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1、反相液相色谱法分离芳香烃反相液相色谱法分离芳香烃一、实验目的1、熟悉HPLC仪的基本结构,初步掌握其使用方法；2、通过实验，加深对色谱分离分析原理的理解，了解最佳实验条件的选择；3、掌握依据保留时间定性和归一化法定量的分析方法。 高效液相色谱法是一种重要的分离技术，根据所用固定相和分离机理的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排阻色谱等。 在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于他们在固定相和流动相之间的分配系数K： K= 显然，K值越大，组分在固定相上的保留时间越长，固定相与流动相之间的极性差值越大。故，出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相色谱和流
2、动相为极性而固定相为非极性的反相色谱法。目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法是将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18)键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，可用反相色谱法分离芳香烃类化合物。二、色谱分离原理 高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱仪器分析方法。它是在以液体作为流动相的一种色谱分析方法，由于采用了高压输液泵和小粒度填料，高效液相色谱可获得很高的分离效果。它的基本概念及理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等与气相色谱法基本一致，但又有不同。二者的
3、主要区别为以下几点： 高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱仪器分析方法。它是在以液体作为流动相的一种色谱分析方法，由于采用了高压输液泵和小粒度填料，高效液相色谱可获得很高的分离效果。它的基本概念及理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等与气相色谱法基本一致，但又有不同。二者的主要区别为以下几点： 1.由于流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间存在着一定的相互作用力，流动相在一定程度上参与分配平衡的竞争。 2.由于流动相的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中要小45个数量级。 3.由于流动相的选择范围广泛
4、，并可配成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率。 4.高效液相色谱采用了310m细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相。5.高效液相色谱是在液相中进行，被测组分的检测通常采用灵敏的湿法光度检测器。6.气相色谱分析一般在较高的温度下进行，而高效液相色谱经常在室温下进行。7.液相色谱法分析的样品不受样品挥发性和热稳定性限制，适合于分离生物大分子、不稳定的天然产物、离子型化合物及高沸点的高分子化合物。 与气相色谱法相比，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但他的应用范围更加广泛。高效液相色谱的定性和定量与气相
5、色谱分析相似。流程图流程图六通阀六通阀紫外检测器紫外检测器高压输液泵高压输液泵三、仪器和试剂1.高效液相色谱仪（LC-200)、C-18烷基键合相柱2.紫外检测器（254nm）3.样品：苯、萘、甲苯的混合物4.纯苯、萘、甲苯（均为色谱纯、各含10微克/L的正己烷溶液）5.流动相：甲醇：H2O为83：17四、实验步骤1.流动相的准备（配制、过滤、超声波脱气）。2.苯、萘、甲苯纯物质保留时间的测定。3.混合物的分析。五、数据及处理1、记录实验条件：色谱柱与固定相流动相与流量进样量2、测量各色谱峰中苯、萘，甲苯等的保留时间tR及相应色谱峰的半峰宽W1/2,计算各对应的理论塔板数n、分离度R等（也可用软件直接操作）六、思考题1.高效液相色谱采用3-10微米的固定相有何优点，同时它有给实验带来什么问题，如何克服？2.若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件？3.高效液相色谱仪由哪几大部分组成？4.预测本实验三种物质的流出顺序。七 、讨论学习1、什么叫做程序升温？什么叫梯度洗脱？2、如何选择最佳的实验条件？3、紫外光度检测器是否适用于所有的有机化合物，为什么？4、何谓反相键合相色谱？何谓正相键合相色谱？ 八、拓展学习1、探讨液相色谱分离分析的特点和应用？试比较气相色谱法与高效液相色谱法的相同点和区别。2、何谓化学键合相色谱？请查阅资料了解C18键合固定相的制备与性能特点。
