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1、目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。目的基因的获取最新课件需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构研究某基因结构和功能的关系和功能的关系研究某基因与研究某基因与疾病的关系疾病的关系目的基因的获取最新课件目的基因的获取目的基因的获取化学合成法化学合成法基因组基因组DNADNA文库文库;cDNA;cDNA文文库库聚合酶链式反应聚合酶链式反应直接从染色体直接从染色体DNA中分离中分离目的基因的获取最新课件第一节第一节 基因组基因组DNA片段化片段化一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因
2、组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切目的基因的获取最新课件由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。1. 优点优点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene目的基因的获取最新课件二、随机片断化二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机
3、切开。切开。 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则）限制性内切酶的选用原则目的基因的获取最新课件1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）目的基因的获取最新课件2. 机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声
4、波强烈作用于DNA，可使其断裂成约，可使其断裂成约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断。的随机片断。（3）DNA溶液小孔喷射溶液小孔喷射注射器法可将注射器法可将100kb以上的以上的DNA剪切成剪切成10 kb左右左右的片段。的片段。目的基因的获取最新课件1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA基因的论文。基因的论文。第二
5、节第二节 化学合成目的基因化学合成目的基因要求：要求：1、已知目的基因的核苷酸序列、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列或其产物的氨基酸序列 。2、分子量较小的目的基因的制备分子量较小的目的基因的制备 目的基因的获取最新课件由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因目的基因的获取最新课件一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法。自动化合成法。磷酸三酯法、磷酸三酯法、目的基因的获取最新课件 保护保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH
6、用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护（1）原理）原理1. 磷酸二酯法磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。保证合成反应的定向进行。带带5保护的单核苷酸与带保护的单核苷酸与带3保护的另一保护的另一个单核苷酸以个单核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来。连接起来。目的基因的获取最新课件（2）合成过程）合成过程下一个下一个5端保护的单核苷酸又可以同端保护的单核苷酸又可以同3端保护的端保护的二核苷酸聚合。二核苷酸聚合。目的基因的获取最新课件原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3-末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（与一个不
7、溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连）连接，然后依次从接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。具体的合成和延伸过程如图。2.亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法 目的基因的获取最新课件目的基因的获取最新课件化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。二、二、 化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装 用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸。上磷酸。1. 互补连接法互补连接法 预先设计合成的片断之间都有
8、预先设计合成的片断之间都有互补区互补区域域，不同片断之间的互补区域能形成有，不同片断之间的互补区域能形成有断断点点的完整双链。的完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的55端是端是-OH-OH）目的基因的获取最新课件T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链目的基因的获取最新课件2. 互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片断延长的引物，用相互作为另
9、一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链。延伸成完整的双链。355353T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物目的基因的获取最新课件1. 直接合成基因直接合成基因三、三、 寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低目的基因的获取最新课件DNA合成仪合成仪5. 合成人工
10、接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔接物衔接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor目的基因的获取最新课件第三节第三节 PCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在累述。目的基因的获取最新课件PCR 可以把可以把 指定的基因片段指定的基因片段 数数量放大量放大染色体PCR 基因放大基因放大连琐连琐反反应应聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)(polymerase chain reaction, PCR)
11、目的基因的获取最新课件第四节第四节 从基因文库、从基因文库、cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因目的基因的获取最新课件一、基因文库的构建一、基因文库的构建1. 基因文库（基因文库（gene library） 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片断，并将成大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保保存和扩增存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的了该生物体的全部基因全部基因，因此，称之为基因，因此，称之为基因组文库（组文库（g
12、enomic library）或基因文库（）或基因文库（gene library）。）。目的基因的获取最新课件组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内由克存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基隆载体所携带的所有基因组因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目的基因的获取最新课件（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2. 构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容
13、载的DNA片断大小直接影响到构片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目片断数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 24 kpcosmid载体：载体： 容量为容量为 50 kb YAC： 容量为容量为 1 MbBAC: 容量为容量为 300 kb目的基因的获取最新课件断点完全随机，片断长度合适于载体连接。断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。不能用一般的限制性内切酶消
14、化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3. 基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。 酶切法：酶切法：目的基因的获取最新课件（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法人工接头法（adapter）同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不
15、同限制酶切位点连接 平端连接平端连接同聚物加尾连接同聚物加尾连接目的基因的获取最新课件Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接目的基因的获取最新课件不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶
16、连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目的基因的获取最新课件目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目的基因的获取最新课件5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移
17、酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目的基因的获取最新课件人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目的基因的获取最新课件目的基因的获取最新课件4. 基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目。时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基
18、因组片断的平均长度占整个基因组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数：所需的重组载体数（克隆数）例如：从人基因组例如：从人基因组DNA（总长度为（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？，那么这个基因组文库要多大？ ln（10.99） N = = 9.2106 ln （11.51033109）目的基因的获取最新课件若用质粒（若用质粒（若用质粒（若用质粒（pBR322pBR322）克隆目的基因（）克隆目的基因（）克隆目的基因（）克隆目的基因（1.5kb1.5kb）需要有）需要有）需要有）
19、需要有9109106 6克隆才能汇集人基因组全部克隆才能汇集人基因组全部克隆才能汇集人基因组全部克隆才能汇集人基因组全部DNADNA序列序列序列序列; ;若若若若 用用用用 噬菌体载体可噬菌体载体可噬菌体载体可噬菌体载体可构建含构建含构建含构建含15kb15kb目的基因的人基因组目的基因的人基因组目的基因的人基因组目的基因的人基因组DNADNA文库，按上式计算所文库，按上式计算所文库，按上式计算所文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到需要的重组体克隆数可以减少到需要的重组体克隆数可以减少到需要的重组体克隆数可以减少到9109105 5, , 而要用柯斯质粒将而要用柯斯质粒将而要用柯斯质
20、粒将而要用柯斯质粒将40kb40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到目的基因片断所需要重组体克隆数可降到目的基因片断所需要重组体克隆数可降到目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5103.5105 5左右左右左右左右, ,均可满足建库要求。均可满足建库要求。均可满足建库要求。均可满足建库要求。 三种常用基因组文库克隆载体的比较三种常用基因组文库克隆载体的比较载体种类载体种类装载量装载量转转 染染 率率 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 粘性质粒粘性质粒粘性质粒粘性质粒(Cosmid)(Cosmid) 酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)(YAC)9 922kb22k
21、b303045kb45kb1001001000kb1000kb10105 510106 6转化子转化子转化子转化子gDNAgDNA10104 410106 6转化子转化子转化子转化子gDNAgDNA 500500转化子转化子转化子转化子gDNAgDNA目的基因的获取最新课件1.cDNA library二、二、 cDNA文库的构建文库的构建利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。2.cDNA (complementary DNA，互补，互补DNA
22、)是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的内的mRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNA。目的基因的获取最新课件（1）不含内含子序列不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。（4）比）比DNA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4. 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3. cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。目的基因的
23、获取最新课件分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）目的基因的获取最新课件目的基因的获取最新课件反转录酶反转录酶mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成oligo(dT)引导的引导的DNA合成法：合成法：
24、利用真核利用真核mRNA分子所具有的分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶短片段，由反转录酶合成合成cDNA的第一链。的第一链。目的基因的获取最新课件随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应的引物。在应用这种混合引物的情况
25、下，用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从的合成可以从mRNA模板模板的许多位点同时发生，而不仅仅从的许多位点同时发生，而不仅仅从3-末端的末端的oligo(dT)引物一引物一处开始。处开始。目的基因的获取最新课件用用碱碱处理处理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3355反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3355引物引物cDNA第一链第一链35引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱目的基因的获取最新课件 cDNA第二链合成第二链合成剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一般形成一
26、个弯回来的弯回来的双链发卡结构双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA。a.自身引导合成法：自身引导合成法：目的基因的获取最新课件cDNA第一链第一链5cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链53目的基因的获取最新课件去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链53cDNA第一
27、链第一链cDNA第二链第二链5353目的基因的获取最新课件b.置换合成法：置换合成法：原原 理：理： 以第一链合成产物以第一链合成产物cDNAcDNA：mRNAmRNA杂交体作为杂交体作为切口平移的模板，切口平移的模板，RNARNA酶酶H H在杂交体的在杂交体的mRNAmRNA链上链上造成切口和缺口，产生一系列造成切口和缺口，产生一系列RNARNA引物，在大肠杆引物，在大肠杆菌菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 的作用下合成的作用下合成cDNAcDNA的第二链。的第二链。获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失目的基因的获取最新课件优点：优点：a）合成）合成cDNA的效率高的效率高 b）直接利
28、用第一链的反应产物，不需纯化）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用）避免使用S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNA目的基因的获取最新课件c.引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列目的基因的获取最新课件d.引物引物-衔接头法衔接头法目的基因的获取最新课件在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载体连接，即可与载体连接，转入受体菌。转入受体菌。或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加端分别加上几个上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。(4)(4)cDNA与载体连
29、接：与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶(5)(5)(5)(5)双链双链双链双链cDNAcDNAcDNAcDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖目的基因的获取最新课件目的基因的获取最新课件5. cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）: 某一种低丰
30、度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n目的基因的获取最新课件基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库三、基因组DNA文库与cDNA文库的比较目的基因的获取最新课件1 1 基因组基因组DNADNA文库文库的优点的优点相对于相对于相对于相对于cDNAcDNAcDNAcDNA文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点：n ncDNAcDNA克隆只能反映着克隆只能反映着克隆只能反映着克隆只能反映着mRNAmRNA的
31、分子结构，没有包括基因组的的分子结构，没有包括基因组的的分子结构，没有包括基因组的的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，间隔序列，间隔序列，间隔序列，n n cDNAcDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNAmRNA的分布的分布的分布的分布状态，即：高丰度状态，即：高丰度状态，即：高丰度状态，即：高丰度mRNAmRNA的的的的cDNAcDNA克隆，所占比例较高，分离克隆，所占比例较高，分离克隆，所占比例较高，分离克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度基因容易；低丰度基因容易；
32、低丰度基因容易；低丰度mRNAmRNA的的的的cDNAcDNA克隆，所占比例较低，分离克隆，所占比例较低，分离克隆，所占比例较低，分离克隆，所占比例较低，分离基因困难；基因困难；基因困难；基因困难；n n 从从从从cDNAcDNA克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组DNA DNA 中的非转录区段序中的非转录区段序中的非转录区段序中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列
33、的结构与功能。目的基因的获取最新课件2 cDNA文库的主要优点cDNAcDNAcDNAcDNA文库以文库以文库以文库以mRNAmRNAmRNAmRNA为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些RNARNARNARNA病毒等的病毒等的病毒等的病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。基因组结构研究及有关基因的克隆分离。基因组结构研究及有关基因的克隆分离。基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNAcDNAcDNAcDNA文库的筛选比较简单易行。文库的筛选比较简单易行。文库的筛选比较简单易行。文库的筛选比较简单易行。每一个每一个每一个每一个cDNAc
34、DNAcDNAcDNA文库都含有一种文库都含有一种文库都含有一种文库都含有一种mRNAmRNAmRNAmRNA序列，这样在目的基序列，这样在目的基序列，这样在目的基序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。隆将会含有目的基因。隆将会含有
35、目的基因。隆将会含有目的基因。cDNAcDNAcDNAcDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。直接应用于基因工程操作。直接应用于基因工程操作。直接应用于基因工程操作。cDNAcDNAcDNAcDNA克隆还可用于真核细胞克隆还可用于真核细胞克隆还可用于真核细胞克隆还可用于真核细胞mRNAmRNAmRNAmRNA的结构和功能研究。的结构和功能研究。的结构和功能研究。的结构和功能研究。目的基因的获取最新课件3 cDNA克隆的主要的缺点n nc
36、DNAcDNAcDNAcDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNADNADNADNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。n ncDNAcDNAcDNAcDNA文库虽能反映文库虽能反映文库虽能反映文库虽能反映mRNAmRNAmRNAmRNA的分子结构和功能信息，的分子结构和功能信息，的分子结构和功能信息，的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外但
37、不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。大量调控序列的结构与功能方面信息。大量调控序列的结构与功能方面信息。大量调控序列的结构与功能方面信息。n n在在在在cDNAcDNAcDNAcDNA文库中，相应于高丰度文库中，相应于高丰度文库中，相应于高丰度文库中，相应于高丰度mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的cDNAcDNAcDNAcDNA克隆所克隆所克隆所克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于占的比例比较高，分离起来比较容易，
38、而相应于占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度低丰度低丰度低丰度mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的cDNAcDNAcDNAcDNA克隆所占的比例则比较低，因克隆所占的比例则比较低，因克隆所占的比例则比较低，因克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。此分离也就比较困难。此分离也就比较困难。此分离也就比较困难。 目的基因的获取最新课件四、基因文库的筛选与鉴定四、基因文库的筛选与鉴定重组体重组体(recombinant(recombinant，转化子，转化子transformant)transformant)： 就是掺入或导入外源就是掺入或导入外源DNADNA后获得了新遗传后获
39、得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。标志的细菌细胞或其他受体细胞。目的基因的获取最新课件1 1、表型筛选法、表型筛选法（一）基因文库的筛选（一）基因文库的筛选(2)(2)插入失活筛选法插入失活筛选法插入失活筛选法插入失活筛选法(3)(3)显色反应选择法显色反应选择法(-(-互补法互补法) )2 2、PCRPCR筛选法筛选法(1)抗药性筛选抗药性筛选3 3、菌落原位杂交法、菌落原位杂交法4 4、免疫筛选法、免疫筛选法目的基因的获取最新课件（二）基因文库的鉴定（二）基因文库的鉴定1、限制性核酸内切酶分析、限制性核酸内切酶分析 2、Southern Blotting3、DNA序列测定法序列测定法目的基因的获取最新课件
