第13章免疫学技术与方法

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1、第十三章第十三章免免 疫疫 学学 技技 术术 与与 方方 法法1免疫学技术免疫学技术是指利用抗原抗体反应的特异是指利用抗原抗体反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的制备方法。立这些技术的制备方法。分为：分为： 免疫检测技术（血清学技术）免疫检测技术（血清学技术） 细胞免疫技术细胞免疫技术 免疫制备技术免疫制备技术免疫学技术免疫学技术2血清学技术的类型血清学技术的类型 （免疫检测技术）（免疫检测技术）凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体结合反应补体结合反应免疫标记技术免疫标记技术3指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免指与细胞免疫有关的各

2、种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。细胞免疫技术细胞免疫技术淋巴细胞分离与检测淋巴细胞分离与检测淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定细胞因子测定细胞因子测定体内细胞免疫试验体内细胞免疫试验E E玫瑰花环试验玫瑰花环试验T T细胞亚群检测技术细胞亚群检测技术淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验细胞毒性细胞毒性T T细胞试验细胞试验巨噬细胞移动抑制试验巨噬细胞移动抑制试验白细胞介素测定白细胞介素测定干扰素测定干扰素测定皮肤试验皮肤试验4免疫制备技术免疫制备技术抗原制备抗原制备抗体制备抗体制备抗体和细胞因子纯化抗体和细胞因子纯化淋巴细胞制备淋巴细胞制备抗体

3、标记与致敏抗体标记与致敏指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。5体内体内杀菌、溶菌、调理、中和毒素杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤免疫病理损伤超敏反应、免疫性疾病等超敏反应、免疫性疾病等体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等又称：又称：serological reaction血清学实验血清学实验第一节第一节 抗原抗体反应原理及特点抗原抗体反应原理及特点6一、一、抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理基本原理：基本原理：特异性（特异性

4、（epitope-HVR）可见性（可见性（凝集、沉淀、溶血等凝集、沉淀、溶血等）结合力结合力(4种种)7高度互补高度互补（epitope-HVR）紧密接触紧密接触结合力结合力抗原抗体带电离子带电离子异性相吸异性相吸静电引力静电引力分子极化分子极化范德华引力范德华引力形成氢键形成氢键氢键引力氢键引力形成疏水基团形成疏水基团 疏水作用力疏水作用力作用最小作用最小最具特异性最具特异性作用最大作用最大抗抗原原抗抗体体结结合合可见反应可见反应比例合适比例合适81.1.静电引力静电引力 指带电离子基团（如：指带电离子基团（如：NH3+和和 COO-） 之间的引力，距离越近引力越大。之间的引力，距离越近引力

5、越大。92.2.范德华力范德华力 分子间（或原子间分子间（或原子间) )相互接近，分子极化产生相互接近，分子极化产生引力引力，其作用取决于分子空间构型，如：凹槽与凸起其作用取决于分子空间构型，如：凹槽与凸起互补，抗原与抗体，酶与底物。能量小于静电引力。互补，抗原与抗体，酶与底物。能量小于静电引力。10（3 3）氢键结合力）氢键结合力 指供氢体氢原子与受氢体原子之间的引力指供氢体氢原子与受氢体原子之间的引力“氢键桥梁氢键桥梁” ，能量大于范德华引力。，能量大于范德华引力。114.4.疏水作用力疏水作用力 指疏水基团间排斥水分子，相互聚集的力。指疏水基团间排斥水分子，相互聚集的力。作作用力最强，占

6、总结合力的用力最强，占总结合力的5050。12 结合力的大小 亲亲和和力力（affinity）表示表示 亲亲合合力力（avidity）13一个抗体结合点一个抗体结合点与与一个抗原表位一个抗原表位间的结合强度。间的结合强度。 “（single point single point ）” 亲和力用平衡常数表示：亲和力用平衡常数表示：K=KK=K1 1/K/K2 2亲和力亲和力（affinity）：）：即：结合常数即：结合常数/ /解离常数解离常数 K K值越大，亲和力越高，与抗原的结合越牢固值越大，亲和力越高，与抗原的结合越牢固14亲合力（亲合力（avidity） 指整个抗体分子与抗原之间结合的强

7、度指整个抗体分子与抗原之间结合的强度 “all points-all points”与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。易解离。15二、二、抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点（一）特异性（一）特异性（specificity）概念：一种抗原只能与其相应的抗体结合起反应概念：一种抗原只能与其相应的抗体结合起反应分子基础：分子基础：Ag-ADAg-ADHVR-HVR-AbAb空间结构高度互补空间结构高度互补V VH H和和V VL L各具三个各具三个HVRHVR与与ADAD互补互补意义意义免疫学检测中常用已知免疫学检测中常用已

8、知Ag 检测未知检测未知Ab ，反之亦然。反之亦然。相对性：当抗原之间有相同或相似结构的相对性：当抗原之间有相同或相似结构的AD时时 （共同抗原）（共同抗原） 交叉反应交叉反应（cross reaction）16（二）比例性（二）比例性 (proportionality)指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗体的浓度比例适当时，才出现可见反应。体的浓度比例适当时，才出现可见反应。1929年年Heidelberger以固定以固定Ab量逐渐增加量逐渐增加Ag量的量的试验试验发现带现象。发现带现象。1977年年Green把此现象称为钩状效应（把此现象称为钩状效应（h

9、ook effect），包括前后带现象。指免疫检测中由于），包括前后带现象。指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性的现象。性的现象。17 抗原抗体反应比例性示意图抗原抗体反应比例性示意图181、带现象带现象:在抗原抗体反应等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反应,这种现象称为带现象2、等价带等价带:抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。 3、前带现象前带现象:抗原抗体反应当抗体量过剩时,

10、不出现可见反应。4、后带现象后带现象:抗原抗体反应当抗原量过剩时,不出现可见反应。19网格学说（图）抗体的两个抗体的两个FabFab段分别段分别结合两个结合两个AgAg分子，相互分子，相互交叉结合连接成巨大的交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，网格状立体聚合物，（可见）。（可见）。二者比例合适：二者比例合适：网格学说网格学说20 AbAb/Ag/Ag过剩过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。成小分子复合物（不可见）。21确定确定 的浓度非常重要，即在实验的浓度非常重要，即在实验中需对中需对Ag/Ag/AbAb

11、进行适当的进行适当的 ，调整二者，调整二者的比例，产生可见反应。的比例，产生可见反应。一般原则：固定一般原则：固定 含量（含量（ Ag/Ag/AbAb ）的浓）的浓度，稀释度，稀释 含量的含量的 ( (AbAb / Ag) / Ag)。一般可溶性一般可溶性AgAg稀释稀释 ，颗粒性颗粒性AgAg，稀释稀释 。Ag/Ab稀释稀释低低高高AgAgAbAb22（三）可逆性（三）可逆性（reversibility）解离解离1. Ag + AbAg Ab一定条件一定条件（动态平衡）（动态平衡） 动态平衡公式动态平衡公式: Ag + Ab Ag-Ab K1:结合常数；结合常数；K2：解离常数解离常数K1K

12、223（四）阶段性（四）阶段性特异性结合特异性结合两个阶段两个阶段可见反应阶段可见反应阶段数秒数分钟，数秒数分钟， 肉眼不可见肉眼不可见数分数小时数分数小时肉眼可见肉眼可见24（一）电解质（一）电解质 作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层，作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层， 使使Ag-Ag-AbAb聚集。聚集。 常用：常用：0.85% 0.85% 生理盐水，生理盐水，PBSPBS、CaCa2+2+、 MgMg2+2+等。等。 盐析（盐析（saltingsalting）即电解质浓度过高引起的非特即电解质浓度过高引起的非特异性蛋白质沉淀。异性蛋白质沉淀。三、影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的

13、因素25（二）酸碱度（二）酸碱度Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有其故多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的有的pI , pH过高或过低均可影响过高或过低均可影响Ag、Ab反应。反应。一般：一般：pH68为宜。为宜。注意：自凝现象注意：自凝现象即即pH达到或接近颗粒性抗原达到或接近颗粒性抗原的的pI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。 酸凝酸凝pH过低时造成的蛋白质自凝现象。过低时造成的蛋白质自凝现象。26（三）温度（三）温度影响反应速度影响反应速度一般：一般：151540 40 为宜，最适温度：为宜，最适温度：3737, 过高（过高（56 56 ）:

14、 Ag-: Ag-AbAb解离，解离，AgAg、AbAb变性，变性，补体失活。补体失活。冷凝集试验：冷凝集试验：由肺炎支原体感染引起的原发性非典型性肺炎患者的血清中常含有较高的寒冷红细胞凝集素，简称冷凝集素，它能与患者自身红细胞或“O”型人红细胞于4条件下发生凝集，在37时又呈可逆性完全散开。发病后第二周血清中冷凝集素效价达1：32以上，一次检查凝集价1：64或动态检查升高4倍以上时，有诊断意义。27免疫学检测技术的评价标准免疫学检测技术的评价标准Specificity（特异）：（特异）：检测信号针对性和排检测信号针对性和排他性他性Sensitivity（灵敏）：（灵敏）：可测出的最低含量可测

15、出的最低含量Simplicity（简便）：（简便）：操作是否方便操作是否方便Safety（安全）：（安全）：是否有污染，对操作者的是否有污染，对操作者的伤害伤害Saving（节约）：（节约）：性能性能/价格比价格比28免疫检验技术发展进程的主要阶段免疫检验技术发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反

16、应原理结合，加快了反应半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合29 抗原抗体反应的基本类抗原抗体反应的基本类 型型 表表反应类型反应类型 实验技术实验技术 检测方法检测方法 敏感度敏感度沉淀反应沉淀反应 液相沉淀试验液相沉淀试验 观察沉淀、检测浊度观察沉淀、检测浊度 + +，+ 琼脂凝胶扩散琼脂凝胶扩散 观察扫描沉淀线或环观察扫描沉淀线或环 + + 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 或峰或弧或峰或弧 +补体参与反应补体参与反应 补体溶血试验补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪以裸眼或光电比色

17、仪 + 补体结合试验补体结合试验 观察测定溶血现象观察测定溶血现象 +免疫标记技术免疫标记技术 荧光免疫技术荧光免疫技术 检测荧光现象检测荧光现象 + 放射免疫技术放射免疫技术 检测放射性检测放射性 + 酶标免疫技术酶标免疫技术 检测酶底物显色检测酶底物显色 + 发光免疫技术发光免疫技术 测定发光强度测定发光强度 + 生物素生物素- -亲合素技术亲合素技术 结合其它标记技术结合其它标记技术 + 金标免疫技术金标免疫技术 检测金颗粒沉淀检测金颗粒沉淀 +凝集反应凝集反应 直接凝集试验直接凝集试验 用裸眼、放大镜或显用裸眼、放大镜或显 + + 间接凝集试验间接凝集试验 微镜观察红细胞或胶微镜观察红

18、细胞或胶 + 凝集抑制试验凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集乳等颗粒和各种凝集 + 协同凝集试验协同凝集试验 现象现象 + 抗球蛋白试验抗球蛋白试验 +中和反应中和反应 病毒中和试验病毒中和试验 病毒感染性丧失病毒感染性丧失 + + 毒素中和试验毒素中和试验 外毒素毒性丢失外毒素毒性丢失 +30一、凝集反应一、凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。眼可见凝集块称为凝集反应。 第二节第二节 常见免疫检测方

19、法常见免疫检测方法31322 2、凝集反应的用途、凝集反应的用途（1 1）定性检测）定性检测 即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性（2 2）定量检测）定量检测 即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现50%凝集的最高稀释度作为滴度。凝集的最高稀释度作为滴度。凝集反应方法简便，敏感性高，临床应用广泛。凝集反应方法简便，敏感性高，临床应用广泛。333 3、凝集反应的分类、凝集反应的分类玻片凝集反应玻片凝集反应试管凝集反应试管凝集反应34（一）直接凝集试验（一）直接凝集试验（Direct agglutinat

20、ion）351 1、玻片凝集试验、玻片凝集试验362 2、试管凝集试验、试管凝集试验37（二）间接凝集试验（二）间接凝集试验 indirect agglutination38已知抗原检测抗体已知抗原检测抗体已知抗体检测抗原已知抗体检测抗原正向正向反向反向391 1、正向间接凝集反应、正向间接凝集反应402 2、反向间接凝集反应、反向间接凝集反应413 3、间接凝集抑制反应、间接凝集抑制反应424、协同凝集反应（、协同凝集反应（coaggoltination）43可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗

21、原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。二、免疫沉淀反应二、免疫沉淀反应44 液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳絮状沉淀絮状沉淀环状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂

22、扩散试验单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳血清免疫电泳血清免疫电泳血清免疫电泳火箭电泳火箭电泳火箭电泳火箭电泳对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳免疫印迹等免疫印迹等免疫印迹等免疫印迹等451、絮状沉淀试验、絮状沉淀试验操作步骤：操作步骤：（1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。各管加入一定浓度的适量抗血清。（3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。孵育。（4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管产生沉淀量随抗原量而

23、不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。多用以测定抗原抗体反应的最适比。 （一）液相沉淀反应（一）液相沉淀反应（一）液相沉淀反应（一）液相沉淀反应462、环状沉淀试验、环状沉淀试验操作步骤：操作步骤：（1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避）底部，避免产生气泡。免产生气泡。（2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。交界面。（

24、3） 置沉淀管于室温下使其反应，置沉淀管于室温下使其反应，15min内在两界面间呈现内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。仍无沉淀环出现则为阴性。应用：应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的（诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。实验、细菌分型、血迹鉴定）。 473、 凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部散形成浓度梯度，抗原与抗体在

25、比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。凝胶等。最常用的方法为：最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验48（1）单向琼脂扩散试验）单向琼脂扩散试验原理原理：12%的琼脂凝胶形成网状构架的琼脂凝胶形成网状构架，空隙中，空隙中是是98-99%的电解质溶液。的电解质溶液。凝胶网孔较大，允许分子量在凝胶网孔较大，允许分子量在20万以下甚至更大些万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原

26、和抗体的分子量在分子量在20万以下，因此万以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩可以在琼脂凝胶中自由扩散散，所受阻力甚小。，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。，故形成沉淀带。 49 单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图50（2）双向免疫扩散试验）双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。小孔，在相邻的两孔内分

27、别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。51523、免疫电泳技术、免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：两大优点：一是加快了沉淀反应的速度一是加快了沉淀反应的速度 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的而将其分开，

28、再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。分析。免疫电泳包括免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等电泳、免疫印迹等 53（1）血清免疫电泳）血清免疫电泳 将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。增加。5455（2）火箭免疫电泳）火箭免疫电泳火箭免

29、疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。量技术，实质上是加速度的单向扩散。56是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。结合的杂交技术。 经过经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质

30、离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的蛋白成分。测电泳分离的蛋白成分。广泛应用于检测蛋白表达。广泛应用于检测蛋白表达。 （3）免疫印迹）免疫印迹western blot57kDa M 1 2 3 4 5 6907560402558免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗素等标记物标记抗原或抗

31、体所进行的抗原抗体反应。体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。四、免疫标记技术四、免疫标记技术59常见标记免疫技术常见标记免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术化学发光免疫技术化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术免疫印迹技术免疫印迹技术蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 60 该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体该法是用放射性核素作为标记物标记抗

32、原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高具有高度的灵敏度度的灵敏度（pg）和和自动化检测自动化检测等特点，因此在实等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子等小分子化合物的定量分析。化合物的定量分析。1. 放射免疫技术放射免疫技术61放射免疫分析基本原理放射免疫分析基本原理竞争性结合反应的经竞争性结合反应的经典标记抗原（典标记抗原（Ag*Ag

33、*）和）和非标记抗原（非标记抗原（AgAg）与限）与限量抗体量抗体( (AbAb) )竞争性结合竞争性结合Ag*Ag*和和AgAg具有等同的具有等同的与与AbAb结合能力结合能力62 Ag* Ab Ag 标记抗原标记抗原 特异性抗体特异性抗体 待测抗原待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合抗原抗体复合物物分离分离Ag*-Ab 和游离和游离Ag*从标准曲线上读知含量从标准曲线上读知含量 测定测定Ag*-Ab和游离和游离Ag*放射性放射性 放放射射免免疫疫测测定定法法(RIA)示示意意图图63将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记

34、抗体，制成荧光抗体诊断试剂。制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2.2.免疫荧光技术免疫荧光技术64免疫荧光技术免疫荧光技术直接法直接法Ag荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体特异性抗体组织切片或细胞组织切片或细胞65免疫荧光技术免疫荧光技术间接法间接法Ag荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体组织切片或细胞组织切片或细胞待测抗体待测抗体66免免 疫疫 荧荧 光光 染染 色色 显显 示示 细细 胞胞 骨

35、骨 架架 免疫荧光染色是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经免疫荧光染色是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经荧荧光染料标记的抗体光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。质进行细胞或组织内的精确定位。常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种：常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种：显示绿色荧光：显示绿色荧光：FluoresceinFluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-48

36、8 isothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：显示红色荧光：RhodamineRhodamine B B（罗丹明）（罗丹明）, , Texas Red, Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：显示蓝色荧光：Alexa350 用用Alexa488标记的抗人标记的抗人-tubulin抗体抗体染色显示微管染色显示微管(绿色绿色); 细胞核细胞核: 红色红色, DAPI染色染色人皮肤角化细胞人皮肤角化细胞免疫荧光染色免疫荧光染色673、免疫酶技术、免疫酶技术 灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。水平。 应用范

37、围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位。定性又能定量、定位。 不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条件，免疫荧光法需要荧光显微镜。件，免疫荧光法需要荧光显微镜。酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。以上。68 活性高，分解底物的能力强。活性高，分解底物的能力强。 特异性强，即作用于底物的专一性强。特异性强，即作用于底物的专一性强。 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。 与底物作用可以显色。与底物作用可以显色。 纯

38、度高、易纯化。纯度高、易纯化。 可溶性可溶性( (水溶性水溶性) )好，在溶液中稳定。好，在溶液中稳定。 测定方法简单。测定方法简单。 来源广、价格低。来源广、价格低。标记酶的选择条件：标记酶的选择条件： 69以以HRPHRP最为常用，最为常用，具有活力高、稳定、分子量小、易提具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。纯等优点。致癌致癌分子量分子量40kD821867071 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay简称：简称：ELISA1971年年Engvall和和Perlmann发表发表是一类在是一类在固相载体固相载体上进行免疫酶染色

39、的免疫酶标记技术上进行免疫酶染色的免疫酶标记技术721）基本原理与类型）基本原理与类型 一种固相免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相一种固相免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体标抗原或抗体按不同步骤按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物

40、，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。值的大小进行定性或定量分析的方法。73 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有法中有三个必要的试剂：三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为酶标记的抗原或抗体，称为结合物结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方

41、法。 74 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 检测抗原最常用的方法检测抗原最常用的方法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被就可用于包被固相载体固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色75 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不

42、需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中抗检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。Ag酶标抗原待检抗体待检抗体固相载体76 间接法测抗体间接法测抗体 检测抗体最常用的方法检测抗体最常用的方法间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标同一酶标二抗二抗建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。酶标抗体血清样品底物终止液77竞争法可用于抗原和半抗原的定量测定

43、，竞争法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。也可用于测定抗体。竞争法竞争法78用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定孔加待测抗原和测定孔加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照孔只加一定量酶标抗原对照孔只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量79 捕获包被法测捕

44、获包被法测IgM抗体抗体IgM的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。血清样品或参比品 酶标抗体特异性抗原 底物 终止液抗人抗人IgM抗体连抗体连接在固相载体形接在固相载体形成固相抗人成固相抗人IgM加底物显色：如有颜色显示，加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在（阳性反应）抗体存在（阳性反应）80 ABS-ELISA法法（亲和素亲和素-生物素系统生物素系统-酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验） ：固相支持物；固相支持物； ：样品；：样品； ：特异性：特异性IgG；：生物素

45、化抗小鼠生物素化抗小鼠IgG 抗体（抗体（Biotin）；）；：HRP酶标链亲和素（酶标链亲和素（Avidin）；）；：DAB显色液；显色液；：显色；：显色；ABS：亲和素亲和素(avidin)生物素生物素(biotin)系统系统(system）812）ELISA的一般操作方法的一般操作方法8283848586共同特点：共同特点：象搭积木一样在固相载体上一层一层叠加象搭积木一样在固相载体上一层一层叠加8788899091第三节第三节 细胞免疫技术细胞免疫技术一、细胞分离原理一、细胞分离原理1 1、基于细胞的物理特性、基于细胞的物理特性 1 1）细胞比重差异）细胞比重差异 2 2）细胞的粘附性）

46、细胞的粘附性 3 3）细胞对渗透压改变的敏感性）细胞对渗透压改变的敏感性2 2、基于细胞表面的特异性标志物、基于细胞表面的特异性标志物 1 1）免疫磁珠分离法）免疫磁珠分离法 2 2）流式细胞术）流式细胞术923 3、血液细胞的组成及比重、血液细胞的组成及比重外周血红细胞红细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090(PBMC)1.09293 原理：原理：外周血各种外周血各种血细胞的比重不同血细胞的比重不同，利用淋巴，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将

47、各种血细胞加以群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。分离。 常用的分层液有常用的分层液有FicollFicoll和和PercollPercoll两种。两种。一）单个核细胞分离一）单个核细胞分离-密度梯度离心法密度梯度离心法二、细胞分离方法二、细胞分离方法94FicollFicoll：1.0771.0770.0010.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.035单个核细胞单个核细胞1.0751.090粒细胞粒细胞1.092红细胞红细胞

48、1.093细胞比重细胞比重分层液比重分层液比重95离心后离心后PBMC红细胞粒细胞Ficoll/60% Percoll稀释外周血稀释的血浆、的血浆、血小板血小板Ficoll/60% Percoll961 1、粘附去除法、粘附去除法原理：原理：单核细胞和粒细胞在单核细胞和粒细胞在3737和和CaCa离子存在条件离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：方法：1 1）玻璃器皿吸附法）玻璃器皿吸附法 2 2） 玻璃纤维柱法玻璃纤维柱法二）淋巴细胞分离二）

49、淋巴细胞分离972 2、改变细胞密度法、改变细胞密度法原理：原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。基铁粉后的单核细胞密度增大。方法：磁铁吸引法和羟基铁方法：磁铁吸引法和羟基铁- -乳胶分层液法乳胶分层液法98三）三）T、B、NK细胞的分离细胞的分离T细胞细胞：E花环分离花环分离T细胞细胞B细胞：尼龙纤维分离细胞：尼龙纤维分离B细胞（对尼龙纤维特有的吸附细胞（对尼龙纤维特有的吸附能力）能力）免疫磁珠分离法与流式细胞术（淋巴细胞表面的标志免疫磁珠分离法与流式细胞术（淋巴细胞表面的标志差异）差异）99流式细胞术流式细胞术概念概念

50、:流式细胞仪流式细胞仪 (flow cytometer, FCM)：是集是集光电子物理光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的为一体的高科技细胞分析仪。高科技细胞分析仪。流式细胞术流式细胞术 (flow cytometry)：利用流式细胞仪对处于利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。析和分选的技术。又称荧光激活细胞分选仪分离法（又称荧光激活细胞分选仪分离法（FACS）100机型机型1. 分析型流式细胞仪：分析型流式细胞仪： 检测标记细胞的百分

51、比含量。检测标记细胞的百分比含量。 同时检测四色不同染色的细胞。同时检测四色不同染色的细胞。2. 分选型流式细胞仪：分选型流式细胞仪： 无菌获取阳性细胞，以进一步培养。无菌获取阳性细胞，以进一步培养。 同时获取四色不同染色的细胞。同时获取四色不同染色的细胞。流式细胞术可以同时鉴别单个细胞上的多种抗原，流式细胞术可以同时鉴别单个细胞上的多种抗原，而且可以在极短时间内分析大量细胞。而且可以在极短时间内分析大量细胞。101流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理光学系统光学系统 激光光源激光光源 光收集系统光收集系统液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统电子系统电子系统 光电转换光

52、电转换 数据处理系统数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统102操作方法1. 将分离的单个核细胞，用将分离的单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成培养基配成1107 /ml；2. 加适量荧光单抗（加适量荧光单抗（NK细胞特异性的抗原为细胞特异性的抗原为CD16、CD56；T细胞细胞CD3），），4孵育孵育30min，用，用RPMI-1640培养基洗培养基洗2次；次；3. 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。的细胞进行分选。103特点特点1、各种组

53、织细胞各种组织细胞均可用于分析，如血液、骨髓、体均可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成单细胞悬液均能分析。单细胞悬液均能分析。2、测量速度快测量速度快，每分钟能测量数千至数万个细胞。，每分钟能测量数千至数万个细胞。3、可进行、可进行多参数多参数的分析，可同时检测的分析，可同时检测四种不同荧光四种不同荧光染色染色的细胞。新一代的流式可同时检测十多色的细的细胞。新一代的流式可同时检测十多色的细胞。胞。4、可将目的细胞、可将目的细胞无菌分选出来无菌分选出来做进一步的培养。做进一步的培养。104三、淋巴细胞的功能检测三、淋

54、巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。细胞分泌产物的测定。 105(一一) T细胞功能的检测细胞功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验体内

55、试验体内试验1061 1、T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1 1）原理：）原理：T T淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母母细胞细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核核染色质疏松染色质疏松1072 2）淋巴细胞转化的刺激物）淋巴细胞转化的刺激物非非特异性刺激物：特异性刺激物： PHA -T细胞细胞 ConA -T细胞细胞 PWM -T、 B细胞细胞 LPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原1083 3）检测方法）检测方法 形形态态法法：刺刺激激物物 淋淋巴巴细细胞胞（4-64-6天天）

56、母母细细胞胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞淋巴细胞 DNADNA合成期合成期 + + 3 3H-TdRH-TdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3 3H HTdRTdR109形态学检查法形态学检查法110原理：原理：活细胞内活细胞内线粒体脱氢酶线粒体脱氢酶能将噻唑盐（能将噻唑盐（MTT）由黄色转变为蓝紫色的甲臜，甲臜的形成量与细由黄色转变为蓝紫色的甲臜，甲臜的形成量与细胞增殖程度有关，与活细胞数成正比。甲臜溶于胞增殖程度有关，与活细胞数成正比。甲臜溶于有机溶剂（有机溶剂（DMSO、乙醇等）后，可在乙醇等）后，可在560nm波波长下用酶标

57、仪检测。长下用酶标仪检测。MTT法法简简单单快快速速、准准确确，广广泛泛应应用用于于疫疫苗苗免免疫疫效效果果测测定定、新新药药筛筛选选、细细胞胞毒毒性性试试验验、肿肿瘤瘤放放射射敏敏感性实验等。感性实验等。MTTMTT法法111培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度112实验步骤实验步骤）小鼠处死取脾脏或大动物采全血）小鼠处死取脾脏或大动物采全血）分离淋巴细胞制细胞悬液）分离淋巴细胞制细胞悬液 3）细胞计数，稀释分装）细胞计数，稀释分装 4） 细胞培养及抗原（或丝裂原）刺激细胞培养及抗原（或丝裂原）刺激 5）MTT掺入掺入 6） 结果测定结果测定113114

58、2 2、T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后细胞经各种丝裂原或抗原刺激后, ,分泌各种分泌各种CK,CK,可借助免疫学、细胞生物学及分子可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测生物学技术分别检测CKCK含量、生物学活性或基含量、生物学活性或基因表达水平，以反映因表达水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。 1153 3、T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验1 1）原理：）原理：靶靶细胞抗原细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶靶细胞细胞116形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤细

59、胞肿瘤细胞 计数计数残留肿瘤细胞残留肿瘤细胞2 2）方法）方法意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 117（二）（二）B细胞功能检测细胞功能检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验1181 1、B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验细菌脂多糖细菌脂多糖SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法MTTMTT法法1192 2、 溶血空斑试验溶血空斑试验原理：原理： 是检测空斑形成细胞即是检测空斑形成细胞即B淋巴细胞分泌

60、抗体功能的淋巴细胞分泌抗体功能的一种体外实验方法，可检测机体体液免疫功能状况。一种体外实验方法，可检测机体体液免疫功能状况。用绵羊红细胞免疫小鼠，取小鼠脾脏制成细胞悬液，用绵羊红细胞免疫小鼠，取小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的与一定量的SRBC混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每一个有活性的一个有活性的B细胞所产生的溶血素可致敏周围的细胞所产生的溶血素可致敏周围的SRBC，在补体的参与下，在补体的参与下，SRBC溶解，形成肉眼可溶解，形成肉眼可见的溶血斑，空斑的数目代表抗体生成细胞的多少，见的溶血斑，空斑的数目代表抗体生成细胞的多少，空斑的大小代表抗体生成细胞产生抗体的

61、能力。空斑的大小代表抗体生成细胞产生抗体的能力。120121溶血空斑试验主要用于测定药物或手术溶血空斑试验主要用于测定药物或手术等因素对体液免疫功能的影响等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。体的能力。 1223 3、B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 斑点斑点ELISAELISA原理：原理：即将抗原或抗体首先吸附在即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜纤维素薄膜(如硝酸如硝酸纤维素膜，纤维素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通过表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反与相应的抗体或抗原

62、和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物上的酶催化底物成另一种带色物质，下，结合物上的酶催化底物成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。可见的颜色斑点。 123胞胞 核核 125I释放法释放法 荧光染料释放法荧光染料释放法NK细胞细胞+靶细胞靶细胞靶细胞溶解、破裂释放靶细胞溶解、破裂释放胞浆内酶类胞浆内酶类 LDH释放法释放法胞浆内蛋白胞浆内蛋白51Cr释放法释放法酶释法酶释法同位素法、荧光法同位素法、荧光法同位素法同位素法K562细胞株（三）（三）NK细胞活性测定细胞活性测定124习习 题题1、凝集反应、沉淀反应、流式细胞术、凝集反应、沉淀反应、流式细胞术2、简述抗原抗体反应的特点及影响因素。、简述抗原抗体反应的特点及影响因素。3、试述、试述ELISA的原理及一般步骤。的原理及一般步骤。4 4、溶血空斑实验溶血空斑实验的原理及基本步骤。的原理及基本步骤。5 5、流式细胞术、流式细胞术概念及工作原理。概念及工作原理。6、三个实验凝集反应、双向琼脂扩散实验、淋巴细、三个实验凝集反应、双向琼脂扩散实验、淋巴细胞分离技术的原理与步骤。胞分离技术的原理与步骤。125