要除除去去韧韧皮皮组组织织，只只接接种种内内部部的的分分生生组组织织，以以收收到到一一定定的的防防污污染效果。染效果。67植物组织培养培养基及操2 2）外植体的灭菌）外植体的灭菌（1 1）多次灭菌法

54、：）多次灭菌法： 首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）；首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）； 其次，将切好的外植体放入其次，将切好的外植体放入1.3%1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌的次氯酸盐溶液中，灭菌30min30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-53-5次；次； 第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度； 第五，次日将叶片用第五，次日将叶片用2.6%2.6%次氯酸钠灭菌次氯酸钠灭菌30min30min，然后用蒸馏水洗，然后用蒸馏水洗3-53-5次。次。68植物组织

55、培养培养基及操（2 2）多种药液交替浸泡法）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：对容易污染而难灭菌的材料：首首先先取取茎茎尖尖、芽芽或或器器官官外外植植体体，用用自自来来水水及及肥肥皂皂充充分分洗洗净净，表表面面不不可可附附着着污污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；第第2，将材料放入，将材料放入70%酒精酒精中灭菌数秒钟；中灭菌数秒钟；第第3，在，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min；第第4，放放入入5%10%次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液中中并并滴滴入

56、入“吐吐温温80”数数滴滴，灭灭菌菌1530min，或浸入，或浸入0.1%0.2%升汞升汞溶液中并加入溶液中并加入“吐温吐温80”数滴，灭菌数滴，灭菌510min；第第5，用用无无菌菌水水冲冲洗洗5次次。也也可可从从次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液中中取取出出后后，再再放放入入无无菌菌的的0.1M盐酸盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 69植物组织培养培养基及操3）玻璃器皿的灭菌）玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。干

57、热灭菌法干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。行灭菌。煮沸灭菌煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。菌。70植物组织培养培养基及操4 4）金属器械的灭菌）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：火焰灭菌法：即把金属器械放在即把金属器械放在95%的酒的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘

58、箱中灭菌。中灭菌。71植物组织培养培养基及操湿热灭菌法：湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，质品，放入高压锅中，121 C的温度，灭的温度，灭菌菌20 min30min。5 5）布质制品的灭菌）布质制品的灭菌 72植物组织培养培养基及操6 6）无菌操作室的灭菌）无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔灭或的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30min。使用前用。使

59、用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。73植物组织培养培养基及操7 7）操作人员在接种时一定要严格按）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行照无菌操作的程序进行74植物组织培养培养基及操在接种前要在接种前要剪除指甲剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新最好在新洁尔灭溶液中浸泡洁尔灭溶液中浸泡10min，后用，后用75%的酒精擦手，并用的酒精擦手，并用75%的酒的酒精擦拭接种精擦拭接种瓶表面瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。进行消毒

60、，以防把微生物带进超净工作台。工作人员在接种时，工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染染。如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。干，或不慎感染杂菌。 75植物组织培养培养基及操小小 结结1、外植体的选择、外植体的选择 ：优良种质、健壮植株：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大、最适的时期、适宜的大小。小。 2、外植体的灭菌方法：、外植体的灭菌方法：

61、9种常用灭菌药剂的使用及其效果种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体、外植体的灭菌方法。的灭菌方法。3、污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料、污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。程序进行）。 76植物组织培养培养基及操四、 外植体的接种和培养 1、 外植体的接种 2、 培养条件77植物组织培养培养基及操 1 1、外

62、植体的接种、外植体的接种外植体的接种外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。过程。操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。起的污染。整个接种过程均须整个接种过程均须无菌操作：无菌操作：78植物组织培养培养基及操酒精擦拭手酒精擦拭

63、手外植体消毒外植体消毒浸泡浸泡5min器器械械消消毒毒酒精灯灼烧酒精灯灼烧接种的具体操作接种的具体操作79植物组织培养培养基及操旋转灼烧旋转灼烧取外植体取外植体接种接种盖好瓶塞盖好瓶塞80植物组织培养培养基及操1操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果好的效果,进行操作前再用进行操作前再用75%的酒精擦洗双手。的酒精擦洗双手。2操作期间经常用操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止的酒精擦拭双手和台

64、面。特别注意防止“双重传递双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。81植物组织培养培养基及操3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边管口边沿沿沾染沾染的微生物的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸纸包扎瓶口和塞子，包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部

65、和试管口，相对地减少污染机会。以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。82植物组织培养培养基及操4 4工具用后及时消毒，避免交叉污染。工具用后及时消毒，避免交叉污染。5 5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止禁止不必要的谈话不必要的谈话并戴上口罩。并戴上口罩。83植物组织培养培养基及操6 6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打

66、开瓶子或试管时，的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成应拿成斜角，斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在用前浸泡在95%95%酒精中，用时在火焰上消毒，待酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后冷却后使用。使用。每次使用前均需进行用具消毒。每次使用前均需进行用具消毒。 84植物组织培养培养基及操 外植体的培养条件外植体的培养条件 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的就是在人工控制的环境条件下，使培养物

67、生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求根据植物对环境条件的不同需求进行调控进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pHpH值等。值等。85植物组织培养培养基及操1 1、光照光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，但分化器

68、官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养异养”向向“自养自养”转化，转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h12h-16h，光照强度，光照强度1000lx-5000lx1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。86植物组织培养培养基及操 2 2温温度度 离离体体

69、培培养养中中对对温温度度的的调调控控要要比比光光照照显显得得更更为为突突出出。不不同同的的植植物物有有不不同同的的最最适适生生长长温温度度，大大多多数数植植物物最最适适温温度度在在2323 C-C-3232 C C之之间间。培培养养室室一一般般所所用用的的温温度度是是2525 C2C2 C C。低低于于1515 C C或高于或高于3535 C C，对生长都是不利的。，对生长都是不利的。87植物组织培养培养基及操 3 3湿湿度度 组组织织培培养养中中的的湿湿度度影影响响主主要要有有两两个个方方面面，一一是是培培养养容容器器内内的的湿湿度度，它它的的湿湿度度条条件件常常可可保保证证100%100%

70、。二二是是培培养养室室的的湿湿度度，它它的的湿湿度度变变化化随随季季节节和和天天气气而而有有很很大大变变动动。湿湿度度过过高高过过低低都都是是不不利利的的，过过低低会会造造成成培培养养基基失失水水而而干干枯枯，或或渗渗透透压压升升高高，影影响响培培养养物物的的生生长长和和分分化化；湿湿度度过过高高会会造造成成杂杂菌菌滋滋长长，导导致致大大量污染。因此，要求室内保持量污染。因此，要求室内保持70%-80%70%-80%的相对湿度。的相对湿度。88植物组织培养培养基及操4 4氧气氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决需要氧气。在液体培养

71、中，振荡培养是解决通气的良好办法。通气的良好办法。89植物组织培养培养基及操 低低CTK/IAA外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根脱脱分分化化再再分分化化低低CTK/IAA根根 完完 整整 植植 株株生长调节物质控制器官分化的模式生长调节物质控制器官分化的模式芽芽高高CTK/IAA低低CTK/IAA90植物组织培养培养基及操91植物组织培养培养基及操 不不定定芽芽形形成成- - - -多多细细胞胞参参与与胚状体形成过程-单细胞参与体细胞胚的发育过程92植物组织培养培养基及操五、试管苗的驯化与移栽五、试管苗的驯化与移栽试管苗的特点1.1.试管苗的生态环境试管苗的生态环境 组织培养中培育出来的苗

72、通常称组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培试管苗或组培苗。苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器皿中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系皿中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系统。统。 与外界环境条件相比具有以下与外界环境条件相比具有以下4 4大差异，即大差异，即高温、高温、高湿、弱光和无菌。高湿、弱光和无菌。93植物组织培养培养基及操（1 1）高温且恒温高温且恒温 在在植植物物试试管管苗苗整整个个生生长长过过程程中中，通通常常均均采采用用恒恒温温培培养养，即即使使某某一一阶阶段段稍稍有有变变动动，温温差差也也是是极极小小的的；并并且且

73、在在培培养养过过程程中中，通通常常温温度度控控制制在在252522，有有的的植植物物需需将将温温度度控控制制得得更更高高；而而外外界界环环境境条条件件，温温度度处处于于不不断断变变化化之之中中，温温度度的的调调节节完完全全是是由由自自然然界界太太阳阳辐辐射射的的日日辐辐射射量量决决定定的的，温温差差很很大大，而而且且一一般般不不会会达达到到252522。94植物组织培养培养基及操（2 2）高湿）高湿 植植物物组组织织培培养养中中试试管管或或培培养养瓶瓶内内的的水水分分移移动动有有2 2条条途途径径，一一是是试试管管苗苗吸吸收收的的水水分分，从从叶叶面面气气孔孔蒸蒸腾腾；二二是是培培养养基基向向

74、外外蒸蒸发发，而而后后水水汽汽凝凝结结又又进进入入培培养养基基。这这种种循循环环就就是是培培养养瓶瓶内内的的水水分分循循环环，其其循循环环的的结结果果造造成成培培养养瓶瓶内内空空气气的的相相对对湿湿度度接接近近于于100100，远远远远大大于于培培养养瓶瓶外外的的空空气气湿湿度度，所所以以试试管管苗苗的的蒸蒸腾腾量量极极小小。可可见见培培养养瓶瓶内内的的水水分分状状态态直直接接影影响响着着试试管管苗苗的的生生长长和和各各种种生生理活性。理活性。95植物组织培养培养基及操（3 3）弱光）弱光 组组织织培培养养中中的的光光强强与与太太阳阳光光相相比比一一般般很很弱弱，故故幼幼苗一般生长也较弱，经受

75、不了太阳光的直接照射。苗一般生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。96植物组织培养培养基及操（4 4）无菌）无菌 不不仅仅培培养养基基无无菌菌，而而且且试试管管苗苗也也无无菌菌。在在移移栽栽过过程程中中试试管管苗苗要要经经历历由由无无菌菌向向有有菌菌的的转转换换。这这一一点点若若不不注注意意，也也会会引引起起试试管管苗苗移移栽栽过过程程中中的的死死亡亡。另另外，试管苗还处在一种特殊的气体环境中。外，试管苗还处在一种特殊的气体环境中。 以以上上这这些些特特点点都都决决定定了了试试管管苗苗移移栽栽前前后后的的环环境境条条件件有有极极大大的的差差异异，只只有有有有效效地地使使试试管管苗苗适适应应这这

76、种种差差异异，才才能能使使之之移移栽栽成成活活，这这就就需需要要试试管管苗苗有有一一定定的驯化时期的驯化时期。97植物组织培养培养基及操2. 2. 试管苗的特点试管苗的特点试管苗与常规苗相比具有如下特点：试管苗与常规苗相比具有如下特点：1 1、试管苗生长、试管苗生长细弱细弱，茎、叶表面，茎、叶表面角质层角质层不发达；不发达； 2 2、试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用、试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用功能较差功能较差； 3 3、试管苗的叶片、试管苗的叶片气孔数目少气孔数目少，活性差，活性差4 4、试管苗根的吸收功能弱。、试管苗根的吸收功能弱。98植物组织培养培养基及操二、试管苗的

77、驯化 驯化的目的驯化的目的: :在于提高试管苗对外界环境条在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。提高试管苗的移栽成活率。99植物组织培养培养基及操 驯化的原则：应从驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有菌温度、湿度、光照及有菌等环境等环境要素进行，要素进行，驯化开始驯化开始数天内，应和培养时的环境条件数天内，应和培养时的环境条件相似；相似；驯化后期驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。达到逐步适应的目的。 100植物

78、组织培养培养基及操 驯化的方法：驯化的方法： 驯驯化化一一般般在在试试管管苗苗移移栽栽前前进进行行，首首先先进进行行移移栽栽前前的的驯驯化化锻锻炼炼（即即练练苗苗），其其具具体体方方法法：将将长长有有完完整整试试管管苗苗的的试试管管或或三三角角瓶瓶由由培培养养室室转转移移到到半半遮遮荫荫的的自自然然光光下下进进行行锻锻炼炼，在在自自然然光光下下恢恢复复植植物物体体内内叶叶绿绿体体的的光光合合作作用用能能力力和和健健壮壮度度，并并打打开开瓶瓶盖盖注注入入少少量量自自来来水水使使幼幼苗苗逐逐渐渐降降低低温温度度，转转向向有有菌菌，这这样样幼幼苗苗周周围围的的环环境境就就会会逐逐步步与与自自然然环境

79、相似。驯化一般进行环境相似。驯化一般进行1 12 2周周。101植物组织培养培养基及操三、试管苗的移栽三、试管苗的移栽 试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有：试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有：常规移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。常规移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。 102植物组织培养培养基及操1 1常规移栽法常规移栽法 常常规规移移栽栽法法是是指指将将试试管管苗苗在在生生长长素素浓浓度度高高的的培培养养基基上上诱诱导导生生根根，当当获获得得大大量量的的不不定定根根后后，打打开开培培养养瓶瓶注注入入少少量量自自来来水水，在在半半遮遮光光下下驯驯化化3 35d5d，然然后后取取出出洗洗

80、去去培培养养基基，移移栽栽到到无无菌菌的的混混合合土土（如如沙沙子子：蛭蛭石石=1=1：1 1）中中，保保持持一一定定的的温温度度和和水水分分，当当长长出出2 23 3片片新新叶时就可将其移栽到叶时就可将其移栽到田间或盆钵田间或盆钵的方法。的方法。103植物组织培养培养基及操2 2直接移栽法直接移栽法 直接移栽法是指直接将试管苗移栽直接移栽法是指直接将试管苗移栽到盆钵的方法。到盆钵的方法。3 3嫁接移栽法嫁接移栽法 嫁接移栽法是指选取嫁接移栽法是指选取生长良好的同生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。据嫁接的方法。据

81、王清连王清连等人对棉花的试管苗进行嫁接等人对棉花的试管苗进行嫁接移栽试验表明，试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相移栽试验表明，试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相比优点见下表：比优点见下表：104植物组织培养培养基及操试管苗试管苗种类种类移栽方法移栽方法移栽移栽 植株数植株数成活成活 植株数植株数成活率成活率（% %）嫁接移栽法嫁接移栽法3535333394.2994.29壮苗壮苗常规移栽法常规移栽法5050242448.0048.00直接移栽法直接移栽法21210 00.000.00嫁接移栽法嫁接移栽法3030212170.0070.00弱苗弱苗常规移栽法常规移栽法27272 27.417.41直

82、接移栽法直接移栽法15150 00.000.00表表2-4 2-4 嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果105植物组织培养培养基及操四、影响试管苗移栽成活率的因素 影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内因与外因。不同的植物和不同的试管苗种类对移栽的因与外因。不同的植物和不同的试管苗种类对移栽的具体要求是不同的。但是总的来说，提高试管苗移栽具体要求是不同的。但是总的来说，提高试管苗移栽成活率的途径有以下几种。成活率的途径有以下几种。106植物组织培养培养基及操 试管苗的驯化试管苗的驯化蓝莓蓝莓107植物组织培养培养基及操1 1

83、试管苗的生理状况（选择壮苗）试管苗的生理状况（选择壮苗） 试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。同一种植物的试管苗，其壮苗比弱苗移栽后成活率高。同一种植物的试管苗，其壮苗比弱苗移栽后成活率高。108植物组织培养培养基及操试管苗种类移栽方法移栽 植株数成活 植株数成活率（%）嫁接移栽法353394.29壮苗常规移栽法502448.00直接移栽法2100.00嫁接移栽法302170.00弱苗常规移栽法2727.41直接移栽法1500.00 嫁接移栽法嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果移栽棉花试管苗的效果109植物组织培养培养基及操2 2植物生长调节物质

84、植物生长调节物质 一一般般来来说说生生长长素素因因为为能能促促进进生生根根，故故也也能能提提高高试试管管苗苗移移栽栽的的成成活活率率。但但是是，不不同同的的植植物物有有其其适适宜宜的的生生长长素素种种类类。如如在在月月季季的的试试验验中中发发现现，以以NAANAA诱诱导导生生根根和和提提高高移移栽栽成成活活率率效效果果最最好好；而而IAAIAA并并不不理理想想，当当IAAIAA的的浓浓度度超超过过1mg/L1mg/L时时，反反而而急急剧剧降降低低移移栽栽成成活活率率。细细胞胞分分裂裂素素一一般般会会抑抑制制根根的的生生长长，不不利利于于移移栽栽。如如在在月月季季的的试试验验中中表表明明，无无论

85、论是是BABA或或2-ip2-ip对对生生根根和和移移栽栽都都有有抑抑制制效效应，即使在很低的浓度下也可发现。应，即使在很低的浓度下也可发现。110植物组织培养培养基及操3 3无机盐浓度无机盐浓度 试试验验结结果果表表明明，降降低低无无机机盐盐的的浓浓度度对对植植物物生生根根效效果较好，有利于移栽成功。果较好，有利于移栽成功。111植物组织培养培养基及操4 4活性炭活性炭 在在生生根根培培养养基基中中加加入入少少许许活活性性炭炭，对对某某些些月月季季的的嫩嫩茎茎生生根根有有良良好好作作用用，尤尤其其是是采采用用酸酸、碱碱和和有有机机溶溶剂剂洗过的活性炭，效果更佳。洗过的活性炭，效果更佳。112

86、植物组织培养培养基及操 5 5环境因子环境因子 环境条件也影响试管苗移栽的效果，关键是环境条件也影响试管苗移栽的效果，关键是控制好移栽前控制好移栽前10d10d的光、温、湿。的光、温、湿。做好适当遮阴工做好适当遮阴工作，避免太阳光直射作，避免太阳光直射造成试管苗迅速失水而死亡。造成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持在温度一般保持在25253030为好。开始几天最好为好。开始几天最好用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在85%85%以上。以上。113植物组织培养培养基及操 6 6从无菌向有菌逐渐过渡从无菌向有菌逐渐过渡 试管苗出管后，要将其上面的培养

87、基洗净，以试管苗出管后，要将其上面的培养基洗净，以免杂菌滋长。对于移栽后成活比较困难的植物，免杂菌滋长。对于移栽后成活比较困难的植物，第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。移栽成活率。114植物组织培养培养基及操第三节第三节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施115植物组织培养培养基及操葡萄嫩茎接种葡萄嫩茎接种48h48h马铃薯茎尖接种马铃薯茎尖接种40d40d116植物组织培养培养基及操 褐变褐变：是指外植体在：是指外植体在培养过程中培养过程中自身组自身组织从表面向培养基织从表面向培养基释放出褐色物质释放出褐色物质，以致

88、培养基逐渐变以致培养基逐渐变成褐色，外植体也成褐色，外植体也进一步变褐而死亡进一步变褐而死亡的现象。的现象。一、褐变的概念一、褐变的概念117植物组织培养培养基及操 褐变的发生与外植体组织中所含的褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物酚类化合物多少多少和和多酚氧化酶活性多酚氧化酶活性有直接关系。酚类很不稳有直接关系。酚类很不稳定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在会在酪氨酸酶酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的等的作用下，与外植体组织中的蛋白蛋白质质发

89、生聚合，进一步引起其他发生聚合，进一步引起其他酶系统酶系统失活，从而导失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。 二、褐变的原因二、褐变的原因118植物组织培养培养基及操 植物材料不同，褐变的程度有所不同。三、影响褐变的因素三、影响褐变的因素枣枣蝴蝶兰蝴蝶兰苹果苹果环境、培养基、转接周期不同，褐变的程度不同。119植物组织培养培养基及操1、植物材料、植物材料（1）基因型）基因型 不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。变发生的频率、严重

90、程度都存在很大差别。木本植物（木质素）、单宁含木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物一般比木本植物一般比草本植物容易发生褐变。草本植物容易发生褐变。120植物组织培养培养基及操苹苹 果果苜苜 蓿蓿121植物组织培养培养基及操 （2）材料年龄）材料年龄

91、 幼龄材料一般都比成龄材料褐变轻的趋幼龄材料一般都比成龄材料褐变轻的趋势。势。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。Chever 分析欧洲栗的酚类含量变化的结果表明，幼分析欧洲栗的酚类含量变化的结果表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。平平吉成吉成从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。122植物组织培

92、养培养基及操梨一年生枝、二年生枝接种梨一年生枝、二年生枝接种3d3d123植物组织培养培养基及操（3 3）取材部位取材部位 YuYu和和MeredithMeredith在葡萄上发现从在葡萄上发现从侧生蔓切取茎尖侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活，进进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活，进一步分析酚类含量发现前者比后者少。而一步分析酚类含量发现前者比后者少。而苹果则顶苹果则顶芽芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。124植物组织培养培养基及操 （4

93、4）取材时期取材时期 多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。重要。CheverChever报道，欧洲栗在报道，欧洲栗在3 3月月1515日日-30-30日醌日醌类物质形成少，而在类物质形成少，而在5 5月月-6-6月醌类物质明显提高。月醌类物质明显提高。 125植物组织培养培养基及操蒋迪军和牛建新报道，金冠苹果茎尖小于蒋迪军和牛建新报道，金冠苹果茎尖小于0.5mm0.5mm时褐变严重时褐变严重

94、, ,当茎尖长度在当茎尖长度在5mm-15mm5mm-15mm时褐时褐变较轻变较轻, ,成活率可达成活率可达85%85%。在多个苹果品种上试。在多个苹果品种上试验结果表明，验结果表明，用用5mm-10mm5mm-10mm长的茎尖进行培养效长的茎尖进行培养效果最好，茎尖如果太小很容易发生褐变。果最好，茎尖如果太小很容易发生褐变。另外，另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。粗的可切得长些。 （5）外植体大小）外植体大小126植物组织培养培养基及操 主要是光照与温度。主要是光照与温度。温度过高或光照过温度过高或光照过强，强，均可使多酚氧

95、化酶的活性提高，从而加均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。速外植体的褐变。2、培养条件127植物组织培养培养基及操 （1）培养基状态）培养基状态 由于培养基中琼脂的用量和由于培养基中琼脂的用量和pH值的高低不值的高低不同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培养基。许多试验证明，养基。许多试验证明，液体培养基可以有效克服外植体液体培养基可以有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而培养基中，外植体溢出的有毒物质可

96、以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。对外植体造成的伤害较轻。3 3、培养基、培养基128植物组织培养培养基及操（2）无机盐）无机盐 在初代培养时，培养基中无机盐浓在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。原因是无机盐中的有些离子，如褐变。原因是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子，因此辅因子，因此盐浓度过高会增加这些酶的活性盐浓度过高会增加这些酶的活性，酶又进一步促进酚类合成与氧化。酶又进一步促进酚类合成与氧化。 129植物组织培养培养

97、基及操（3 3）植物生长调节物质植物生长调节物质 初代培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存在是初代培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存在是影响褐变的主要原因，此时去除生长调节物质可减轻褐变。影响褐变的主要原因，此时去除生长调节物质可减轻褐变。细胞分裂素细胞分裂素6-BA6-BA或或KTKT不仅能促进酚类化合物的合成，而且不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养中明显。中明显。而而生长素类如生长素类如2 2，4-D4-D和和IAAIAA可延缓酚类化合物的可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。合成，减轻

98、褐变现象发生。 130植物组织培养培养基及操（4 4）抗氧化剂）抗氧化剂 培养基中加入抗氧化剂可改培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。抑制酚类氧化，减轻褐变。 131植物组织培养培养基及操（5 5）吸附剂）吸附剂 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，这在吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，这在东北红豆杉、猪笼草、鹤望兰、杜鹃花、苹果、东北红豆杉、猪笼草、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。在倒挂金钟桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。在倒挂

99、金钟茎尖培养中只加入茎尖培养中只加入0.01%PVP便对褐变有抑制作用。便对褐变有抑制作用。 132植物组织培养培养基及操（6 6）pHpH值值 培养基的培养基的pHpH值较低时，可降低多酚氧化值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pHpH值值升高则明显加重褐变。升高则明显加重褐变。133植物组织培养培养基及操4、材料转瓶周期、材料转瓶周期 对于易褐变的材料，接种后转瓶时间对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变

100、缩短转瓶周期可减轻褐变。在山。在山月桂树的茎尖培养中，接种后月桂树的茎尖培养中，接种后12h24h，便转入，便转入液体培养基液体培养基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似经验褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似经验 。134植物组织培养培养基及操褐变的预防措施褐变的预防措施1选择适宜的外植体选择适宜的外植体 外植体应选择分生能力较外植体应选择分生能力较强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。等材料培养褐变程度比较轻。2采用适宜的培养基和光温条件采用适宜的

101、培养基和光温条件 培养基的无机培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。，可以显著减轻材料的褐变。 135植物组织培养培养基及操3在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 在在培养基中加入培养基中加入0.1%0.5%的的活性炭活性炭对吸附酚类氧化物对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外

102、植体褐变的明显效果。如在培养基察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。如在培养基中加中加抗坏血酸抗坏血酸、血清蛋白、有机酸、蛋白质、血清蛋白、有机酸、蛋白质、氨基酸氨基酸等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。4缩短转瓶周期缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的这是组培中控制褐变常用且有效的方法。方法。136植物组织培养培养基及操第四节、玻璃化现象及其预防措施第四节、玻璃化现象及其预防措施玻璃化现象 是指组培苗出现叶、嫩梢是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶呈水晶透明透

103、明或半透明或半透明，植株，植株矮小肿胀，矮小肿胀，失绿失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱脆弱易碎易碎；叶表；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织仅有海绵组织；体内体内含水量高含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。质、纤维素和木质素含量低的现象。 137植物组织培养培养基及操二、玻璃化苗的危害性 由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养全，分化能力大大降低，因而很难继

104、续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。 138植物组织培养培养基及操三、玻璃化的原因 玻璃化的起因是细胞生长过程中的玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变环境变化化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。 产生玻璃化苗的因素主要有产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。等。139植物组织培养培养基及操1、激素浓度 激素浓度增加尤其是激素浓度增加尤其是细胞分裂素细胞分裂素浓度浓度提高（或细胞分裂素与

105、生长素比例高），易导致提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。玻璃化苗的产生。 140植物组织培养培养基及操2、琼脂浓度 培养基中培养基中琼脂琼脂浓度低浓度低时玻璃化苗比例增加，时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。脂的浓度一定要适当。 141植物组织培养培养基及操3、温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好，适宜的温

106、度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。少，且发生的时间较晚。 142植物组织培养培养基及操4 4、光照时间、光照时间 不同的植物对光照的要求不同，满足植物的不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在12h12h14h14h光照下都能生长良好光照下都能生长良好，光照时数大于，光照时数大于16h16h时，玻璃化苗的比例明显增加。时，玻璃化苗的比例明显增加。 14

107、3植物组织培养培养基及操5、通风条件 试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、生长量、瓶内空间、培养时培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。 144植物组织培养培养基及操6、离子水平 植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果营养离子之营养离子

108、之间失去平衡间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。 母液名称母液名称药品品名称名称原配方量原配方量(mg)/L大量元素母液大量元素母液NH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170145植物组织培养培养基及操四、预防玻璃化的措施1 1适当控制培养基中无机营养成分适

109、当控制培养基中无机营养成分 大多数植物在大多数植物在MSMS培养基上生长良好，玻璃化苗培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于的比例较低，主要是由于MSMS培养基的硝态氮、钙、培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中增加培养基中钙、钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素的含量，降低氮和氯元素比例，特别是比例，特别是降低铵态氮降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。可减少玻璃化苗的比例。146植物组织培养培养基及操2 2适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度适当提高培养基中蔗糖和

110、琼脂的浓度 适适当当提提高高培培养养基基中中蔗蔗糖糖的的含含量量，可可降降低低培培养养基基中中的的渗渗透透势势，减减少少外外植植体体从从培培养养基基中中可可获获得得的的水水分分；而而适适当当提提高高培培养养基基中中琼琼脂脂的的含含量量，可可降降低低培培养养基基的的衬衬质质势势，造造成成细细胞胞吸吸水水阻阻遏遏，也也可可降降低低玻玻璃璃化化。如如将将琼琼脂脂浓浓度度提提高高到到1.1%1.1%时时，洋洋蓟蓟的的玻玻璃璃化化苗苗完完全全消消失。失。147植物组织培养培养基及操衬质势衬质势因衬质成分表面吸附力因衬质成分表面吸附力(细胞胶体物质亲水性和毛细管细胞胶体物质亲水性和毛细管对自由水束缚对自由

111、水束缚)而产生的水势。而产生的水势。由于某种原因而降低的水化学势而言。吸附在土壤粒由于某种原因而降低的水化学势而言。吸附在土壤粒子和细胞壁微纤维上的水，可分为（子和细胞壁微纤维上的水，可分为（1）基于土壤粒）基于土壤粒子表面强有力的吸附力，主要是子表面强有力的吸附力，主要是23层的水分子；层的水分子；（2）表现为来自弯月形液面的表面张力的毛细管水；）表现为来自弯月形液面的表面张力的毛细管水；（3）表面电荷与水的氢结合所吸附的水。在这些情）表面电荷与水的氢结合所吸附的水。在这些情况下，作用力可使水的势能降低。况下，作用力可使水的势能降低。 148植物组织培养培养基及操 渗透势渗透势 溶液中由溶质

112、存在所产生的水势。因为溶质对水分子的吸附作用，使水的活性溶液中由溶质存在所产生的水势。因为溶质对水分子的吸附作用，使水的活性下降，所以和纯水相比，含有溶质的水做功的能力降低了，故下降，所以和纯水相比，含有溶质的水做功的能力降低了，故渗透势为负值渗透势为负值。细胞吸水情况取决于细胞水势，典型的水势是由三个势组成的：细胞吸水情况取决于细胞水势，典型的水势是由三个势组成的：w=+p+g 。w为细胞水势，为细胞水势，为渗透势，为渗透势，p为压力势，为压力势，g为重力势。为重力势。渗透势亦称溶质势渗透势亦称溶质势，渗透势是由于溶质颗粒的存在，降低了水的自由能，因而，渗透势是由于溶质颗粒的存在，降低了水的

113、自由能，因而其水势低于纯水的水势其水势低于纯水的水势,这种水势差即为渗透势。因为这种水势差即为渗透势。因为纯水水势被定为零纯水水势被定为零，在标，在标准压力下，溶液的渗透势等于溶液的水势，溶液的的渗透势决定于溶液中溶质准压力下，溶液的渗透势等于溶液的水势，溶液的的渗透势决定于溶液中溶质颗粒总数。颗粒总数。 149植物组织培养培养基及操3 3适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 细细胞胞分分裂裂素素和和赤赤霉霉素素可可以以促促进进芽芽的的分分化化，但但是是为为了了防防止止玻玻璃璃化化现现象象，应应适适当当减减少少其其用用量量，或或增增加加生生长长素素的的比比例例。在在

114、继继代代培培养养时时，要要逐逐步步减减少少细细胞胞分分裂素的含量。裂素的含量。150植物组织培养培养基及操4 4增加自然光照，控制光照时间增加自然光照，控制光照时间 在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶叶变红变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不光照时间不宜太长，大多数植物以宜太长，大多数植物以10h 10h 14h14h为宜为宜；光照强度在；光照强度在1500lx1500lx1800lx1800lx之间，可以满足植物生长的要

115、求。之间，可以满足植物生长的要求。151植物组织培养培养基及操5 5控制好温度控制好温度 培培养养温温度度要要适适合合植植物物的的正正常常生生长长发发育育。如如果果培培养养室室的的温温度度过过低低，应应采采取取增增温温措措施施。热热击击处处理理，可可防防止止玻玻璃璃化化的的发发生生。如如用用4040热热击击处处理理瑞瑞香香愈愈伤伤组组织织培培养养物物可可完完全全消消除除再再生生苗苗的的玻玻璃璃化化，同同时时还还能能提提高愈伤组织芽的分化频率。高愈伤组织芽的分化频率。152植物组织培养培养基及操6 6改善培养器皿的气体交换状况改善培养器皿的气体交换状况 如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。如

116、使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。153植物组织培养培养基及操7 7在培养基中添加其它物质在培养基中添加其它物质 在在培培养养基基中中加加入入间间苯苯三三酚酚或或根根皮皮苷苷或或其其它它添添加加物物，可可有有效效地地减减轻轻或或防防治治试试管管苗苗玻玻璃璃化化，如如添添加加马马铃铃薯薯法法可可降降低低油油菜菜的的玻玻璃璃化化苗苗的的产产生生频频率率，而而用用0.5mg/L0.5mg/L多多效效唑唑或或10mg/L10mg/L的的矮矮壮壮素素可可减减少少重重瓣瓣丝丝石石竹竹试试管管苗苗玻玻璃璃化化的的发发生生；而而添添加加1.5 1.5 g/Lg/L2.5g/L2.5g/L的的聚聚乙乙稀稀醇醇成成为为防防治治苹苹果果砧砧木木玻玻璃璃化化的的措措施施。在在培培养养基基中中加加入入0.3%0.3%的的活活性性炭炭还还可可降降低低玻玻璃璃苗苗的的产产生生频频率率，对防止产生玻璃化有良好作用。对防止产生玻璃化有良好作用。154植物组织培养培养基及操