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1、克隆载体 基因载体是一类能自我复制的基因载体是一类能自我复制的DNADNA分子，其中的一段分子，其中的一段DNADNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源( (目目的的) DNA) DNA而将目的而将目的DNADNA带入宿主细胞。带入宿主细胞。 常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。基因载体应具备的条件：基因载体应具备的条件：（1 1 1 1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种
2、限制性内切酶切点，但每种切口最好只有）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1 1 1 1个；个；个；个；（2 2 2 2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3 3 3 3）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；（4 4 4 4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。多克隆位点多克隆位点ori
3、复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp ppolylinker基因载体基因载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体的功
4、能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较具有较具有较高的外源高的外源高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识
5、别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒(plasmid) Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNA分子。分子。PlasmidchromosomePlasmidchromosome 质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、
6、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的型的型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即即即
7、cccDNAcccDNA质粒质粒质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：1 - 300 1 - 300 kbkb质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应
8、关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 3 1 - 3 拷贝拷贝拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10 - 60 10 -
9、60 拷贝拷贝拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控复制启动控复制启动控制制制制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向复制方向复制方向ro
10、prop（+ +）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控复制启动控复制启动控制制制制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合的结合的结合PcopPcopcopcopP/OrepP/Oreprep
11、reporioriCopCopRepRep质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质
12、粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结
13、构，彼此不相容粒组成粒组成粒组成粒组成不相容性群不相容性群不相容性群不相容性群质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷
14、贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制
15、周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内细胞内细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒
16、能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等质粒等质粒等质粒等如如如如ColCol、RR的其它成员的其它成员的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些
17、非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒在接合型质粒在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由 bom bom 和和和和mob mob 基因决定基因决定基因决定基因决定20060421质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒野生型的质
18、粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素
19、、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒质粒质粒质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往少、遗传标记不理想等缺陷，
20、不能满足克隆载体的要求，因此往少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：建的：建的：建的：pSC101pSC101 8.8 kb 8
21、.8 kb 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 5 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE1 6.5 kb 6.5 kb 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 20 - 30 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1E1RSF2124RSF2124 ColE1 ColE1衍生质粒衍生质粒衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 ApAprr质粒质粒质粒质粒质粒的分类质粒的分类质粒的分类质粒的分类人工构建的质粒根据
22、其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基因表达某些毒性基因表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒温敏
23、质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinkerpolylinker整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒穿梭
24、质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选 第一阶段（第一阶段（19
25、771977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, pSC101, colE1, pCR, pBR313colE1, pCR, pBR313和和pBR322pBR322。 第二阶段：第二阶段：增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立多克隆位点区多克隆位点区和和新的新的遗传标记遗传标记基因。如基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启
26、动子载体，表达型载体及各种探启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。针型载体。 发展概况发展概况 pBR322pBR322pBR322pBR322为为为为4.36kb4.36kb4.36kb4.36kb的的的的环环环环状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，其其其其碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列已已已已经经经经全全全全部部部部清清清清楚楚楚楚。是是是是最最最最早早早早应应应应用用用用于于于于基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的载载载载体体体体之之之之一一一一。把把把把pBR322pBR322pBR322pBR322用用用用限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶切切切切
27、去去去去某某某某片片片片段段段段，换换换换上上上上合合合合用用用用的的的的表表表表达达达达组组组组件件件件，就就就就可可可可以以以以构构构构建建建建成成成成工工工工作作作作所所所所需需需需的的的的新新新新载载载载体。体。体。体。 许许许许多多多多实实实实用用用用的的的的质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体都都都都是是是是在在在在pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的基基基基础础础础上上上上改改改改建建建建而而而而成成成成。可可可可见见见见其原型质粒在使用上有优点。其原型质粒在使用上有优点。其原型质粒在使用上有优点。其原型质粒在使用上有优点。 pBR322pBR322有过百个限制性
28、内切酶切点，一种限制性内切酶只有有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，此外，pBR322DNApBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准分子质量标准。重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR
29、322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆 抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板pUCpUC质粒系列质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polyl
30、inker. 476bp476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基因的基因的 5-5-序列，表序列，表达半乳糖苷酶的达半乳糖苷酶的 片段。片段。 LacZLacZ的上游包括乳糖的上游包括乳糖操纵子上的启动子操纵子上的启动子PlacPlac和操纵基因和操纵基因O O。 lacZlacZ之内是之内是M13M13的多功的多功能连接器。能连接器。三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点： （1 1）分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小，仅为，仅为，仅为，仅为2.7KB2.7KB，容纳外源，容纳外源，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；具有量增大；具有量
31、增大；具有量增大；具有更更更更高的拷贝数高的拷贝数高的拷贝数高的拷贝数（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。 （2 2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可利可利可利可利用用用用 - -互补原理进行互补原理进行互补原理进行互补原理进行蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。 （3 3）多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（MCSMCS）由人工合成的多个单一酶切位点
32、构由人工合成的多个单一酶切位点构由人工合成的多个单一酶切位点构由人工合成的多个单一酶切位点构成。成。成。成。 其其其其MCSMCS区与区与区与区与M13mpM13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上克隆的目上克隆的目上克隆的目上克隆的目的基因直接转移到的基因直接转移到的基因直接转移到的基因直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行载体，进行载体，进行DNADNA测序测序测序测序和和和和体外突变体外突变体外突变体外突变等研等研等研等研究。究。究。究。重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要
33、的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ质粒质粒质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19：正选择标记正选择标记正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色
34、原理的显色原理的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSb bb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段肽段肽段a a ab b b5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基-b bb b-D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷X-galX-galpKOpKO系列系列组成：以组成：以半乳糖激酶（半乳糖激酶（GalkGalk）基因取代基因取代pBR322pBR322的的EcoEcoRI-RI-PvuPvuIIII位点包括位点包括terterr r，. .表达产物催化表达产物催化 Gal +
35、 ATP Gal-1-P+ADPGal + ATP Gal-1-P+ADP以以1414C C标记的半乳糖作底物标记的半乳糖作底物, ,检测生成的检测生成的* *Gal-1-PGal-1-P的放射性。的放射性。 在在GalkGalk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即半乳糖激酶活性，即1414C-Gal-l-PC-Gal-l-P的放射性，可的放射性，可定量估算定量估算启动子功能的强弱启动子功能的强弱。 如在如在GalkGalk基因前插入目的基因，与无插入的空载基因前插入目的基因，与无插入的空载pKOpKO比较，并无放射活性的增强，则说明插
36、入片段不存在有比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。启动子。 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：注意：注意：T7T7和和和和
37、SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNA聚合聚合聚合聚合2743 bp2743 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrpGEM-3EpGEM-3EP PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等等等 乳糖操纵
38、子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（蓝白斑试验（IPTG-Xgal IPTG-Xgal 试验试验）诱导物诱导物 Z Y XZ Y X P PO O Z Y XZ Y X P PO O乳糖标志补救（标志补救（标志补救（标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段lacZX-galLac ZLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal（LacZLacZ基因基因
39、N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C C端序列端序列LacZLacZ酶酶基因克隆时的定向插入基因克隆时的定向插入 插入序列两边的酶切口不同插入序列两边的酶切口不同, ,插入的组件不会倒装，插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿保证了在其下游目的基因插入后，沿5353方向正确方向正确转录，这种构建方式称为定向插入转录，这种构建方式称为定向插入。EcoRIHindIIIOriOri复制起点复制起点LacZAPRpUC19质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化实验室一般使用
40、下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNADNA： 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法碱溶法碱溶法碱溶法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 质粒质粒质粒质粒DNAD
41、NA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加CsClCsCl和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭超速离心过夜超速离
42、心过夜超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNAproteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化碱溶法：碱溶法：碱溶法：碱溶法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加
43、NaOHNaOH和和和和SDSSDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体色体色体DNADNA及大部分蛋白质及大部分蛋白质及大部分蛋白质及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- - - -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉
44、淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNADNA用无用无用无用无DNaseDNase的的的的RNaseRNase去除残余的去除残余的去除残余的去除残余的RNARNA cccDNAcccDNAL-DNAL-DNAocDNAocDNAD-DNAD-DNAT-DNAT-DNA质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA和和和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌
45、体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴4040秒钟秒钟秒钟秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效
46、率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能被开发成为基因工能被开发成
47、为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体是是是是比比比比细细细细菌菌菌菌还还还还小小小小得得得得多多多多的的的的微微微微生生生生物物物物，
48、和和和和病病病病毒毒毒毒侵侵侵侵犯犯犯犯真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞一一一一样样样样，噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体侵侵侵侵犯犯犯犯细细细细菌菌菌菌，也也也也可可可可以以以以认认认认为为为为它它它它是是是是细细细细菌菌菌菌里里里里的的的的“寄寄寄寄生生生生虫虫虫虫”。它它它它本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白，核核核核心心心心是是是是一一一一段段段段DNADNADNADNA，结结结结构构构构上上上上有有有有一一一一个个个个蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质外外外外壳壳壳壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的和尾
49、巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNADNADNADNA注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构生物结构生物结构 噬菌体是噬菌体是噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和 -DNA-DNA组组组组成成成
50、成 -DNA-DNA全长全长全长全长4850248502个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸 -DNA-DNA上上上上至少有至少有至少有至少有6161个基因个基因个基因个基因 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 生物结构生物结构生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5 COSCOSCOSCOScoscos头部合成基因头部合成基因头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚
51、期控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制合成控制合成控制合成控制基因基因基因基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因删除与整合基因删除与整合基因l l - DNA- DNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期感染周期感染周期E.coliE.coli吸附吸附
52、吸附吸附LamBLamB受体受体受体受体注入注入注入注入复制复制复制复制包装包装包装包装裂解裂解裂解裂解噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期感染周期感染周期体内包装体内包装体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原包装范围为原包装范围为原DNADNA的的的的75 - 105%75 - 105%即即即即 36 - 51 36 - 51 kbkbDD
53、AA包装范围为原包装范围为原包装范围为原包装范围为原DNADNA的的的的75 - 105%75 - 105%即即即即 36 - 51 36 - 51 kbkb噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 溶原状态溶原状态溶原状态溶原状态 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体感感感感染染染染大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌后后后后，除除除除能能能能裂裂裂裂解解解解细细细细胞胞胞胞外外外外，也也也也可可可可能能能能将将将将其其其其DNADNA直
54、直直直接接接接整整整整合合合合到到到到宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的染染染染色色色色体体体体DNADNA上上上上，并并并并不不不不产产产产生生生生子子子子代代代代噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体颗颗颗颗粒粒粒粒，这这这这种种种种情情情情况况况况为为为为溶溶溶溶原原原原状状状状态态态态。整整整整合合合合主主主主要要要要由由由由 -DNA-DNA上上上上的的的的cIcI和和和和intint两两两两基基基基因因因因的的的的产产产产物物物物所所所所激激激激活活活活，而而而而这这这这两两两两个个个个基基基基因因因因的的的的开开开开放放放放与与与与关关关关闭闭闭闭又又又又取取取取决决决决于于于于宿宿宿宿
55、主主主主细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身的的的的性性性性质质质质。人人人人们们们们可可可可以以以以根根根根据据据据需需需需要要要要改改改改变变变变 -DNA-DNA或或或或宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的性质，使噬菌体或处于的性质，使噬菌体或处于的性质，使噬菌体或处于的性质，使噬菌体或处于溶原状态溶原状态溶原状态溶原状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要 噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态 噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链
56、DNADNA病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的12nt12nt，感染细菌后粘端互补，感染细菌后粘端互补，感染细菌后粘端互补，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长成双链环状。全长成双链环状。全长成双链环状。全长48531bp48531bp，含，含，含，含5050多个基因。多个基因。多个基因。多个基因。噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分n左臂：从左臂：从A到到J长约长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质
57、。n中段：长约中段：长约20kb，是，是DNA整合和切出，溶原生长所需的整合和切出，溶原生长所需的序列。序列。n右臂：长约右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右复制起始均在这区域内。左右臂包含臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区： 结构区结构区结构区结
58、构区A A A A J19J19J19J19个基因，个基因，个基因，个基因，编码头、编码头、编码头、编码头、 尾部蛋白质为尾部蛋白质为尾部蛋白质为尾部蛋白质为结构区结构区结构区结构区, , , ,重组区重组区重组区重组区 attattattatt（attachmentattachmentattachmentattachment）、）、）、）、intintintint（intagrateintagrateintagrateintagrate）及）及）及）及xisxisxisxis（excissionexcissionexcissionexcission），），），），调控区调控区调控区调控区启动
59、子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和N N N N、CICICICI基因，基因，基因，基因， O-R O-R O-R O-R 为为为为裂解区裂解区裂解区裂解区. . . . 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度缩短长度缩短长度 野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA包包包包装装装装的的的的上上上上限限限限为为为为5151kbkb，本本本本身身身身长长长长度度度度为为为为48.548.5
60、kbkb，只只只只有有有有当当当当插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNA片片片片段段段段不不不不大大大大于于于于2.52.5kbkb时时时时，才才才才能能能能被被被被包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体颗颗颗颗粒粒粒粒。因因因因此此此此缩缩缩缩短短短短野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA的的的的长长长长度度度度，可可可可以以以以提提提提高高高高装装装装载载载载量量量量。其其其其实实实实野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA上上上上约约约约有有有有40-50%40-50%的的的的片片片片段段段段是是是是复复复复制制制制和
61、和和和裂裂裂裂解解解解所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将 -DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体取代型载体取代型载体噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用 噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长。例如用置换法可去掉长。例如用置换法可去掉长。例如用置换法可去掉长达达达达20kb20kb20kb20kb的的
62、的的DNADNADNADNA，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。 基因文库构建基因文库构建基因文库构建基因文库构建常使用常使用常使用常使用 载体；载体；载体；载体； 不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用 组件组件组件组件进行构建。进行构建。进行构建。进行构建。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度缩短长度缩短长度
63、 插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入位点插入位点插入位点插入位点体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段插入片段插入片段载体长度载体长度载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 3751 37）噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度缩短长度缩短长度 取代型载体（置换型载体
64、）取代型载体（置换型载体）取代型载体（置换型载体）取代型载体（置换型载体）体外包装体外包装体外包装体外包装体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26）n允许外源允许外源DNA片段替换非必须片段替换非必须DNA片段的载体，称为片段的载体，称为置换型载体（置换型载体（replacementvectors）。一
65、般情况下，置）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是换型载体克隆外源片段的大小范围是9-23kb，故而该载，故而该载体主要用来构建基因组文库。体主要用来构建基因组文库。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型的野生型的野生型的 -DNA-DNA链上有链上有链上有链上有5 5个个个个EcoRIEcoRI位点和位点和位点和位点和7 7个个个个
66、HindIIIHindIII位点，位点，位点，位点，不不不不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 21 - 2个个个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点些单一的酶切位点些单一的酶切位点些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除
67、或增添酶除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点位点位点位点噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型 -DNA-DNA上缺少合适的选择标记，因上缺少合适的选择标记，因上缺少合适的选择标记，因上缺少合适的选择标记，因此此此此加装加装加装加装选择标记是选择标记是选择标记是选择标记是 -DNA-DNA克隆
68、载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容 -DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记颜色反应类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加
69、装选择标记 imm434imm434imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止基因编码一种阻止基因编码一种阻止 - -噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的基因的基因的基因的 - -载体进入受体细胞后，建立溶载体进入受体细胞后，建立溶载体进入受体细胞后，建立溶载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源当外源当外源当外源DNADNA
70、插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭活，活，活，活， - -重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑透明斑透明斑透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZ基因编码基因编码基因编码基因编码b b b b- -半乳糖
71、苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的无色的无色的X-galX-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基因插入到因插入到因插入到因插入到lacZlacZ基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体 -DNA-DNA则产则产则产则产生蓝色透明斑生蓝色透明斑生蓝色透明斑生蓝色透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的
72、大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体 琥琥琥琥珀珀珀珀型型型型突突突突变变变变（supsup) ) ) )是是是是指指指指由由由由CAGCAG（GlnGln）向向向向UAGUAG（stopstop）的的的的突突突突变变变变。大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌的的的的某某某某些些些些菌菌菌菌株株株株含含含含有有有有特特特特异异异异性性性性的的的的校校校校正正正正基基基基因因因因，其其其其编编编编码码码码产产产产物物物物校校校
73、校正正正正tRNAtRNA能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。将将将将野野野野生生生生型型型型 -DNA-DNA上上上上DD和和和和E E两两两两个个个个头头头头部部部部包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的基基基基因因因因中中中中的的的的CAGCAG密密密密码码码码子子子子突突突突变变变变成成成成UAGUAG。当当当当这这这这种种种种 -DNA-DNA进进进进入入入入一一一一般般般般的的的的大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌菌菌菌菌株株株株后后后后，不不不不能能能能合合合合成成成成有有有有活活活活性性性性的的的的头头头头部部部部蛋蛋
74、蛋蛋白白白白，也也也也就就就就不不不不能能能能被被被被包包包包装装装装和和和和裂裂裂裂解解解解细细细细菌菌菌菌，这这这这样样样样就就就就可可可可以以以以阻阻阻阻止止止止有有有有害害害害重重重重组组组组体体体体的的的的生生生生物物物物污污污污染染染染及及及及扩扩扩扩散散散散，而而而而基基基基因因因因工工工工程程程程实实实实验验验验中中中中使使使使用用用用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠
75、杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：插入灭活型载体插入灭活型载体插入灭活型载体插入灭活型载体CharonCharon2 2、CharonCharon6 6、 gt11gt11取代型载体取代型载体取代型载体取代型载体 EMBL4EMBL4、 gtgt c c、 NM762NM762、CharonCharon4040正选择型载体正选择型载体正选择型载体正选择型载体 EMBL1EMBL1、 L47L47、 10591059野生型的野生型的野生型的野生型的 噬菌体不能在噬菌体不能在噬菌体不能在噬菌体不能
76、在P2P2噬菌体溶源性噬菌体溶源性噬菌体溶源性噬菌体溶源性的细菌中繁殖（的细菌中繁殖（的细菌中繁殖（的细菌中繁殖（SpiSpi+），），），），这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受 -DNA-DNA上的上的上的上的redred和和和和gamgam两个基因控制。若将外两个基因控制。若将外两个基因控制。若将外两个基因控制。若将外源源源源DNADNA取代取代取代取代redred和和和和gamgam，重组重组重组重组噬菌体便拥有噬菌体便拥有噬菌体便拥有噬菌体便拥有SpiSpi-表型，能在表型，能在表型，能在表型，能在P2P2噬菌噬菌噬菌噬菌体体体体溶源性溶源性溶源性
77、溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装： -DNA-DNA重重重重组组组组分分分分子子子子需需需需在在在在体体体体外外外外人人人人工工工工包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体重重重重组组组组颗颗颗颗粒，
78、方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞用用用用于于于于体体体体外外外外包包包包装装装装的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质可可可可直直直直接接接接从从从从感感感感染染染染了了了了 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中提提提提取取取取，现现现现已已已已商商商商品品品品化化化化。这这这这些些些些包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白通通通通常常常常分分分分为为为为相相相相互互互互互互互互补补补补的的的的两两两两部部部部分分分分：一一一一部部部部分分分分缺缺缺缺少少少少E E组组组组份份份份，另另另另一一一一部部部部分分
79、分分则则则则缺缺缺缺少少少少DD组组组组份份份份。包包包包装装装装时时时时，当当当当且且且且仅仅仅仅当当当当这这这这两两两两部部部部分分分分包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白与与与与重重重重组组组组 -DNA-DNA分分分分子子子子混混混混合合合合后后后后，包包包包装装装装才才才才能能能能有有有有效效效效进进进进行行行行，任任任任何何何何一一一一种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白包包包包装装装装液液液液被被被被重重重重组组组组 -DNA-DNA污污污污染染染染后后后后，均均均均不不不不能能能能被被被被包包包包装装装装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计
80、的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 DNA DNA的体外包装的体外包装 是提高是提高噬菌体噬菌体转染效率转染效率的有效方法的有效方法 在在A A蛋白蛋白（有终止复制功能），（有终止复制功能），E E蛋白蛋白（是包装蛋白），（是包装蛋白），D D蛋白蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNADNA转入头部。转入头部。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA -DNA-DNA及其重组分子的分离纯化：及其重组分子
81、的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入加入加入 噬菌体或重组噬菌体或重组噬菌体或重组噬菌体或重组 噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养培养培养1 1小时小时小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒小
82、时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / L L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放 -DNA-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀 -DNA-DNA 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADN
83、A -DNA-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点： -DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 -DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量 重组重组重组重组 -DNA-DNA分子分子分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组重组重组 -DNA-
84、DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便分子的提取较为简便分子的提取较为简便 -DNA-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合表达片段，但不适合表达片段，但不适合表达片段，但不适合表达 外源基因外源基因外源基因外源基因n表达载体表达载体pET-5a是典型的是典型的pET载体，其组成是在载体的载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在
85、特定的宿主细胞中诱导表达。在特定的宿主细胞中诱导表达。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构生物结构生物结构M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13M13 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正正正链链链链DNADNA组成组成组成组成 M13M13 DNADN
86、A全长全长全长全长64076407个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸M13 DNAM13 DNA上上上上至少有至少有至少有至少有1010个基因个基因个基因个基因27002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子M13M13 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 nM13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续
87、生长和分裂。菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链DNA，由，由6407的碱基组成的碱基组成（GenBank注册号为注册号为V00604）。基因组。基因组90%以上以上的序列可编码蛋白质，共有的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因位于基因和基因和基因以及基以及基因因和基因和基因之间，其间有之间，其间有调节基因表达和调节基因表达和DNA合成的元合成的元件。件。M13噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码3类类蛋白质，包括复制蛋白（基因蛋白质，包括复制蛋
88、白（基因，和和），形态发生蛋白），形态发生蛋白（基因（基因，和和），结构蛋），结构蛋白（基因白（基因、和和）。基因组）。基因组DNA为正链，按为正链，按基因基因至基因至基因方向合成，方向合成，与噬菌体的与噬菌体的mRNA序列同义。序列同义。nM13噬菌体颗粒为丝状长管噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长状结构，长880nm，直径，直径6-7nm。噬菌体颗粒的核心由。噬菌体颗粒的核心由2700个基因个基因编码的结构编码的结构蛋白呈管状排列而成，成熟蛋白呈管状排列而成，成熟的基因的基因的产物为由的产物为由50个个氨基酸残基组成的氨基酸残基组成的螺旋蛋螺旋蛋白。顶端由白。顶端由5个基因个基因和和5个基因个
89、基因产物组成，作用于产物组成，作用于间隔区中的包装信号。间隔区中的包装信号。5个个基因基因蛋白和蛋白和5个基因个基因蛋白位于丝杆的末端，参与蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。右图是对性纤毛的吸咐。右图是M13噬菌体结构模型。噬菌体结构模型。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期感染周期感染周期+ DNA+ DNA（+ +）DNADNARFDNARFDNAR
90、FDNARFDNARFDNARFDNA- DNA- DNAIIIIVV在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。通过复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。n单链单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的体在用作载体时是利用其双链状态
91、的RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。作，并可通过转化方法再次导入细胞。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13 DNAM13 DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型野生型野生型M13RF-DNAM13RF
92、-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mpM13mp系列载体系列载体系列载体系列载体lacZlacZ polylinkerpolylinker噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13 DNAM13 DNA载体的特点：载体的特点：载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外片段以特定单链的形式输出受体细胞外片段以特定
93、单链的形式输出受体细胞外片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在这在这在这在DNADNA定向突变中非常有用定向突变中非常有用定向突变中非常有用定向突变中非常有用M13M13重组分子筛选简便重组分子筛选简便重组分子筛选简便重组分子筛选简便被被被被M13M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大斑的混浊度亦越大斑
94、的混浊度亦越大斑的混浊度亦越大 但但但但M13-DNAM13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 1.5 kbkb噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组毒基因组毒基因组毒基因组DNADNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种
95、动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链单链单链单链DNADNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链DNADNA病毒病毒病毒病毒单链单链单链单链RNARNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链RNARNA病毒病毒病毒病毒 RNA RNA病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的
96、病毒在自我复制时大多存在相应的DNADNA中间反应物，中间反应物，中间反应物，中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的DNADNA重组。重组。重组。重组。考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒 -DNA-DNA载体和载体和载体和载体和M13-DNAM13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25 25 kbkb和和和和1.51.5 kbkb，但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要但在很多
97、情况下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源克隆更大的外源克隆更大的外源DNADNA片段，片段，片段，片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。的装载量。的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNADNA的长度，的长度，的长度，的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬
98、菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNADNA与包装有关的序与包装有关的序与包装有关的序与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组又能保证重组又能保证重组又能保证重组DNADNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这分子在体外仍被包装成有感染力的
99、颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNADNA分子在细胞内分子在细胞内分子在细胞内分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。n粘粒（粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有）实际是质粒的衍生物，是带有
100、cos 序列序列的质粒。的质粒。cos序列是序列是 噬菌体噬菌体DNA中将中将DNA包装到噬包装到噬菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的DNA序列。序列。n粘粒的组成包括质粒复制起点（粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记），抗性标记（ampr），），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段左右，用来克隆大片段DNA，克，克隆的最大隆的最大DNA片段可达片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个。有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。位点，在某种程度上可提高使用效率。考斯质粒与
101、噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有19781978年年年年CollinsCollins和和和和HohnHohn发明构建发明构建发明构建发明构建pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcrr fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISa
102、lI -DNA -DNA coscos序列和序列和序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体特殊类型的载体特殊类型的载体coscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid1.8 1.8 kbkb的的的的 -DNA-DNA片段片段片段片段 + + pBR322pBR322片段片段片段片段装载范围为装载范围为装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）
103、考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像能像能像 -DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛
104、选容易重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子包装序列、复制子包装序列、复制子
105、包装序列、复制子以及以及以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像能像能像能像M13-DNAM13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的装载量比常规的装载量比常规的装载量比常规的M13mpM13mp系列要大很多（系列要大很多（系列要大很多（系列要大很多（10 10 kbkb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样
106、在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链DNADNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNADNA考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119p
107、UC118 / 119pUC118 pUC118 pUC18 pUC18 + + M13M13间隔区间隔区间隔区间隔区 IGIGpUC119 pUC119 pUC19 pUC19 + + M13M13间隔区间隔区间隔区间隔区 IGIG500 500 个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝3200 bp3200 bpMCSMCSlacZlacZlacIlacIorioriApAprrM13-MGM13-MGpUC118 / 119pUC118 / 119表示表示表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒
108、（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript pBluescript 体外转录载体体外转录载体体外转录载体体外转录载体pBluescript = pUCpBluescript = pUC + + f1-f1-oriori + + P PT3T3 + + P PT7T72958 bp2958 bpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrf1-f1-orioripBluescriptpBluescriptPPT3T3噬菌体启动子噬
109、菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子P PT3T3和和和和P PT7T7强化外强化外强化外强化外源基因的转录源基因的转录源基因的转录源基因的转录提取出来的单链提取出来的单链提取出来的单链提取出来的单链DNADNA重组分重组分重组分重组分子子子子在噬菌体在噬菌体在噬菌体在噬菌体RNARNA聚合酶的存聚合酶的存聚合酶的存聚合酶的存在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因的体外转录的体外转录的体外转录的体外转录n人们设计出一些多功能的质粒载体，这人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、类质粒载体有多克隆位点、-互补、噬互补、噬菌体启动子
110、和单链噬菌体的复制与包装菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。信号。n典型的这类质粒有典型的这类质粒有pBluescriptKS（），这类质粒一），这类质粒一般由般由4个质粒组成一套系统，其差别在个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端点两端Kpn和和Sac的顺序，用的顺序，用KS或或SK表示），或单链噬菌体的复表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导制启始方向相反（或者说，引导DNA双链中不同链合成单链双链中不同链合成单链DNA，用，用+或或-表示）。表示）。pBluescriptKS（）的的多克隆位点与多克隆位点与
111、pUC18/19的不同，且使的不同，且使用用f1噬菌体的复制与包装信号序列噬菌体的复制与包装信号序列。人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要需要需要克隆数百克隆数百克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千甚至上千甚至上千 kb kb 的的的的DNADNA片段，片段，片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。量也远
112、远不能满足需要。量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在
113、这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）人造染色体载体人造染色体
114、载体人造染色体载体人造染色体载体细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的基础上质粒的基础上质粒的基础上质粒的基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间之间之间之间各种类型的各种
115、类型的各种类型的各种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构结构结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库F质粒质粒n大肠杆菌的大肠杆菌的F因子是一个约因子是一个约100kb的质粒。它编码的质粒。它编码60多多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（种参与复制、分配
116、和接合过程的蛋白质（WillettsandSkurray，1987）。）。n虽然虽然F因子通常以双链闭环因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝个拷贝/细胞）的形细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处个位点处进行随机整合（进行随机整合（Low，1987）。）。n携带携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的发样状的F菌毛。菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。触所必需。n细菌人工染色体是基于大肠杆菌的细菌人工染色体是基于大肠杆菌的F质
117、粒构建的，高通质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。量低拷贝的质粒载体。n每个环状每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制因子（致育因子）的严谨型控制的复制子子oriS （Shizuyaetal.1992），一个易于），一个易于DNA复制复制的由的由ATP驱动的解旋酶（驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA ,parB ,和和parC ）。nBAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源载体的低拷
118、贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。20060424真核生物载体真核生物载体n电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。促使细胞发生融合的目的。n该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。物克隆等。显微注射技术将外源显微注
119、射技术将外源DNA注入细胞注入细胞基因枪技术基因枪技术n是一种将核酸直接发送至细胞内是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。的物理学方法。nPDS-1000/H台式基因枪可以实台式基因枪可以实现对细胞的原位转导；现对细胞的原位转导；应用于包括培养细胞、组织、器应用于包括培养细胞、组织、器官、植物、动物、细菌和细胞器官、植物、动物、细菌和细胞器官等各种不同的目标。官等各种不同的目标。穿梭载体（穿梭载体（Shuttlevector）n是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或些载体既能在原
120、核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在能在E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。体主要是质粒载体。酵母附加型质粒酵母附加型质粒n2um质粒是非常好的克隆载体，它有质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细大小，在酵母细胞中的拷贝数在胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因白质的基因REP1,REP2。n2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵质粒的问题：选择
121、标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用的转化。为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。合成基因，可以在基本培养基上生长。以以2um质粒为基础的载
122、体质粒为基础的载体酵母附加质粒酵母附加质粒n来自于来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的可以含有完整的2um质粒，也可以只含有质粒，也可以只含有2um质粒质粒的复制起点，如的复制起点，如YEp13以后的类型。以后的类型。nYEp13是一个穿梭质粒，含有是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选质粒的复制起点和选择基因择基因LEU2,YEp13还包含还包含pBR322的完整序列，因此可的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。nYEp的结构的结构nYEp整合到酵母染色体上整合到酵母
123、染色体上根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒质粒n几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。）。n其致瘤特性是由其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）质粒介导的。）质粒介导的。n农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导质可以诱导Vir（Virulenceregio
124、n)基因的启动表达，基因的启动表达，Vir基基因的产物将因的产物将Ti质粒上的一段质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合，形成复结合，形成复合物，转化植物根部细胞。合物，转化植物根部细胞。nTDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（鱼
125、碱（octopine）、胭脂碱（）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生），使农杆菌生长必需的物质。长必需的物质。nTi质粒大约在质粒大约在160240kB之间。其中之间。其中T-DNA大约在大约在15kb-30kb。Vir基基因区在因区在36kb左右。除此之左右。除此之外，外，Ti质粒上还存在质粒上还存在Con区（区（regionencodingconjugation)和和Ori区区（originofreplication)。nT-DNA上共有三套基因和上共有三套基因和左右两个边界，左右两个边界，LB和
126、和RB是长为是长为25bp的末端反复重的末端反复重复顺序，在切除及整合过复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。程具有重要意义。nT-DNA切除由切除由Vir区编区编码的特异性内切酶完码的特异性内切酶完成，分别在成，分别在LB和和RB的的第三个碱基和第四个第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，碱基之间产生缺口，并形成单链并形成单链T-DNA。nT-DNA的的LB和和RB在整在整合中的作用是不对称合中的作用是不对称的，的，RB顺序与整合有顺序与整合有关，而关，而LB无关。无关。nT-DNA的整合可以是的整合可以是单拷贝的，也可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形多拷贝的，成串联形式排列，但整合位
127、点式排列，但整合位点的特异性尚未确定。的特异性尚未确定。植物细胞转化的共整合系统植物细胞转化的共整合系统nT-DNA克隆在大肠杆菌克隆在大肠杆菌质粒上，含有质粒上，含有E.coli的的选择标记和植物选择标选择标记和植物选择标记记Kmr。n首先在首先在E.coli中筛选重中筛选重组分子，然后将重组质组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒转化到农杆菌中，质粒与粒与Ti质粒上的同源序质粒上的同源序列发生同源重组，将外列发生同源重组，将外源基因整合到源基因整合到Ti质粒上，质粒上，用于侵染植物细胞。用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植重组分子整合到植物细胞染色体物细胞染色体DNA上，上，K
128、mr筛选转化细胞。筛选转化细胞。植物细胞转化的双元系统植物细胞转化的双元系统n目前目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上质粒上的的
129、Vir基因，随后将穿梭质粒的基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植切割下来，转移到植物细胞中。物细胞中。典型的杆状病毒表达系统典型的杆状病毒表达系统n典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。这些过程要求大量的操作时间，周期长达几病毒。这些过程要求大量的操作时间，周期长达几周。周。BaculoDirect杆状病毒表达系统简化了这杆状病毒表达系统简化了这些过程，节省了大量时间，使你可以比以往任何时些过程，节省了大量时间，使你可以比以往任何时候更快
130、地获得杆状病毒表达结果。候更快地获得杆状病毒表达结果。nBaculoDirect系统利系统利用快速、简便的用快速、简便的Gateway技术。技术。BaculoDirect线性线性DNA包含了包含了attR位点，位点，允许与包含有目的基因允许与包含有目的基因的的Gateway入门克隆入门克隆进行有效的重组。将进行有效的重组。将entry克隆、克隆、BaculoDirect线性线性DNA和和GatewayLRClonase酶混合物稍酶混合物稍加混匀，在室温下反应加混匀，在室温下反应1小时即可。最终的反应小时即可。最终的反应混和物中包含有携带目混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可的基因的杆状病毒
131、，可以直接用于转染昆虫细以直接用于转染昆虫细胞（胞（sf9或或sf21）。）。SV40病毒作为载体病毒作为载体反转录病毒反转录病毒n反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。n反转录病毒的反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序基因组的两端各有一个长末端重复序列列(5LTR和和3LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列非编码序列+，同时有三个编码蛋白质的基因，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和和env。n反转录病毒载体可以容纳外源反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在的长度在10kb左右，左右，以很高的转染率感
132、染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。胞基因组内，这种整合的位点是随机的。n反转录病毒载体在构建时，删去了反转录病毒载体在构建时，删去了poi、env基因和基因和gag基因的基因的3端，但保留了病毒颗粒所需的端，但保留了病毒颗粒所需的+序列。其目的序列。其目的是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的胞后进行增殖并包装成病
133、毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个伤害。这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。系内大量扩增。n反转录病载体多半用于基因治疗，由于病毒载体在宿主反转录病载体多半用于基因治疗，由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入，人们担心会引起不安全的后果，细胞基因组上随
134、机插入，人们担心会引起不安全的后果，这种载体还在不断改进之中。这种载体还在不断改进之中。YAC人工染色体载体人工染色体载体n是利用酿酒酵母（是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。中。n酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；分钟；含含16条染色体，其大小为条染色体，其大小为225-1900kb，总计有，总计有14106bp；具真核；具真核mRNA的加工活性。的加工活性。人造染色体载体人造染色体载体人造
135、染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELo
136、rioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体
137、酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接连接连接转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色
138、体重组酵母染色体重组酵母染色体npYAC4：当用：当用 BamH切割成线状后，就形成了一个微型酵母染切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。片段。nYAC载体的原理性工作流程：对于载体的原理性工作流程：对于BamH切割后形成的微型酵切割后形成的微型酵母染色
139、体，当用母染色体，当用EcoR或或Sma切割抑制基因切割抑制基因sup4内部的位内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活，从而形成红色菌落；插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转
140、入到酵母细而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。文库。YAC文库装载的文库装载的DNA片片段的大小一般可达段的大小一般可达200-500kb，有的可达，有的可达1Mb以上，甚至达到以上，甚至达到2Mb。用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因和和显性基因显性基因两大类两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基
141、因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU LEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素抗氯霉素 dhfr d
142、hfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2蔗糖转化酶蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型CC用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞3 3基因工程的基本条件基因工程的基本条件各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基
143、因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hsdRhsdR- -） 重组整合缺陷型重组整合缺陷型重组整合缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recArecA- -）
144、具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简遗传
145、背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定单，重组子稳定单，重组子稳定单，重组子稳定 适用于外源适用于外源适用于外源适用于外源DNADNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效的扩增和克隆、原核生物基因的高效的扩增和克隆、原核生物基因的高效的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是表达、基因文库的构建，是表达、基因文库的构建，是表达、基因文库的构建，是DNADNA重组实验和基因工程的主重组实验和基因工程的主重组实验和基因工程的主重组实验和基因工程的主要受体菌要受体菌要受体菌要受体菌 产结构复杂、种类繁多的内毒素产结构复杂、
146、种类繁多的内毒素产结构复杂、种类繁多的内毒素产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培，生长迅速，培，生长迅速，培，生长迅速，培养简单，不产内毒素养简单，不产内毒素养简单，不产内毒素养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的适
147、用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌有效分泌有效分泌有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备遗传欠稳定，载体受体系统欠完备遗传欠稳定，载体受体系统欠完备遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性链霉菌链霉菌链霉菌链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良主要用于抗生素生产菌株的改良主要用于抗生素生产菌株的
148、改良主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢遗传不稳定，生长相对缓慢遗传不稳定，生长相对缓慢遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源适用于外源
149、适用于外源适用于外源DNADNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高的扩增、克隆以及真核生物基因的高的扩增、克隆以及真核生物基因的高的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是是是是DNADNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌重组实验和基因工程重要的真核性受体菌重组实验和基因工程重要的真核性受体菌重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性
150、蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定快，培养成本低廉，遗传稳定快，培养成本低廉，遗传稳定快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达适用于真核
151、生物基因的高效表达 DNADNA重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 CHOCHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统的糖基化修饰系统的糖基化修饰系统的糖基化修饰系统 适用于哺乳类
152、动物和人的基因表达调控研究、基因药物适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是的生产，是的生产，是的生产，是DNADNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢细胞培养条件苛刻，生长缓慢细胞培养条件苛刻，生长缓慢细胞培养条件苛刻，生长缓慢 各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶植物
153、细胞（拟南芥菜、烟叶植物细胞（拟南芥菜、烟叶植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用胞培养简单且成本低廉，具有光合作用胞培养简单且成本低廉，具有光合作用胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产
154、，农作物品质的改良农作物品质的改良农作物品质的改良农作物品质的改良 遗传操作繁琐遗传操作繁琐遗传操作繁琐遗传操作繁琐 实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：用于接受质粒：用于接受质粒：C600C600、W3110W3110、HB101HB101、JM83JM83、 JM101 JM101（ApApss、TcTcss、CmCmss） 用于接受用于接受用于接受用于接受 -DNA-DNA：LE392LE392、ED8654 ED8654 酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO CHO 毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母啤酒酵母啤酒酵母啤酒酵母啤酒酵母
