代谢调节2恢复

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1、 第四节 微生物的代谢调控 但是，在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围。 因此，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。 代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。 对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的；一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控反馈调节反馈抑制克服反馈调节，可从以下两方面着手： 降低末端产物浓度 应用抗反馈突变株反馈阻遏1、降低末端产物浓度1）营养缺陷型的利用 营

2、养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株。 营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。ABCDEEaEbEcEd若要积累C，首先要获得缺失酶c 的营养缺陷型。 酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。 由于这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对酶a和酶b的反馈调节。反馈阻遏反馈抑制Ec缺陷CA、利用营养缺陷型积累直链代谢途径中间代谢产物 但是，完全不能合成产物E的突变体，因为不能利用E去进一步合成必须的细胞物质，所以无法

3、正常生长。为了保证突变体的正常生长，培养时须提供低浓度的、不足以引起反馈调节的物质E。这样高浓度的中间产物C就能积累起来了。例如： 利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。ABCDEFGHIJMNKL末端产物L和N共同对酶a施以反馈;此外， L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2选用缺失酶J1的突变株，则L的合成受阻。L和N共同对酶a的反馈被解除。又由于酶J2还受到N的调节，只有少量的J能转变成N，于是中间产物J大量积累。J1缺陷J B、利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物谷氨酸棒杆菌的IMP合成途径和代谢调节工业上用谷氨酸棒杆菌的腺苷酸缺陷

4、型生产肌苷酸（IMP）即是此例的应用。 在分支途径中，如果减少某一末端产物的浓度，常常可以积累另一末端产物。工业上应用的重要例子是赖氨酸发酵C、利用营养缺陷型积累分支代谢途径末端产物C. glutamicum 的代谢调节与赖氨酸生产赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶有多价反馈作用天冬氨酸除合成赖氨酸外,还作为合成苏氨酸和蛋氨酸的原料选育高丝氨酸缺陷型作为赖氨酸的发酵菌种,该菌种不能合成高丝氨酸,也不能合成苏氨酸和蛋氨酸,在补充适量高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)条件下,菌株能大量产生赖氨酸.内容回顾葡萄糖效应反馈调节能荷营养缺陷型菌株的应用2）渗漏缺陷型的利用渗漏缺陷型- 是一种特殊的营养缺陷型，是遗传

5、性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。 不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节，但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物。14渗漏缺陷型菌株的获得方法： 将大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而小的菌落。渗漏缺陷型渗漏缺陷型3）提高细胞渗透性 细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。 改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。

6、 谷氨酸生产菌的细胞膜磷脂含量高时，细胞的通透性较差，磷脂含量低时，通透性较好。 通常在培养基中添加一些控制因素，以达到影响细胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素来使细胞壁的完整合成受阻。 细胞壁和细胞膜的通透性增大后，产物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在细胞内的积累。2、抗反馈调节突变株的利用 在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。18（1）、抗反馈调节作用突变株的筛选的方法 分离耐反馈抑制或

7、反馈阻遏的最简便的方法是挑选所需化合物的结构类似物。把经诱变的细胞涂在含有这种抗代谢物的平板上，大多数细胞不能生长，从中挑选出耐抗代调物的突变株。未加未加结构类似物结构类似物加加结构类似物结构类似物筛选的机理？19（2）、耐反馈作用的突变株的筛选原理 终产物在正常情况下抑制或阻遏它自己的生物合成酶，但其本身也即被菌体利用。所以这种抑制是可逆的，结构类似物也能抑制或阻遏作用，但不能被菌体利用。在含有结构类的培养基中培养，绝大多数细胞因缺少终产物而死亡，只有那些对结构类似物不敏感的突变株仍能合成终产物和长成菌落。20（3）抗反馈调节菌株的分子机理酶的结构起了变化(指耐反馈抑制的突变株)，改变了酶的

8、合成系统(指耐反馈阻遏的突变株)。21 这种突变型就是一个抗反馈突变型。正常代谢最终产物由于与代谢拮抗物的结构相类似，所以在这一突变型中也不与结构发生改变的变构酶相结合。这样，该突变型细胞中已经有大量最终产物，但仍能继续不断地合成。正常的变构酶正常的变构酶突变的变构酶突变的变构酶a.变构酶结构基因发生突变, 使变构酶调节部位不再能与代谢拮抗物相结合，而其活性中心却不变。22b. 调节基因发生突变使阻遏物不能再与代谢拮抗物结合。调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNA酶蛋白酶蛋白正常的阻遏正常的阻遏蛋白蛋白突变的阻遏突变的阻遏蛋白蛋白 在这一突变型中，由于正常代谢的最终产物不与结

9、构发生改变的阻遏蛋白相结合，所以在细胞中尽管已经有大量最终产物，仍能不断地合成有关的酶。23a. 在直线式代谢途径中的应用ABCDEb. 在分支式代谢途径中的应用ABCDE F 在分支合成途径中使用抗性突变株往往难于达到产量提高之目的。故首先必须选取合适的营养缺陷型，同时又选取具有一定抗性突变的菌株产量才会大幅度提高。(4) 抗反馈调节突变株的应用24谷氨酸谷氨酸N- -乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸N- -乙酰乙酰-谷氨酰磷酸谷氨酰磷酸N- -乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸-半醛半醛N- -乙酰鸟氨酸乙酰鸟氨酸鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨琥珀酸精氨琥珀酸精氨酸精氨酸a.a.精氨酸的生产精氨酸的生产 精氨酸代谢过

10、程属于直线式代谢途径，当精氨酸过量时，精氨酸不但对代谢过程所有的酶产生反馈阻遏作用，而且对代谢过程中的关键酶有反馈抑制作用。要积累像精氨酸这样直线式代谢途径的终产物,主要采用抗精氨酸类似物,如D-D-精氨酸、精精氨酸、精氨酸氧肟酸氨酸氧肟酸盐抗性突变株，以解除精氨酸自身的反馈调节25b.鸟苷酸的生产5-5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸焦磷酸5-5-磷酸核磷酸核糖胺糖胺肌苷酸肌苷酸肌苷酸琥珀肌苷酸琥珀酸酸黄苷酸黄苷酸鸟苷酸鸟苷酸腺苷酸腺苷酸 鸟氨酸的代谢过程属于分支代谢途径，腺苷酸、鸟苷酸对PRPP转胺酶有合作反馈抑制作用。将腺氨酸缺陷型与8-氮鸟嘌呤抗性菌株结合起来，可大量积累鸟苷酸。从营养缺陷型的

11、回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株A geneB gene营养缺陷型DNAA geneB gene真正的回复突变非真正回复突变A geneB gene 发生回复突变后，虽然酶的催化活性恢复了，末端产物仍然能生成，但很可能酶的氨基酸序列发生了变化，变得对反馈不敏感了。这样的回复突变株便能过量地积累末端产物。通过营养缺陷突变，对反馈敏感的酶缺失了。二、克服分解代谢阻遏的调控1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源 可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了15

12、00倍。2、流加碳源或氮源 在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，缓慢流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不至于产生阻遏。三、对诱导调节的控制 在生产上为了提高诱导酶的产量，对诱导调节控制的常用手段有：1、添加诱导物类似物 在诱导物就是酶的底物的情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好的。 因为底物类似物不易被所形成的酶分解，而在细胞中始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成，获得较高浓度的酶。例如: 用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导-半乳糖苷酶的合成2、添加辅酶或辅助因子在有些情况下，必须在培养基中添加辅酶才会产生诱导作用例如：丙酮酸脱羧酶的合成需有硫胺存

13、在3、利用组成型突变株 突变可以除去酶合成时对诱导物的依赖组成酶突变株在没有诱导物存在时，能照常合成诱导酶 在生产中使用组成酶突变株时，可不必在发酵液中添加诱导物，且产生的诱导酶活性也比原菌株强。组成型突变株的筛选方法在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当的底物进行反应显示酶活以识别。的底物进行反应显示酶活以识别。 如甘油培养基平板上培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶，组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻硝基苯半乳糖苷，组成型菌株的菌落由于能水解它而呈

14、现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化。 通常使用酶解后可以有颜色变化的底物，便于迅速检出组成型菌落。36ABCDEFG进出节阻通四、提高代谢产物的基本思想37进促进细胞对碳源营养物质的吸收；通使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；节阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；堵消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；出促进目的产物向胞外空间分泌代谢工程(Metabolic Engineering) 利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。一、代谢工程的基本定义第五

15、节、代谢工程第五节、代谢工程 代谢工程的实质在于对代谢流量及代谢控制进行定量分析，在此基础上利用基因工程技术进行代谢改造，最大限度地提高目的代谢产物的产率。代谢工程是基因工程应用的高级阶段代谢流分析： 是一种专门对代谢途径流量进行测定分析的方法，该方法假定在一定条件下，细胞内的物质与能量处于一个拟稳态，通过测定细胞内、外物质浓度的变化，根据细胞代谢途径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布。代谢流分析揭示了代谢的静态的分布。代谢控制分析： 针对细胞内外环境的不稳定性揭示细胞代谢的动态变化规律。它是以代谢生化反应体系的敏感性分析为基础，研究分析代谢

16、控制的各途径之间的分配规律，是一种以系统的观点对细胞内代谢调控进行定量分析的理论和实验方法。一般以数学模型的形式表征，对细胞代谢的控制机制提出定量的解释。二、代谢工程的基本过程1）靶点设计 最后，根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点。 通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或拟阻断途径的靶点等。至少包括三个基本过程 首先，根据化学动力学和计量学原理定量测定网络中的代谢流分布（即代谢流分析; Metabolic flux analysis, MFA），其中最重要的是细胞内碳和氮元素的流向比例关系。 其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素（即代谢流控制分析；M

17、etabolic flux control analysis, MCA）。2) 基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作。 其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。3）效果分析 一次性的代谢工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求的产量、速率和浓度，因为大部分实验涉及的只是单一代谢途径有关的基因、操纵子或基因簇的改变。 通过对新代谢进行全面的效果分析，这种由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改造目标。三、代谢工程的基本原理代谢工程是多学科

18、高度交叉的新型领域，涉及诸多基本原理：1）涉及细胞物质代谢规律及途径组合的化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱和生化反应机制。2）涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理，这是代谢途径修饰的理论依据。3）涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、别构抑制效应、修饰激活效应等。4）涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理，它们阐明了基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套技术。5）涉及细胞生理状态平衡的细胞生理学原理，是一个代谢速率和生理状态表征研究的理想平台。6）涉及发酵或细胞培育的工艺和工程控制的生化工程和化学工程原理，它为速率过程受

19、限制的系统分析提供了独特的工具和经验。7）涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理，为代谢途径设计提供信息，是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用的最大推动力。四、代谢工程的应用 根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面：改变代谢途径扩展代谢途径构建新的代谢途径1、改变代谢途径 改变分支代谢途径的流向或流量，阻断其他代谢产物的合成，达到提高目标产物的目的。1）加速限速反应 增加代谢途径中限速酶编码基因的拷贝数 强化以启动子为主的关键基因表达系统 提高目标途径激活因子的合成速率 灭活目标途径抑制因子的编码基因可采用下列不同的方法：2）改变分支代谢途径流向 提高代谢分

20、支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的末端产物的产量。例如：芳香族氨基酸合成途径中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三条支路上，任一支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。 从谷氨酸棒杆菌K86中提取质粒pCDtrp157, 该质粒带有DAHP合成酶基因和色氨酸合成酶基因。 如将该质粒转化至谷氨酸棒杆菌JY9182 ，使该菌可产色氨酸1.1g/L。3）构建代谢旁路大肠杆菌工程菌常采用高密度培养，以获得高表达。大肠杆菌（工程菌）在以糖为碳源进行高密度培养中易产生乙酸，乙酸达一定浓度时，抑制细胞的生长。 除通过工艺控制外（如控制糖的流加速度、溶解氧，

21、发酵与超滤偶联等），也可通过代谢工程方法控制乙酸的产生。 例如： 可将运动发酵假单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，使转化子不产生乙酸而产生乙醇。因乙醇对大肠杆菌的毒性远比乙酸小。4）改变能量代谢途径 改变能量代谢途径或电子传递系统，影响或改变细胞的代谢流。2、扩展代谢途径 引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物，或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。如啤酒酵母不能直接将淀粉转化为乙醇；将-淀粉酶基因转入啤酒酵母， 并使用毕氏酵母的抗乙醇阻遏的醇氧化酶基因启动子来表达该基因，则可生料发酵生产乙醇3、转移或构建新的代谢途径 将催化一系列

22、生物反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞中原来无关的两条途径联结起来，形成新的代谢途径，产生新的代谢产物；或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。如 将真养产碱菌的PHB 操纵子 （PHB 多聚酶、硫解酶、还原酶）克隆到大肠杆菌, 重组大肠杆菌就可积累PHB.PHB3-HyddroxybutyratePHB depolymerase(phbD)3-Hydroxybutyrate dehydrogenase(bdhA)AcetoacetateAcetoa

23、cetyl-CoA Synthetase(acsA2)Acetoacetyl-CoAAcetyl-CoA synthetase(acsA1)AcetateAcetyl-CoAKetothiolase(phbA, atoB, fadA)3-hydroxybutyryl-CoAAcetoacetyl-CoA reductase(phbB)PHB synthetase(phbC)PHB cyclePHB cycle phbC phbB phbA -35/-10E. coli重组质粒重组质粒Alcaligenes eutrophusPHB granules in recombinant E.coli 61作业1、谈谈你所认识的微生物代谢调节的现象2、代谢调节的部位有哪些3、酶活性调节的方式有哪些4、什么是共价调节5、变构调节的基础6、变构酶的性质7、图示乳糖操纵子8、葡萄糖效应的机理是什么9、能荷的计算方法10、营养缺陷型在微生物代谢调节的应用11、避开固有的反馈调节方法12、耐反馈作用的突变株的筛选原理