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1、微生物包括五类：微生物包括五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物原核生物一、基础知识： (一)微生物:绝大多微生物与传染病无关， 90%以上的微生物对人类有利。 真核生物真核生物(二)细菌 1、形态图图1-1 常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典型形态A.球菌球菌 B.杆菌杆菌 C.弧菌弧菌( (二二) )细菌细菌 2 2、结构、结构拟核拟核细胞质细胞质细胞膜细胞膜细胞壁细胞壁基本结构基本结构特殊结构特殊结构(有的有有的有质粒质粒)根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和能源和碳源碳源的不同将细菌的不同将细菌分为两大营养类型。分为两大营养类型。自养菌自养菌: :异
2、养菌异养菌: : 光能自养型光能自养型: :光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型: :硝化细菌硝化细菌, ,铁细菌铁细菌, ,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌 腐生菌腐生菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌( (二二) )细菌细菌 3 3、细菌的营养类型、细菌的营养类型 二、大肠杆菌革兰氏染色革兰氏阳性革兰氏阳性革兰氏阴性革兰氏阴性单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖时，上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。单菌体在单菌体在固体培养
3、基固体培养基上大量繁殖时，就会形成上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞子细胞群体群体，叫做单菌落，叫做单菌落。菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。菌落、单菌落菌落、单菌落 微生物的培养与观察微生物的培养与观察在自然界中，微生物呈混合状态存在，要想获得所需菌种，则必须把它们从中分离出来并加以纯化培养。分离分离：将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出
4、来的技术叫作分离。纯化纯化：在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。概念分离技术主要是稀释和选择培养。稀释：稀释：是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为划线分离划线分离法和涂布分离法法和涂布分离法。选择培养：选择培养：如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。概念三、大肠杆菌的培养和分离培养基的培养基
5、的配制配制灭菌灭菌超净工作台超净工作台倒平板倒平板接种和接种和培养培养分离培养分离培养菌种菌种保存保存(一)培养基的配制 1、原则根据所培养的微生物种类、培养目的等，选择根据所培养的微生物种类、培养目的等，选择原料配制培养基。如：原料配制培养基。如：细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素营养要协调营养要协调不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有碳源碳源、氮源氮源、水水、无机盐无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生等营养物质，另外还需要满足微生物生长对长对pH pH 、氧气氧气、渗透压渗透压的要求的要求LB培养基(通用的细菌培养基)蛋白胨蛋白胨0.5g0.5g，酵母提取物，酵母提取
6、物0.25g0.25g，氯，氯化钠化钠0.5g, 0.5g, 水水50mL50mL2、培养基的配制流程 称量、溶解称量、溶解调节调节PHPH值值分装加塞分装加塞倒皿倒皿 摆斜摆斜面面灭菌灭菌3、培养基分类液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基基础培养基基础培养基物理状态物理状态成分成分用途用途合成培养基合成培养基半合成培养基半合成培养基天然培养基天然培养基培养基的用途培养基的用途液体培养基：液体培养基：扩增细菌扩增细菌、工业生产、工业生产固体培养基：固体培养基：纯化（分离），纯化（分离），鉴定、保藏菌种鉴定、保藏菌种1.1.无菌
7、技术的概念无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。污染的方法。成功地培养微生物的关键。成功地培养微生物的关键。 ( (二二) )细菌的培养细菌的培养无菌技术无菌技术2.2.消毒消毒与与灭菌灭菌的概念及两者的区别的概念及两者的区别 消毒：消毒：指杀灭病原微生物的方法；指杀灭病原微生物的方法；灭菌：灭菌：指杀灭或清除环境中一切微生物（包括指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽芽孢孢、孢子孢子）的方法。）的方法。灼烧灭菌灼烧灭菌3、常用灭菌的方法：、常用灭菌的方法：高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：1kg/cm1kg/cm2 2
8、、121 121 下下维持维持15-30min.15-30min.紫外光灭菌法紫外光灭菌法 （三）倒平板（三）倒平板 灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台(超净台超净台)上倒入上倒入4个培养皿个培养皿中，倒后立即置于中，倒后立即置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面平皿底部，待凝，使之形成平面注意事项：注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手
9、用酒精棉球消毒菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三另外三指持三角瓶角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染基，造成污染. （四）大肠杆菌的扩大培养（四）大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大
10、肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.（五）大肠杆菌的分离培养（五）大肠杆菌的分离培养分离方法分离方法: :划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法划线分离法划线分离法连续划线法连续划线法 交叉划线法（分区划线法）交叉划线法（分区划线法）u1.1.划线分离法：划线分离法：目
11、的：使混合的细菌呈目的：使混合的细菌呈单个分散单个分散生长，形成生长，形成 单菌落，以获得单菌落，以获得纯菌纯菌。方法：方法： 分区划线法分区划线法：适用于含菌量较多的标本：适用于含菌量较多的标本 连续划线法连续划线法：适用于含菌量较少的标本：适用于含菌量较少的标本1.划线分离法（五五）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离注意事项注意事项:1.接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液2.培养基不同位置培养基不同位置连续划线多次连续划线多次.划线划线首尾不能相接，首尾不能相接，划线不能划破培养基。划线不能划破培养基。3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1224h1、划线分离法、划线分离法
12、讨论每次使用接种环之前都要进行灼烧，每次使用接种环之前都要进行灼烧，为什么？为什么？讨论1.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧每次划线前灼烧接种环接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.(稀释)涂布分离法n n取菌取菌悬液悬液2.稀释稀释涂布法n n将菌液均
13、匀涂布分散将菌液均匀涂布分散37倒置培养倒置培养按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养平板菌落计数平板菌落计数划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。（六六）大肠杆菌分离后保存）大肠杆菌分离后保存1 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法、长期保存：甘油冷冻管藏法基本知识点大肠杆菌的特点大肠杆
14、菌的特点单菌落的作用单菌落的作用培养基配制的要素培养基配制的要素灭菌及其条件灭菌及其条件LBLB液体培养基、固体培养基的用途液体培养基、固体培养基的用途细菌的分离方法细菌的分离方法细菌培养的条件细菌培养的条件如何检测接种前培养基是否被污染？将未接种的培养基在适宜条件下放置适将未接种的培养基在适宜条件下放置适宜时间，观察培养基上是否有菌落产生。宜时间，观察培养基上是否有菌落产生。三、大肠杆菌的培养和分离培养基的培养基的配制配制灭菌灭菌超净工作台超净工作台倒平板倒平板接种和接种和培养培养分离培养分离培养菌种菌种保存保存 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧为什么在操作的第一步以及每
15、次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接每次划线前灼烧接种环是为了种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐
16、渐减少，以便得到单菌落。线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结划线结束后灼烧接种环，能及时束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。避免细菌污染环境和感染操作者。划线分离法划线分离法 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：答：划线后，线条末端细
17、菌的数目比线条划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。1.如何检测接种前培养基是否被污染？如何检测接种前培养基是否被污染？将未接种的培养基在适宜条件下放置适宜时间，将未接种的培养基在适宜条件下放置适宜时间，观察培养基上是否有菌落产生。观察培养基上是否有菌落产生。2.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？（1 1）胆大心细，操作快捷。）
18、胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。染概率。（3 3）注意微生物生长条件，如）注意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温度、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜3737度；霉菌喜酸，喜度；霉菌喜酸，喜糖，喜糖，喜25-3025-30度度思考思考3.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1 1）菌落的形态，看是否湿润，透明，粘稠，颜色等。）菌落的形态，看是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（
19、2 2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3 3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。4.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正倒放培养皿则会使
20、水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。分成单菌落，达不到分离目的。5.实验完成后实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。抛弃。实验实验2 2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为
21、氮源的微生物实验步骤：观察观察注意：尿素经过细菌过滤器注意：尿素经过细菌过滤器灭菌后加入灭菌后加入培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌倒平板倒平板接种接种LB全营养培养基（对照组）全营养培养基（对照组）尿素固体培养基（实验组）尿素固体培养基（实验组）玻璃刮刀、玻璃刮刀、涂布分离涂布分离培养培养对照组：对照组：实验组：实验组：制备土壤稀释液制备土壤稀释液倒置倒置，37恒温培养箱，恒温培养箱，24-48h左右左右菌落数量和种类多而杂菌落数量和种类多而杂菌落少而纯，菌落周围出现菌落少而纯，菌落周围出现红色区域红色区域LB培养基上培养基上10-4 、10-5稀稀释液涂布结果释液涂布结果尿素培养基上尿素培养基上10-4 、10-5稀释稀释液涂布结果液涂布结果37恒温培养恒温培养微量移液器的使用
