《碱性磷酸酶Km值的测定ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《碱性磷酸酶Km值的测定ppt课件（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、碱性磷酸酶碱性磷酸酶Km值值的测定的测定 【实验目的】1.了解酶的Km值测定原理和方法2掌握碱性磷酸酶AKP活性测定的原理和方法 【实验原理】【实验原理】n n在温度，在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促及酶浓度恒定的条件下，酶促反响的初速度随底物浓度反响的初速度随底物浓度S增大而添加，增大而添加，但当底物浓度增大到一定极限时，那么反但当底物浓度增大到一定极限时，那么反响速度趋于恒定，此最大反响速度响速度趋于恒定，此最大反响速度Vmax，反响速度与底物浓度之间的关系可用米氏反响速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：方程来表示，即： VmaxS V= Km + S 其中Km为米氏常数
2、， Vmax为最大反响速度， 当V=Vmax/2时，那么Km=s。 Km是酶的特征常数，测定Km是研讨酶的一种方法 n n将米氏方程将米氏方程变形形为双倒数方程，以双倒数方程，以l/ v1s作作图，将各点，将各点连线，在横，在横轴截截距距为-km，据此可算出，据此可算出Km值。n n1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax n n本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的
3、深浅可测出酶活力高低。的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反响式如下：其反响式如下：n n 磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚苯酚 n n n n 苯酚苯酚+4-氨基安替比林氨基安替比林K3Fe(CN)6 醌衍生物醌衍生物n n 红红色色管 号1 2 3 4 5 6 7 8底物液底物液(0.04M)碳酸碳酸缓液液(pH=10)蒸蒸馏水水0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
4、混匀后混匀后37水浴，水浴，预温温5分分钟左右左右 【实验操作】酶酶液液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1参与参与酶液后立刻混匀液后立刻混匀坚持持37水浴，水浴，反响开反响开场。从参与从参与酶液起液起计时至下一步至下一步 参与碱性参与碱性溶液停溶液停顿反响，各管反响反响，各管反响时间应准确一准确一致，致，为15分分钟。碱性溶液碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.04-氨基安氨基安 替比林替比林铁氰化化钾 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
5、混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度结结果果果果记录记录 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 ODOD底物底物浓度度 mmol/L 1 3 5 6 8 12 16 0 1/S 1/OD1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 - 【实验结果】1、原始数据、原始数据2、作、作图n n以以 s为横轴，为横轴，OD510为纵横作图，为纵横作图，察看曲线外形；查察看曲线外形；查Km 值值n n 以以1s为横轴，为横轴，1OD510为纵轴为纵轴作图，察看曲线外形；查作图，察看曲线外形；查Km 值值n n比较两个值的差别比较两个值的差别.S1/2VMAXOD510VMAXKm底物浓度与反响速度关系曲线底物浓度与反响速度关系曲线双倒数曲线双倒数曲线 1/s1/OD510-1/Km1/Vmaxn n比较两个值的大小比较两个值的大小,分析实验误差产分析实验误差产生的缘由生的缘由n n 比较两种比较两种Km测定方法各自的优缺陷测定方法各自的优缺陷【实验讨论】
