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1、PCR质量控制质量控制及常见问题分析、对策及常见问题分析、对策临床检验技术历经了一、化学试剂检验二、酶促生化检验三、抗原-抗体免疫反应等三个主要技术阶段四、近年来人类基因组计划的完成也推动了临床检验进入基因检测-分子诊断分子诊断时代 血糖 检测一 PCR技术最根本特征二 PCR系统外的质量控制三 PCR体系内的常见问题、原因分析及对策1.传统诊断传统诊断: 靶A+试剂B 信号C, 均为信号相加模式。2.PCR: 1,2,4,8-230(109)- 2n -靶分子指数增加指数增加模式。PCR极高扩增放大倍数亦带来非特异性过度放大!1. 硬件建设硬件建设:2. 软件控制软件控制: 标准操作SOP,
2、 人员操作培训,质量追踪体系。分室/分区实验室, 安全柜,仪器,螺盖管/胶膜96孔板,PCR反应液加矿物油封闭,UDG酶消除气雾胶。PCR体系问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略临床PCR检测的常见问题实时荧光PCR定量检测的关键问题PCR体系内的常见问题、原因分析及其对策体系内的常见问题、原因分析及其对策PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯纯 度度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓浓 度度 加量过多导致非特异性扩增增加引 物特异
3、性特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体PD完整性完整性 避免反复冻融浓浓 度度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少反应体系对PCR扩增的影响过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当避免反复冻融pH值适当避免污染 pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂反应缓冲液dNTPsdH2OMg 2浓度如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶Taq酶pfu酶Hotstart Taq酶混合酶Taq plusLong TaqTaq platinum特异性特异性-基因组扩增、RT-PCR保真性保真性-基因筛选、测序、克隆长片段片段扩增增-构建基因图谱、测序等扩增效率增效率-复杂模板扩增（G
4、C含量高、二级结构）PCR试剂盒盒-复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶-根据PCR实验需求PCR常见问题之一-无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无 M 1 2 正对照原原因因模板含有抑制物，含量低引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间对对策策PCR常见问题之二-非特异性扩增现象： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原原因因对策对策引物特异性差模板或引物
5、浓度过高退火温度偏低循环次数过多重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数 PCR常见问题之三-拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态 M 1 2 原原因因对策对策模板不纯退火温度偏低循环次数过多纯化模板适当提高退火温度减少循环次数PCR常见问题之四-假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原原因因靶序列或扩增产物的交叉污染交叉污染对对策策操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 提高PC
6、R反应特异性策略巢式巢式PCR（Nest-PCR） 递减递减PCR（TouchDown PCR） 热启动热启动PCR（HotStart PCR） 使用使用PCR增强剂增强剂策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2u 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。u 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 策略之二递减PCRu 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。u特异性
7、最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。u递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三热启动PCRu 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；u现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；u热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最基本的方法之一。策略之四使用PCR增强剂u 甲酰胺、DMSO、TMA、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。u其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通
8、过二级结构区。u增强剂浓度要适当。实时荧光定量FQ-PCR 通过实时监测扩增产物量（荧光信号）与起始靶基因量相关而定量, 扩增产物荧光强度荧光强度达到对数期的循环数循环数(Ct值,Cycle threshold）与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关(右图)。 常规终末常规终末PCR问题问题: 同一样本重复复48管反应PCR终末检测或平台期检测变化非常大,无法精确定量(左图)。 荧光定量PCR关键问题 扩增曲线扩增曲线：一般任意引物对PCR常见30个循环就有严重PD非特异性扩增(左图);HANDS ,Nucleic Acids Res.,1997,Vol.25(16): 32153241采用art
9、ificial homo引物完全消除PD非特异性,但显著降低特异性扩增效率。 Copy/pcr: 4108, 4107, 4106, 4105, 4104, 4103, 4102,4101,和4100, 0Common Ct: 13, 16, 19.5, 23, 26, 29, 30, 30.5, 30.5, 31Hands Ct: 12.5, 16, 19.5, 22, 25.5, 29, 32.5, 36, 38， LinerFig 1.Common Primer PCRFig 2. Improved Hands PCR Improved Hands使用Partial-homo引物对荧光P
10、CR不影响靶特异性效率, 而将PD非特异性扩增推迟至40/45个循环之后(右图) 。 荧光定量PCR常见问题无Ct值（信号）出现或出现过晚：阴性对照出现明显的扩增：荧光PCR mix或水污染；出现引物二聚体：设计特异性引物。反应循环数不够；检测荧光信号步骤有误；引物、探针设计不佳或降解；模板量少或降解。扩增片段过长：100200bp。荧光定量PCR常见问题溶解曲线不止一个主峰：引物设计不佳：设计特异性引物；退火温度低：调整退火温度；模板中有基因组污染：注意提取过程；反应体系污染等：设置阳性阴性对照。荧光定量PCR常见问题扩增效率低：重复性不好： 反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法， 降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物； 反应体系中有抑制物：一般为模板引入。 加样不准确或试剂不稳定； 仪器温度或光路均一性不好； 模板降解而浓度改变。临床PCR检测的常见问题假阳性问题假阴性问题定量问题 方法学问题：靶基因序列特异性、非特异性扩增尤其引物二聚体PD扩增 污染问题：样本污染、产物污染 试剂因素 操作因素 仪器因素 标本因素 外标定量与内标定量干扰物质：干扰物质：人白蛋白胆红素游离血红蛋白类风湿因子总IgG甘油三酯
