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1、2.2.22.2.2动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件 2002年年12月月30日，日， 两场筹备了两场筹备了10年的年的“太太空婚礼空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞植物细胞“新人新人”黄花烟草黄花烟草和和革新一号烟草革新一号烟草叶肉细胞叶肉细胞原原生质体生质体，动物细胞动物细胞“新人新人”是小鼠是小鼠B淋巴细胞淋巴细胞和和骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞，两批新人同时在，两批新人同时在 “产房产房”电融合电融合仪内孕育新生命。仪内孕育新生命。“太空婚礼太空婚礼”这两场这两场“太空婚礼太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技实质是哪
2、两项细胞工程技术术植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件知知识识回回顾顾植植物物体体细细胞胞杂杂交交过过程程植物细胞植物细胞 A A（番茄）（番茄）植物细胞植物细胞 B B（马铃薯）（马铃薯）去除细胞壁去除细胞壁原生质体原生质体 A A原生质体原生质体 B B原生质体融合原生质体融合正在融合的原生质体正在融合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株( (番茄马铃薯番茄马铃薯) )再分化再分
3、化动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件一、动物细胞融合一、动物细胞融合（一）（一）. .动物细胞融合概念动物细胞融合概念 又称为又称为细胞杂交细胞杂交。指指两个或多个动物细胞结合两个或多个动物细胞结合形成形成一个细胞一个细胞的过程。的过程。 杂交细胞：杂交细胞：融合后形融合后形成的具有原来两个或多个成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的细胞遗传信息的单核细胞单核细胞，称为杂交细胞。称为杂交细胞。动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件不同不同DNADNA的两个细胞的两个细胞灭活病毒灭活病毒诱导细胞融合诱导细胞融合融合后的细胞（杂交细胞）融合后的细胞（杂交细胞）进行进行有丝分裂
4、有丝分裂（动物细胞培养技术）（动物细胞培养技术）（二）（二）. . 动物细胞融合过程动物细胞融合过程动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件 1 1、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？胞壁？动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？2 2、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？4 4. .动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？酶解法酶解法，纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶。无需，因为动物细胞
5、无细胞壁。无需，因为动物细胞无细胞壁。物理方法：离心、振动、电激；化学方法：聚乙二醇物理方法：离心、振动、电激；化学方法：聚乙二醇能能 ；还可以利用灭活的病毒进行诱导；还可以利用灭活的病毒进行诱导。如灭活的仙台病毒如灭活的仙台病毒3.3.融合后细胞的类型？融合后细胞的类型？ABAB杂种细胞遗传物质有什么特点？杂种细胞遗传物质有什么特点？三种三种AAAA、ABAB、BBBB（A A、B B）含两种生物的遗传物质含两种生物的遗传物质动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件5 5、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？灭活的原理是什么？灭活的原理是什么？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的
6、蛋白质分子和脂质重新排因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。布，细胞膜打开，细胞发生融合。病毒病毒病毒病毒灭活灭活灭活灭活丧失感染活性丧失感染活性丧失感染活性丧失感染活性保留融合活性保留融合活性保留融合活性保留融合活性动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件（二）（二）. .原理：原理：细胞膜的流动性。细胞膜的流动性。 （三）（三）. .促进细胞融合方法：促进细胞融合方法：物理法：电激、振动、离心等物理法：电激、振动、离心等化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG）生物法：灭活的病毒（最常用）生物法：灭活的病毒（最常用） 产生杂交细胞，即具有原来两个或
7、多个细胞遗传信息的产生杂交细胞，即具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。单核细胞。（四）（四）. . 结果：结果：（五）动物细胞融合技术的意义和应用（五）动物细胞融合技术的意义和应用动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件有有何何同同？不不同同？动物细胞融合动物细胞融合植物的体细胞杂交植物的体细胞杂交动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）生物：灭活的病毒生物：灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动、电激）动、电激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导融
8、合方法诱导融合方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合过程细胞融合过程细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性细胞的全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目（七）植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较（七）植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件人们获得抗体的传统方法是什么人们获得抗体的传统方法是什么? ?动物体内动物体内刺激刺激抗体抗体 筛选单一浆细胞筛选单一浆细胞不能无限增殖产生大量抗体不能无限增殖产生大量抗体 抗原抗原 浆
9、细胞浆细胞这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ? 产量低、纯度低，制备的抗体特异性差。产量低、纯度低，制备的抗体特异性差。血清血清二、单克隆抗体二、单克隆抗体每一个浆细胞每一个浆细胞只能产生一种只能产生一种特异性抗体特异性抗体体内产生的体内产生的特异性抗体特异性抗体多达百万种多达百万种动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术单单克克隆隆抗抗体体 既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体， 又能大量繁殖的细胞又能大量繁殖的细胞骨髓瘤细胞骨髓
10、瘤细胞能无限增能无限增殖殖 + +一个一个浆细胞只分泌浆细胞只分泌一种一种特异性抗体特异性抗体设计方案：设计方案：19751975年英国科学家年英国科学家米尔斯坦米尔斯坦和和柯勒柯勒的实验的实验动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件（一）（一）. .单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念 由由单个单个B B淋巴细胞（浆细胞）经过淋巴细胞（浆细胞）经过克隆克隆形成的形成的细胞群细胞群，这一细胞群所产生的，这一细胞群所产生的化学性质单一、特化学性质单一、特异性强异性强的抗体称为单克隆抗体。的抗体称为单克隆抗体。 （二）（二）. .单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件（二）（
11、二）. .单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件为什么给小鼠注射特定的为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？抗原蛋白？ 会有几种融合方式？会有几种融合方式？ 杂交瘤细胞是如何筛选出杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有何特点？来的？有何特点？ 是否所有的杂交瘤细胞都是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？能产生专一性抗体？ 如何大规模进行培养得到如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？大量的单克隆抗体？动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一选）（一选）选选择性培养基择性培养基：只有只有杂交瘤杂交瘤细胞细胞才能存才能存活活
12、获得产生相应获得产生相应抗体的抗体的B B细胞细胞（二选）：选（二选）：选能产生所需能产生所需专专一抗体的杂交一抗体的杂交瘤细胞瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养杂交瘤细胞特点：杂交瘤细胞特点：既能产生特异性既能产生特异性抗体，又能大量抗体，又能大量增殖。增殖。动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件诱导诱导融合融合选择培养基选择培养基克隆化培养克隆化培养体外培养或体外培养或小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖给小鼠注射特定的抗原蛋白给小鼠注射特定的抗原蛋白B B淋巴细胞（免疫）淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞（杂交瘤细
13、胞（ B-B-瘤细胞）瘤细胞）单克隆抗体单克隆抗体产生特定抗体的杂交瘤细胞产生特定抗体的杂交瘤细胞瘤瘤-瘤细胞瘤细胞B-瘤细胞瘤细胞 B-B细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选抗体阳性检测抗体阳性检测第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选动动物物细细胞胞融融合合动动物物细细胞胞培培养养动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件已已知知细细胞胞增增殖殖时时合合成成DNADNA有有D D和和S S两两条条途途径径，其其中中D D途途径径能能被氨基嘌呤阻断。被氨基嘌呤阻断。人人淋淋巴巴细细胞胞中中有有这这两两种种DNADNA的的合合成成途途径径，但但一一般般不不分分裂裂增增殖。殖。 鼠骨髓瘤细胞
14、鼠骨髓瘤细胞中尽管没有中尽管没有S S途径，但能不断分裂增殖，途径，但能不断分裂增殖， 加加入入氨氨基基嘌嘌呤呤后后，使使D D合合成成途途径径阻阻断断，仅仅有有D D合合成成途途径径的的 及其彼此融合的细胞不能增殖。及其彼此融合的细胞不能增殖。 人人淋淋巴巴细细胞胞和和骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞融融合合后后的的杂杂交交细细胞胞中中可可利利用用淋淋巴巴细细胞胞中中的的S S途途径径合合成成DNADNA而而增增殖殖。从从培培养养液液中中分分离离出出杂杂交细胞。交细胞。如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件 骨髓瘤细胞是癌细胞
15、吗？骨髓瘤细胞是癌细胞吗？ 有无限增殖能力有无限增殖能力（丧失凋亡机制，失去（丧失凋亡机制，失去接触抑制等）接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞的细胞是肿瘤细胞，而具有转而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞。肿瘤细胞。肿瘤细胞不等于癌细胞。不等于癌细胞。动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件1.1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.2.分离分离B B淋巴细胞淋巴细胞（B B）；）；找到骨髓瘤细胞找到骨髓瘤细胞（G G）。）。3.3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式: :（BB;BG;GGBB;BG;GG）4.4.第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上
16、培养筛选上培养筛选杂杂交瘤细胞交瘤细胞（只有（只有BGBG杂交瘤细胞存活杂交瘤细胞存活）。5.5.第二次筛选：对已经选择性培养的杂交瘤细胞进行第二次筛选：对已经选择性培养的杂交瘤细胞进行“克隆化培养克隆化培养”，并进行并进行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检检测阳性测阳性”的即是所需要的杂交瘤细胞。的即是所需要的杂交瘤细胞。6.6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射或注射到到小鼠腹腔内小鼠腹腔内增殖。增殖。7.7.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。单抗的制备过程要点：单抗的制备过程要点：动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件2 2 2 2、为何要进行两次
17、筛选？、为何要进行两次筛选？、为何要进行两次筛选？、为何要进行两次筛选？第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（有多种）。次筛选得到杂交瘤细胞（有多种）。第第2 2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。1 1、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有物质，不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体动物细胞融合
18、和单克隆抗体优秀课件特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。（三）（三）. .单克隆抗体的优点单克隆抗体的优点动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件 1 1、作为诊断试剂：、作为诊断试剂： 具有准确、高效、简易、快速特点具有准确、高效、简易、快速特点. . 2 2、用于治疗疾病和运载药物：、用于治疗疾病和运载药物： （四）（四）. .单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用想一想：这是利用什么原理想一想：这是利用什么原理? ?抗体与相应抗原发生特异性结合原理抗体与相应抗原发生特异性结合原理“生物导弹生物导弹” ” 单克隆抗体药物单克隆抗体药物 单抗导向，药物为弹头单抗导向，药物为弹头
19、 主要用于治疗主要用于治疗癌症治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成癌药物，形成“生物导弹生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。准确杀伤癌变细胞。动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有 什么不同？什么不同？ 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。合。 诱导融合方法有所不
20、同诱导融合方法有所不同：动物细胞诱导融合：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；诱导； 结果不同：结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。 动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件 2. 2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B淋淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？B B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；
21、骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种因此，把一种B B淋淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。 动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选
22、出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A B C D 动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件2 2 2 2、1975197519751975年，英国剑桥大学分子生物年，英国剑桥大学分子生物年，英国剑桥大学分子生物年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠学实验室的科勒和米尔斯坦
23、，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实实现在体外大量生产抗体的目的。实实现在体外大量生产抗体的目的。实实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。验过程如图所示。验过程如图所示。验过程如图所示。(1)(1)(1)(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓
24、瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合融合融合融合”在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜 。( ( ( (2 2 2 2) ) ) )杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是_分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状_ _ _ _ _ _ _ _。 ( ( ( (3 3 3 3) ) ) )单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原
25、( ( ( (病原体或癌变细胞病原体或癌变细胞病原体或癌变细胞病原体或癌变细胞等等等等) ) ) )并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”这是利用了这是利用了这是利用了这是利用了_ 。具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性有丝有丝不变不变不变不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件3
26、、下图表示单克隆抗体的制备过程，请分析完成下列问题：、下图表示单克隆抗体的制备过程，请分析完成下列问题：（1 1） A A过程是从小鼠的脾脏取得过程是从小鼠的脾脏取得 细细胞，该细胞能够产生胞，该细胞能够产生 。从小鼠体内提。从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射取分离该细胞之前，应给小鼠注射 类物质。类物质。能能产生抗体的产生抗体的B B特异性特异性抗体抗体抗原抗原动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件（2 2）B B过程是一个过程是一个 过程，该过程的进行需过程，该过程的进行需要灭活的要灭活的 或或 诱导。诱导。CDCD是是 过程，选出能产生特异性抗体过程，选出能产生特异性抗体的的 ，继续培养。，继续培养。（3 3）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面与）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面与常规抗体相比，其特点是常规抗体相比，其特点是 。细胞融合细胞融合病毒病毒聚乙二醇聚乙二醇筛选筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高，优越性非常明显。特异性强、灵敏度高，优越性非常明显。动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件动物细胞融合和单克隆抗体优秀课件
