《分子标记及其在植物遗传育种中的应用课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子标记及其在植物遗传育种中的应用课件（115页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用遗传标记遗传标记（genetic markergenetic marker）具有多型性具有多型性易于鉴别易于鉴别与目标基因紧密连锁与目标基因紧密连锁 性状标记性状标记 色泽，色泽， 形态形态 细胞学标记细胞学标记 倒位，易位，倒位，易位，G/N/CG/N/C带带 生化标记生化标记 同功酶同功酶 分子标记分子标记 RFLP RFLP、RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP、SNP SNP 基础基础基础基础- -基因表达基因表达基因表达基因表达结果结果结果结果表现型表现型表现型表现型DNADNA碱基碱基碱基碱基序列变异序列变异序列变异序列变异形态标记形态
2、标记n n遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。l l如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。vv特点：直观简单特点：直观简单特点：直观简单特点：直观简单l l从基因型到表现型存在基因表达、调控、
3、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。 细胞学标记细胞学标记n n染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（
4、数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（和带型（和带型（和带型（C C带、带、带、带、N N带、带、带、带、GG带等）。带等）。带等）。带等）。l l随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。可在染色体水平揭示更多遗传变异。vv特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，特点：直观、快速而经济，但变异十分有限
5、，当染色体数目形态相似时难以分辨。当染色体数目形态相似时难以分辨。当染色体数目形态相似时难以分辨。当染色体数目形态相似时难以分辨。生化标记生化标记贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶n n贮藏蛋白贮藏蛋白 同工酶同工酶vv特点：经济、方便、成本较低特点：经济、方便、成本较低vv结构基因表达产物，对非结构基因无能结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。数量有限，有时受发育时期和环境影响。分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本
6、质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1 1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2 2）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3 3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4 4）表表表表现现现现为为为为“ “中中中中性性性性” ”，不不不不影影
7、影影响响响响目目目目标标标标性性性性状状状状的的的的表表表表达达达达，与不良性状无必然的连锁；与不良性状无必然的连锁；与不良性状无必然的连锁；与不良性状无必然的连锁；（5 5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。合基因型，提供完整的信息。合基因型，提供完整的信息。合基因型，提供完整的信息。分子标记的分类（分子标记的分类（Staub等等1996）分分子子标标记记以以Southern为基础如为基础如RFLP以以PCR为基础为基础单引物单引物PCR标记标记 有有
8、RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等等双引物选择性扩增双引物选择性扩增PCR 主要指主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记标记如如SSR、STS等等植物遗传研究中常用的分子标记n nRFLPRestrictionFragmentLengthRFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismPolymorphismn nRAPDRandomAmplifiedPolymorphicRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAsDNAs (DAF,AP-PCR)(DAF,AP-PCR)n nSSRSi
9、mpleSequenceRepeatSSRSimpleSequenceRepeatn nAFLPAmplifiedFragmentLengthAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismPolymorphismRFLPn n原理：原理：原理：原理：DNADNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳电泳电泳转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（
10、如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小n n酶切：酶切：酶切：酶切：3-5ugDNA3-5ugDNA，以以以以1010U U内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切内切酶酶切5 5小时小时小时小时 n n电泳：电泳：电泳：电泳：0.6-0.8%0.6-0.8%琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶琼脂糖胶7070V V电泳电泳电泳电泳1616小时小时小时小时 n n染色：染色：染色：染色：EtBrEtBr染色染色染色染色2020分钟分钟分钟分钟 n n变性：变性：变性：变性：0.250.25MHCl20MH
11、Cl20分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼n n印迹：加入印迹：加入印迹：加入印迹：加入0.4NNaOH0.4NNaOH，进行进行进行进行SouthernSouthern印迹印迹印迹印迹n n冲洗：以冲洗：以冲洗：以冲洗：以2 2SSCSSC冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干冼胶，风干酶切酶切电泳电泳印迹印迹杂交洗脱n n预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、55HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中，中，中， 封好后置封好后置封好后置封好后置65
12、65温温温温箱中振荡箱中振荡箱中振荡箱中振荡5 56 6小时。小时。小时。小时。n n杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的markermarker和和和和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置6565温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。n n洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液6565 振
13、荡洗脱两次（振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（1515min/min/次）次）次）次），吸干包好。吸干包好。吸干包好。吸干包好。放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, ,于暗室于暗室于暗室于暗室中将中将中将中将 X-X-光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上， 再放上另一再放上另一再放上另一再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70-70超低温冰箱中曝光
14、超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光1010天左右。天左右。天左右。天左右。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。RFLP探针n n来源：来源：来源：来源：cDNAcDNAcDNAcDNA探针与基因组探针与基因组探针与基因组探针与基因组DNADNADNADNA（gDNAgDNAgDNAgDNA）探针探针探针探针n ncDNAcDNAcDNAcDNA探探探探针针针针: : : :保保保保守守守守性性性性较较较较强强强强，探探探探针针针针检检检检测测测测的的的的多多多多态态态态性性性性频频频频率率率率较低。较低。较低。较低。n
15、ngDNAgDNAgDNAgDNA探探探探针针针针: : : :检检检检测测测测的的的的多多多多态态态态性性性性频频频频率率率率较较较较高高高高，但但但但不不不不同同同同种种种种属属属属特异性较强。特异性较强。特异性较强。特异性较强。n n玉米玉米玉米玉米RFLPRFLPRFLPRFLP探针：探针：探针：探针：http:/probes.Htmlhttp:/probes.Html探针标记随机引物法n n2525ngng变性变性变性变性DNADNAn n5 5ulul寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸n n2ulBSA2ulBSAn n3ul-3ul-3232PdCTPPdCTPn n2 2
16、ulKlenowulKlenow酶酶酶酶n n加水至加水至加水至加水至5050ulul，3737温箱中标记温箱中标记温箱中标记温箱中标记2 2小时小时小时小时RFLP标记标记特点特点l共显性，可以区别纯合和杂合基因型共显性，可以区别纯合和杂合基因型l稳定、重复性强稳定、重复性强l某些植物中开发探针已遍及整个基因组某些植物中开发探针已遍及整个基因组l缺点：缺点：DNADNA需要量较大，技术复杂；需要量较大，技术复杂； 用于做图较费时，难以分析大量样品用于做图较费时，难以分析大量样品； 在基因组较大、严格自花授粉作物上多在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。态性很低，使遗传
17、图饱和度低。RAPDn n原理：原理：用一个随机引物（用一个随机引物（8-10bp）、）、碱基随碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组增基因组DNA，然后电泳分开扩增片然后电泳分开扩增片段。段。Polymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60 CTaq polymerase binds 3 and extendsG
18、CTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNA is doubled with each cycleRepeat 25-40 timesRAPD的操作的操作PCR反应：反应：DNADNA（20ng/l20ng/l）1l1lPrimerPrimer15ng15ng10Buffer10Buffer2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2l Taq Taq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.15l0.15ldNTPdNTP（25mM25mM）0.2l0.2l加水至加水至加水至加水至2020l l，再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行
19、再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增Step1952分钟分钟Step29515秒秒Step33630秒秒Step47245秒秒Step5GOTOStep246循环循环Step6725分钟分钟PCR扩扩增：增：主要特点 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； DNADNA需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低； 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂技术简便，操作方便、快速，不
20、涉及分子杂技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。交和放射性自显影等技术。交和放射性自显影等技术。交和放射性自显影等技术。 不同物种间引物通用；不同物种间引物通用；不同物种间引物通用；不同物种间引物通用； vv缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。子；实验重复性较差，结果可靠性较低。DAF(DNAamplificat
21、ionfingerprinting)：与与RAPDRAPD不同的是不同的是: :引物浓度更高，引物长度更短（一般引物浓度更高，引物长度更短（一般5 58 8个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比RAPDsRAPDs大得多。大得多。 （Caetano-AnollesCaetano-Anolles等，等，19901990）AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)l引物较长（引物较长（10105050bpbp）；l引物浓度较高；
22、引物浓度较高；l引物长度不定，并且常常来自为其它引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如目的而设计的引物（如M13M13通用测序通用测序引物）。引物）。ISSRl共同优点：共同优点： 在不需要知道所扩增在不需要知道所扩增DNADNA序列情况下，序列情况下，产生产生DNADNA片段的指纹；片段的指纹； 需需DNADNA量少，产生多态性丰富。量少，产生多态性丰富。l缺点：缺点：l l 对反应条件非常敏感，重复性差。对反应条件非常敏感，重复性差。SCARs（Sequenced Characterized Amplified Regions）n n为提高为提高为提高为提高RAPDRAPD标
23、记稳定性，把目标标记稳定性，把目标标记稳定性，把目标标记稳定性，把目标RAPDRAPD片片片片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计段克隆测序，根据片段两末端的序列设计段克隆测序，根据片段两末端的序列设计段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常特定引物（通常特定引物（通常特定引物（通常2424个碱基），再进行个碱基），再进行个碱基），再进行个碱基），再进行PCRPCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。vv具有更高的可重复性具有更高的可重复性具有更高的可重复性具有更高的可重复性vv共显性
24、共显性共显性共显性微卫星标记(SSR)l真核生物基因组普遍存在，呈随机分布真核生物基因组普遍存在，呈随机分布, ,大大约每隔约每隔10-50kb10-50kb就存在一个就存在一个SSR.SSR.l哺乳动物中约为植物的哺乳动物中约为植物的5-65-6倍倍; ;植物中平均植物中平均23.3kb23.3kb有一个有一个SSR;SSR;双子叶植物双子叶植物SSRSSR数量大于数量大于单子叶植物单子叶植物, ,核核DNA SSRDNA SSR数量多于细胞质数量多于细胞质DNA;DNA;l根据核心序列碱基数的不同根据核心序列碱基数的不同, ,可分为单碱基、可分为单碱基、2 2碱基、碱基、3 3碱基、碱基、
25、4 4碱基等多种重复型。碱基等多种重复型。l不同物种其重复序列及重复单位频率不同。不同物种其重复序列及重复单位频率不同。l通过对通过对5454个植物种核个植物种核DNADNA和和2828个植物种细胞器个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)DNA SSR(1-4bp)的搜索的搜索, ,发现：发现：l l(AT)(AT)最丰富最丰富, ,然后依次是然后依次是:(:(A)A)n n、( (T)T)n n、( (AG)AG)n n、( (CT)CT)n n、( (AAT)AAT)n n、( (ATT)ATT)n n、( (AAC)AAC)n n、( (GTT)GTT)n n、( (AGC)AGC)
26、n n、( (GCT)GCT)n n、( (AAG)AAG)n n、(CTT)(CTT)n n、( (AATT)AATT)n n、( (TTAA)TTAA)n n、( (AAAT)AAAT)n n、( (ATTT)ATTT)n n及及及及( (AC)AC)n n、( (GT)GT)n n。l同一类内碱基种类不同的同一类内碱基种类不同的SSR,SSR,丰度差别很大。丰度差别很大。SSR的分布特点的分布特点SSR的功能长期以来一直认为长期以来一直认为长期以来一直认为长期以来一直认为SSRSSRSSRSSR是转录哑区，没有明确的是转录哑区，没有明确的是转录哑区，没有明确的是转录哑区，没有明确的生理功
27、能。但随着研究深入，证明并非如此。生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。SSRSSRSSRSSR的主要功能的主要功能的主要功能的主要功能: : : :编码氨基酸；编码氨基酸；编码氨基酸；编码氨基酸；染色体末端的染色体末端的染色体末端的染色体末端的SSRSSRSSRSSR，有保护，有保护，有保护，有保护DNADNADNADNA完整性、避免降解、完整性、避免降解、完整性、避免降解、完整性、避免降解、融合及丢失的功能；融合及丢失的功能；融合及丢失的功能；融合及丢失的功能；提高或降低临近基因转录速率；提高或降低临近基因转
28、录速率；提高或降低临近基因转录速率；提高或降低临近基因转录速率；基因重组的热点，是基因变异的来源；基因重组的热点，是基因变异的来源；基因重组的热点，是基因变异的来源；基因重组的热点，是基因变异的来源；部分部分部分部分SSRSSRSSRSSR可产生转录启动复合物或活化染色体可产生转录启动复合物或活化染色体可产生转录启动复合物或活化染色体可产生转录启动复合物或活化染色体vv两端序列多是保守的单拷贝序列，可两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，以根据两端序列设计一对特异引物，通过通过PCRPCR将其间微卫星序列扩增出来，将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。
29、利用电泳技术获得长度多态性。vv不同材料重复次数的不同不同材料重复次数的不同，导致了导致了SSRSSR长度的高度变异性。长度的高度变异性。SSR分析分析SSR分子标记的创制分子标记的创制基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建探针制备探针制备探针制备探针制备- -预杂交预杂交预杂交预杂交- -带有带有带有带有SSRSSR克隆的选择克隆的选择克隆的选择克隆的选择测序测序测序测序引物设计引物设计引物设计引物设计检测检测检测检测其它方法其它方法其它方法其它方法:EST-SSR:EST-SSR、相关种间、相关种间、相关种间、相关种间SSR.SSR.Cross-speciesSS
30、RTaxonomicTaxonomicTransferabilityTransferabilityPolymorphismPolymorphismDivergence%(N)%(N)Divergence%(N)%(N)SamesubgenusSamesubgenus89.8(521)89.8(521)78.3(299)78.3(299)SamegenusSamegenus76.4(1800)76.4(1800)86.0(773)86.0(773)SameallianceSamealliance45.4(403)45.4(403)50.4(141)50.4(141)SamefamilySamef
31、amily35.2(1683)35.2(1683)58.4(363)58.4(363)SSR的操作的操作PCRPCR反应：反应：反应：反应：DNADNA（20ng/l20ng/l）4l4lPrimerPrimer（1mM1mM）0.25l0.25l10Buffer10Buffer2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2lTaqTaq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.1l0.1ldNTPdNTP（25mM25mM）0.2l0.2l加水至加水至加水至加水至2020l l混合后，进行混合后，进行混合后，进行混合后，进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增：Step1Step1
32、959522分钟分钟分钟分钟Step2Step295953030秒秒秒秒Step3Step356563030秒秒秒秒Step4Step472726060秒秒秒秒Step5Step5GOTOStep231GOTOStep231循环循环循环循环注：注：注：注：SSRSSR引物退火温度在引物退火温度在引物退火温度在引物退火温度在52-6552-65 不等。不等。不等。不等。SSR的特点：的特点：l l两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；两侧顺序保守，在同种间多相同；l l数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量
33、丰富，在整个基因组均匀随机分布；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；l l实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；实验重复性好，结果可靠；l l多数多数多数多数SSRSSR增减重复序列频率高，在品种间具增减重复序列频率高，在品种间具增减重复序列频率高，在品种间具增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；广泛位点变异；广泛位点变异；广泛位点变异；l l共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；l l仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合仅需微量组织，适合
34、PCRPCR分析半自动化分析半自动化分析半自动化分析半自动化vv相对的物种专一性；相对的物种专一性；相对的物种专一性；相对的物种专一性；vv由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发
35、困难，费用较高，耗时长；开发困难，费用较高，耗时长；开发困难，费用较高，耗时长；开发困难，费用较高，耗时长；vv实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；实际分析时一般每次只分析单个位点；vv不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不同引物退火温度不同，需要探索。不足：不足：SSR的检测的检测uu琼脂糖凝胶检测（同前）琼脂糖凝胶检测（同前）uu聚丙烯酰胺凝胶检测聚丙烯酰胺凝胶检测uu一般采用银染、荧光检测。一般采用银染、荧光检测。银染检测程序银染检测程序脱色脱色脱色脱色：加：加：
36、加：加1 1升升升升10%10%HACHAC液，脱色液，脱色液，脱色液，脱色2020分钟分钟分钟分钟冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板：用重蒸水冲洗胶板2 2次，每次次，每次次，每次次，每次5 5分钟分钟分钟分钟染色染色染色染色：加染色液：加染色液：加染色液：加染色液( (1%AgNO1%AgNO3 3，0.075%0.075%甲醛甲醛甲醛甲醛)30)30分钟分钟分钟分钟冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过：用重蒸水冲洗胶板不超过5 5秒钟；秒钟；秒钟；秒钟；显显显显影影影影：预预预预冷冷冷冷显显显显影影影
37、影液液液液（3030g/LNaCOg/LNaCO3 3，0.075%0.075%甲甲甲甲醛醛醛醛，0.40.4mg/mlNamg/mlNa2 2SOSO3 3），），），），轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；轻摇到带纹出现；定影定影定影定影：在固定：在固定：在固定：在固定/ /停止液并轻摇停止液并轻摇停止液并轻摇停止液并轻摇3-53-5分钟；分钟；分钟；分钟；冲洗冲洗冲洗冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗：用重蒸水冲洗2 2次，每次次，每次次，每次次，每次2 2分钟；分钟；分钟；分钟；干胶干胶干胶干胶：室温下自然干燥过夜。：室温下自然干燥过夜。：室温下自然干燥过夜。：
38、室温下自然干燥过夜。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism)n n原理：原理：n n基于基于RFLP技术和技术和PCR技术的结合技术的结合DNAMseI-MseIMseI-EcoRI EcoRI-EcoRIl lMseI-MseI片段环化，不利小片段扩增；片段环化，不利小片段扩增；l lEcoRI-EcoRI引物的退火温度高；引物的退火温度高；l lMseI-EcoRI片段优先扩增片段优先扩增酶切连接酶切连接接头序列接头序列n nMseMse 接头、接头、接头、接头、PstPst 分别为：分别为：分别为：分别为：n nMseMse：n n 5-G
39、ACGATGAGTCCTGAG-35-GACGATGAGTCCTGAG-3n n3-TACTCAGGACTCAT-53-TACTCAGGACTCAT-5n nPstPst：n n5-CTCGTAGACTGCGTACC-35-CTCGTAGACTGCGTACC-3n n3-CTGACGCATGGTTAA-53-CTGACGCATGGTTAA-5n nEcoEcoR R：n n5-CTCGTAGACTGCGTACC-35-CTCGTAGACTGCGTACC-3n n3-CTGACGCATGGTTAA-53-CTGACGCATGGTTAA-5 M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3M00:
40、5-GATGAGTCCTGAGTAA-3；P00:5-P00:5- GACTGCGTACCAATTC-3;GACTGCGTACCAATTC-3;E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseMseI-primers+3:5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3I-primers+3:5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3EcoEcoRI-primers+3:5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3RI-primers+3:5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3PstPstI-primers+3:5-GACT
41、GCGTACATCGAGNNN-3I-primers+3:5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3AFLP技术的特点（1 1）由由由由于于于于内内内内切切切切酶酶酶酶及及及及选选选选择择择择性性性性碱碱碱碱基基基基组组组组合合合合数数数数和和和和种种种种类类类类很很很很多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。（2 2）多多多多态态态态性性性性远远远远远远远远超超超超过过过过其其其其它它它它分分分分子子子子标标标标记记记记，一一一一般般般般可可可可检检检检测测测测到到到到50-1
42、0050-100个个个个AFLPAFLP扩扩扩扩增增增增产产产产物物物物，能能能能够够够够在在在在遗遗遗遗传传传传关关关关系系系系十十十十分分分分相相相相近近近近的的的的材材材材料料料料产产产产生生生生多多多多态态态态性性性性，被被被被认认认认为为为为是是是是指指指指纹纹纹纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。图谱技术中多态性最丰富的一项技术。图谱技术中多态性最丰富的一项技术。图谱技术中多态性最丰富的一项技术。（3 3）AFLPAFLP分分分分析析析析由由由由于于于于扩扩扩扩增增增增片片片片段段段段较较较较短短短短（30-70030-700bp)bp)，分辨率高。分辨率高。分辨率高。分辨率高。（
43、 4 4） AFLPAFLP分分分分 析析析析 用用用用 样样样样 量量量量 少少少少 （ 0.05-0.50.05-0.5 ggDNADNA），），），），而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。而且对模板浓度的变化不敏感。（5 5）由由由由于于于于特特特特定定定定引引引引物物物物扩扩扩扩增增增增，退退退退火火火火温温温温度度度度高高高高，因因因因而而而而假假假假阳性低，可靠性高。阳性低，可靠性高。阳性低，可靠性高。阳性低，可靠性高。（6 6）引引引引物物物物在在在在不不不不同同同同物物物物种种种种间间间间是是是是通通通通用用用用的的的的，可可可可
44、用用用用于于于于没没没没有有有有任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。任何分子生物学研究基础的物种。（7 7）银银银银染染染染技技技技术术术术具具具具有有有有快快快快速速速速、方方方方便便便便的的的的特特特特点点点点，在在在在1-21-2天内可以得到指纹。天内可以得到指纹。天内可以得到指纹。天内可以得到指纹。AFLPAFLP操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：操作具体包括三个步骤：1.1. 酶切酶切酶切酶切- -连接；连接；连接；连接；2.2.PCRPCR扩增，使目的序列扩增到扩增，使目的序列扩增到扩增，使目的序
45、列扩增到扩增，使目的序列扩增到0.50.51 1gg；3.3. 电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对对对对于于于于基基基基因因因因组组组组较较较较大大大大的的的的物物物物种种种种，需需需需要要要要进进进进行行行行两两两两步步步步扩扩扩扩增增增增预扩增和选择性扩增。预扩增和选择性扩增。预扩增和选择性扩增。预扩增和选择性扩增。AFLP操作步骤：操作步骤：模板DNA的酶切与连接DNADNA（200ng/l200ng/l）2.5l2.5lMseMse3 3单位单位单位单位 PstPst3 3单位单位单位单位M
46、seMse 接头（接头（接头（接头（5050pmol/lpmol/l） 1.0l1.0lPstPst 接头（接头（接头（接头（55pmol/lpmol/l）1.0l1.0l10NEBBuffer10NEBBuffer2.5l2.5l100BSA100BSA0.25l0.25lATPATP（10mM10mM） 2.0l2.0lT T4 4- -连接酶（连接酶（连接酶（连接酶（3 3U/lU/l）0.4l0.4l加水至加水至加水至加水至2525l l，3737酶切酶切酶切酶切- -连接连接连接连接4-64-6小时，或过夜小时，或过夜小时，或过夜小时，或过夜。 AFLP实验程序DNA片段的预扩增取取
47、取取2.02.0l l完成的样品，加入完成的样品，加入完成的样品，加入完成的样品，加入1818l l如下混合液：如下混合液：如下混合液：如下混合液： MseMse 引物（引物（引物（引物（M00M00，50ng/l50ng/l）0.6l0.6l Pst Pst 引物（引物（引物（引物（P00P00，50ng/l50ng/l）0.6l0.6l10PCRBuffer10PCRBuffer2.0l2.0lMgMg2+2+（25mM25mM）1.2l1.2l TaqTaq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l） 0.1l0.1ldNTPdNTP（25mM25mM）0.16l0.16l加加ddHddH2 2
48、OO至至20l混合后，在如下混合后，在如下混合后，在如下混合后，在如下PCRPCR条件下扩增：条件下扩增：条件下扩增：条件下扩增：Step1Step1959522分钟分钟分钟分钟Step2Step295953030秒秒秒秒Step3Step356563030秒秒秒秒Step4Step472726060秒秒秒秒Step5Step5GOTOStep231cyclesGOTOStep231cyclesStep6Step6727255分钟分钟分钟分钟AFLP的选择性扩增的选择性扩增取取取取44l l稀释预扩增液，加入稀释预扩增液，加入稀释预扩增液，加入稀释预扩增液，加入1616l l如下反应液：如下反
49、应液：如下反应液：如下反应液：PstPst引物（引物（引物（引物（5050ng/lng/l） 0.8l0.8lMseMse引物（引物（引物（引物（5050ng/lng/l）0.8l0.8l10PCRBuffer10PCRBuffer2.0l2.0lMgMg2+2+（30mM30mM）1.1l1.1ldNTPdNTP（25mM25mM）0.18l0.18lTaqTaq酶（酶（酶（酶（5 5U/lU/l）0.12l0.12lddHddH2 2OO11.0l11.0l混合后按如下混合后按如下混合后按如下混合后按如下PCRPCR程序扩增：程序扩增：程序扩增：程序扩增：Step1Step1959522分
50、钟分钟分钟分钟Step2Step295953030秒秒秒秒Step3Step365653030秒（秒（秒（秒（-0.7-0.7/ /cyclecycle）Step4Step472726060秒秒秒秒Step5Step5GOTOStep212GOTOStep212循环循环循环循环Step6Step695953030秒秒秒秒Step7Step756563030秒秒秒秒Step8Step872726060秒秒秒秒Step9Step9GOTOStep630cyclesGOTOStep630cyclesStep10Step10727255分钟分钟分钟分钟AFLP的的检测检测银染银染荧光荧光同位素检测同位
51、素检测注意事项注意事项：1 1AFLPAFLP酶酶酶酶切切切切反反反反应应应应对对对对模模模模板板板板DNADNA质质质质量量量量要要要要求求求求较较较较高高高高，要求要求要求要求260/280260/280在在在在1.81.8左右，且不能有降解。左右，且不能有降解。左右，且不能有降解。左右，且不能有降解。2 2AFLPAFLP反反反反应应应应对对对对模模模模板板板板DNADNA浓浓浓浓度度度度不不不不是是是是很很很很敏敏敏敏感感感感，在在在在5050pg-50ngpg-50ng时时时时，均均均均可可可可以以以以观观观观察察察察到到到到多多多多态态态态性性性性带带带带，但但但但为了实验的准确性
52、，为了实验的准确性，为了实验的准确性，为了实验的准确性，DNADNA浓度不能太低。浓度不能太低。浓度不能太低。浓度不能太低。3 3酶酶酶酶切切切切- -连连连连接接接接反反反反应应应应可可可可以以以以分分分分开开开开作作作作，也也也也可可可可以以以以合合合合在在在在一一一一起作，但合在一起更方便些。起作，但合在一起更方便些。起作，但合在一起更方便些。起作，但合在一起更方便些。4 4AFLPAFLP反反反反应应应应对对对对PCRPCR要要要要求求求求较较较较高高高高，要要要要首首首首先先先先摸摸摸摸索索索索优化优化优化优化Mg2+Mg2+、dNTPdNTP条件，达到最佳扩增。条件，达到最佳扩增。
53、条件，达到最佳扩增。条件，达到最佳扩增。5 5EcoEcoR R受受受受甲甲甲甲基基基基化化化化胞胞胞胞嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶的的的的影影影影响响响响较较较较小小小小，而而而而PstPst对对对对富富富富含含含含的的的的甲甲甲甲基基基基化化化化胞胞胞胞嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶十十十十分分分分敏敏敏敏感感感感，因因因因而而而而PstPst- -MseMse检检检检测测测测的的的的多多多多为为为为表表表表达达达达区区区区域域域域，而而而而EcoEcoR R- -MseMse检检检检测测测测位位位位点点点点聚聚聚聚集集集集在在在在甲甲甲甲基基基基化化化化较较较较高高高高的重复序列区域。的重复序列区域。的重复序列区
54、域。的重复序列区域。6 6引引引引物物物物中中中中用用用用作作作作选选选选择择择择性性性性核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸的的的的和和和和含含含含量量量量对对对对扩扩扩扩增增增增出出出出的的的的产产产产物物物物数数数数目目目目有有有有影影影影响响响响。一一一一般般般般而而而而言言言言，和和和和含量越高，扩增出的产物数目越少。含量越高，扩增出的产物数目越少。含量越高，扩增出的产物数目越少。含量越高，扩增出的产物数目越少。77同同同同位位位位素素素素、荧荧荧荧光光光光标标标标记记记记分分分分辨辨辨辨率率率率较较较较高高高高，但但但但价价价价格格格格昂昂昂昂贵贵贵贵，操操操操作作作作不不不不方方方方便便便便
55、；银银银银染染染染方方方方法法法法方方方方便便便便快快快快捷捷捷捷，掌掌掌掌握握握握好各个环节，同样可以达到很好的效果。好各个环节，同样可以达到很好的效果。好各个环节，同样可以达到很好的效果。好各个环节，同样可以达到很好的效果。为什么用双酶解?适合适合PCRPCR扩增效率与变性胶的分辨率扩增效率与变性胶的分辨率减少减少PCRPCR扩增的片段扩增的片段, ,从而减少使用选从而减少使用选择性碱基的数目择性碱基的数目使标记单链成为可能使标记单链成为可能增加增加PCRPCR扩增的灵活性扩增的灵活性增加使用引物的灵活性增加使用引物的灵活性为什么要预扩增?减少选择性碱基的错配减少选择性碱基的错配减轻背景减
56、轻背景提供足量模板提供足量模板DNADNA降低模板浓度的影响降低模板浓度的影响目的：目的：分子标记辅助选择分子标记辅助选择 (MAS)(MAS)筛选筛选BACBAC文库，进行图位克隆（文库，进行图位克隆（map-map-based gene cloningbased gene cloning）AFLP SCARPIC/SimpsonPIC/Simpson遗传多样性系数遗传多样性系数 = 1 - = 1 - P Pi i 2 2等位基因数目等位基因数目 A A A = 4A = 4PIC = 1 PIC = 1 SUM (0.47)SUM (0.47)2 2 + (0.30) + (0.30)2
57、 2 + (0.17) + (0.17)2 2 + (0.04) + (0.04)2 2 = 0.64 = 0.64SSR资料：资料：遗传相似系数遗传相似系数 Gower (1985):Gower (1985): a + da + da + b + c + da + b + c + d简单匹配系数（简单匹配系数（SM）(Simplematchingcoefficient) a a a + b + ca + b + cJaccard相似系数相似系数(Jaccard1908). 2 2a a2a + b + c2a + b + cDice(1945)相似系数相似系数，即即Nei&Li(1979)相
58、似系数相似系数.其中其中:abcd+-+-kj遗传距离的计算：遗传距离的计算：Rogers（1972）Rogers-W（Rogers distance as modified by Wright （1978）两两个个 随随机机群群体体 j 、k间间的的遗遗传传距距离离（Nei 1972）: X Xij 为为X X群体第群体第i i个位点第个位点第j j个等位基因频率个等位基因频率 Yij为为Y群体第群体第i个位点第个位点第j个位点基因频率个位点基因频率 n n在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距离（离（RDRD）和改良的罗杰斯距离）和改良的罗杰斯距离（MRD
59、MRD）（）（RogersRogers，19721972；Goodman & Goodman & StuberStuber，19831983）。）。n n根据遗传特性确定的罗杰斯距离在相关种根据遗传特性确定的罗杰斯距离在相关种质的亲缘关系分析中非常有用；而改良的质的亲缘关系分析中非常有用；而改良的罗杰斯距离还适用于杂种优势研究。罗杰斯距离还适用于杂种优势研究。 聚类分析n n聚类指标：聚类指标：聚类指标：聚类指标：遗传相似系数遗传相似系数遗传相似系数遗传相似系数遗传距离遗传距离遗传距离遗传距离n n聚类方法：聚类方法：聚类方法：聚类方法：SAHNSAHN（SequentialSequentia
60、lAgglomerativeHierarchicalandAgglomerativeHierarchicalandNestedNested）clusteringclustering常用常用常用常用UPGMAUPGMAn n分析软件：分析软件：分析软件：分析软件：NTSYS-pc2.02NTSYS-pc2.02（RholfRholf，19981998）QTL分析分析 单标记作图法；单标记作图法；单标记作图法；单标记作图法； 区间作图法；区间作图法；区间作图法；区间作图法； Mapmaker/QTLMapmaker/QTLMapmaker/QTLMapmaker/QTL http:/www-htt
61、p:/www- 复合区间作图法；复合区间作图法；复合区间作图法；复合区间作图法；CartographerCartographerCartographerCartographer、QTLmapperQTLmapperQTLmapperQTLmapper http:/http:/ http:/http:/l lAHomozygotefortheallelefromAparentl lBHomozygotefortheallelefromBparentl lHHeterozygotecarryingbothalellesAandBl lCEitherBBorABgenotypel lDEitherA
62、AorABgenotypel l-MissingdatafortheindividualatthislocusdatatypeF2intercrossdatatypeF2intercross20512051*locus1BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus1BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus2AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus2AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus3ABBAHHHBHABHABHBBHH-*locus3ABBAHHHBHABHABHBBHH-#Locus3maybemis-scoredinindividual1
63、2!#Locus3maybemis-scoredinindividual12!*locus4ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus4ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus5ABHABHAA-ABHABHAHHHB*locus5ABHABHAA-ABHABHAHHHB*trait16.37.78.06.24.18.86.55.47.38.79.0-*trait16.37.78.06.24.18.86.55.47.38.79.0-6.87.27.17.68.38.17.56.86.87.27.17.68.38.17.56.8EST(ExpressedSequenceTa
64、gs)SNP（singlenucleotidepolymophism）cSSR、cSNPDNA微阵列（微阵列（Microarray）蛋白质组学蛋白质组学n n新型分子标记n nESTEST是长约是长约是长约是长约150-400150-400bpbp的基因表达序列片段，的基因表达序列片段，的基因表达序列片段，的基因表达序列片段，携带着完整基因的某些片段。携带着完整基因的某些片段。携带着完整基因的某些片段。携带着完整基因的某些片段。 n nmRNAmRNA反转录成反转录成反转录成反转录成cDNAcDNA，克隆到质粒或噬菌克隆到质粒或噬菌克隆到质粒或噬菌克隆到质粒或噬菌体载体，构建体载体，构建体载体
65、，构建体载体，构建cDNAcDNA文库，而后大规模随机文库，而后大规模随机文库，而后大规模随机文库，而后大规模随机挑选克隆，对挑选克隆，对挑选克隆，对挑选克隆，对55或或或或33端进行一步法测序，获端进行一步法测序，获端进行一步法测序，获端进行一步法测序，获得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程认识的技术。认识的技术。认识的技术。认识的技术。EST(Expressed Sequence Tags)DNA Databanksn ncDNAresourcescDNAresourcesn
66、 nGenbank(NCBI),NucleotideSequenceGenbank(NCBI),NucleotideSequenceDatabase(EMBL),DDBJ,MGC,Database(EMBL),DDBJ,MGC,n nGenomicDNAresourcesGenomicDNAresourcesn nHTG,dbGSS,GOLD,ERGO,HTG,dbGSS,GOLD,ERGO,n nESTresourcesESTresourcesn ndbEST,UniGene,GIs,STACKS,DOTS,dbEST,UniGene,GIs,STACKS,DOTS,n nOthersOth
67、ersn ndbSTS,UniSTS,dbSNP,TransFac,ISIS,dbSTS,UniSTS,dbSNP,TransFac,ISIS,Repbase,.Repbase,.常用基因组网址：拟南芥拟南芥拟南芥拟南芥:The:TheArabidopsisInformationArabidopsisInformationResource(TAIR)Resource(TAIR) 水稻：水稻：水稻：水稻：RiceGeneRiceGene hhttp:/ttp:/ /大豆：大豆：大豆：大豆：SoyBaseSoyBase玉米：玉米：玉米：玉米：MaizeDBMaizeDB, ,MaizeGDBMai
68、zeGDBhttp:/http:/ /小麦：小麦：小麦：小麦：GrainGeneGrainGenehttp:/http:/ /棉花棉花棉花棉花: :CottonDBCottonDBn n苜菽：苜菽：AlfagenesAlfagenes http:/http:/naaic.orgnaaic.org/ /n n大麦：大麦：大麦：大麦：BarleyDBBarleyDB - - http:/http:/ n油菜：油菜：油菜：油菜：BrassicaDBBrassicaDB Http:/Http:/ n高梁：高梁：SorghumDbSorghumDb http:/ http:/单核苷酸多态单核苷酸多态（S
69、NP -single nucleotide polymophism）n nSNPSNP是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，即基因中的点突变。特点：多态，即基因中的点突变。特点：多态，即基因中的点突变。特点：多态，即基因中的点突变。特点：双等位基因双等位基因双等位基因双等位基因在基因组中的发生频率比较高在基因组中的发生频率比较高在基因组中的发生频率比较高在基因组中的发生频率比较高有些有些有些有些SNPSNP位点还影响基因的功能位点还影响基因的功能位点还影响基因的功能位点还影响基因的功
70、能 n nSNPsSNPs可大大丰富既有的连锁图可大大丰富既有的连锁图可大大丰富既有的连锁图可大大丰富既有的连锁图n n成熟自动化技术，有望分析成千上万的成熟自动化技术，有望分析成千上万的成熟自动化技术，有望分析成千上万的成熟自动化技术，有望分析成千上万的SNPsSNPs cSSR、cSNP从从EST中开发中开发SSR、SNPn n目前某些植物全序列的测定及目前某些植物全序列的测定及目前某些植物全序列的测定及目前某些植物全序列的测定及ESTEST数据库的开数据库的开数据库的开数据库的开发，为发，为发，为发，为SSRSSR、SNPSNP的开发开辟了的开发开辟了的开发开辟了的开发开辟了新的途径新的
71、途径新的途径新的途径。n n优点：优点：优点：优点：vv表达序列，与特定功能有联系表达序列，与特定功能有联系表达序列，与特定功能有联系表达序列，与特定功能有联系vv多态性丰富，可大大丰富标记数目多态性丰富，可大大丰富标记数目多态性丰富，可大大丰富标记数目多态性丰富，可大大丰富标记数目vv开发简单、经济开发简单、经济开发简单、经济开发简单、经济 利用利用利用利用DNADNA芯片技术，将大量探针固定于玻芯片技术，将大量探针固定于玻芯片技术，将大量探针固定于玻芯片技术，将大量探针固定于玻/ /硅硅硅硅片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，片上，然后用荧光
72、标记样品进行大量分子杂交，片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，分析基因表达模式。变基因，分析基因表达模式。变基因，分析基因表达模式。变基因，分析基因表达模式。优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量交技术复杂、自动
73、化程度低、检测目的分子数量交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足少、低通量等不足少、低通量等不足少、低通量等不足DNA微阵列（微阵列（Microarray）微型化高通量高通量提高信息量提高信息量平行化平行化提高信息的可比性提高信息的可比性微量化微量化降低待检样品用量降低待检样品用量自动化自动化提高工作效率提高工作效率低成本低成本可迅速普及推广可迅速普及推广生物芯片的特征与优点生物芯片的特征与优点蛋白质组学为基础的分子标记蛋白质组学为基础的分子标记n n蛋白质是基因表达的产物蛋白质是基因表达的产物, ,是基因功能的是基因功能的执行体，决定了生物的生长、发育、繁执行体，决定了生
74、物的生长、发育、繁殖等各种性状。殖等各种性状。n n蛋白质组研究蛋白质组研究-了解生物体蛋白质表达了解生物体蛋白质表达的时空分布规律的时空分布规律, , 不同个体不同个体/ /组织间的表组织间的表达差异达差异n n蛋白质分子标记蛋白质分子标记-定位生物的表性变异定位生物的表性变异( (如抗病、抗逆等性状如抗病、抗逆等性状) )和相关基因和相关基因Thekeytechniqueinvolvesinproteomics1.Massspectrometry2.Two-dimensionalgelelectrophoresis3.Yeasttwo-hybridsystem分子标记技术在植物遗传研究中的
75、应用n n利利用用遗遗传传图图和和遗遗传传标标记记可可用用来来加加速速植植物物育育种进程。种进程。n n经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。现标记少，图距大，饱和度低。n n分子标记技术的发展，使图谱上标记的密分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。度越来越高。植物基因组遗传作图构建遗传图谱构建遗传图谱 （molecular marker linkage molecular marker linkage mapmap）以具有遗传多型性的分子标记为以具有
76、遗传多型性的分子标记为“路标路标”Polymorphicmolecularmarkeras“routesign”以减数分裂中发生的遗传重组交换值为图距以减数分裂中发生的遗传重组交换值为图距Recombinationfrequency(%)inmeiosisas“mapdistance(cM)”绘制高密度的分子标记连锁图绘制高密度的分子标记连锁图GeneticlinkagemapwithhighdensityQTL作图所需的数据作图所需的数据遗传标记数据遗传标记数据数量性状数据数量性状数据 分子标记连锁图谱的构建分子标记连锁图谱的构建 定位群体亲本间多态性分子标记的筛选定位群体亲本间多态性分子标
77、记的筛选 定位群体的组建定位群体的组建 定位群体分子标记分析定位群体分子标记分析 分子标记连锁图谱的绘制分子标记连锁图谱的绘制利用利用3 3个分离群体，一个人，三个月时个分离群体，一个人，三个月时间，能完成包括间，能完成包括10321032个个AFLPAFLP标记的遗标记的遗传连锁图谱（传连锁图谱（ FayeFaye等等19951995） 。AFLPAFLP不仅能缩小抗病基因与连锁标记不仅能缩小抗病基因与连锁标记之间的距离，而且在之间的距离，而且在RFLPRFLP遗传图上，遗传图上，可增加染色体末端标记和填充可增加染色体末端标记和填充RFLPRFLP空空隙，不干扰隙，不干扰RFLPRFLP标记
78、簇，从而大大增标记簇，从而大大增加了遗传图的饱和度。加了遗传图的饱和度。在植物遗传多样性研究上的应用n n对对对对植植植植物物物物种种种种质质质质资资资资源源源源遗遗遗遗传传传传多多多多样样样样性性性性的的的的全全全全面面面面了了了了解解解解，对对对对于于于于拓拓拓拓宽宽宽宽遗传基础的育种策略十分重要。遗传基础的育种策略十分重要。遗传基础的育种策略十分重要。遗传基础的育种策略十分重要。eg.eg.eg.eg.贾贾贾贾继继继继增增增增等等等等（1997199719971997）利利利利用用用用21212121条条条条染染染染色色色色体体体体上上上上473473473473个个个个RFLPRFLP
79、RFLPRFLP探探探探针针针针对对对对小小小小麦麦麦麦遗遗遗遗传传传传多多多多样样样样性性性性分分分分析析析析发发发发现现现现，小小小小麦麦麦麦不不不不同同同同位位位位点点点点、不不不不同同同同染染染染色色色色体体体体上上上上的的的的遗遗遗遗传传传传多多多多样样样样性性性性各各各各不不不不相相相相同同同同，普普普普通通通通小小小小麦麦麦麦B B B B基基基基因因因因组组组组遗遗遗遗传传传传多多多多样样样样性性性性较较较较高高高高，其其其其中中中中尤尤尤尤以以以以2 2 2 2B B B B、6B6B6B6B、7B7B7B7B更更更更高高高高，而而而而D D D D组组组组的的的的遗遗遗遗传
80、传传传多多多多样样样样性性性性最最最最差差差差。对对对对在在在在小小小小麦麦麦麦育育育育种种种种中中中中引引引引进进进进新的遗传变异具有一定的意义。新的遗传变异具有一定的意义。新的遗传变异具有一定的意义。新的遗传变异具有一定的意义。n n eg. eg. 通通过过288288个个位位点点上上对对338338个个一一粒粒小小麦麦系系群群AFLPAFLP指指纹纹分分析析，结结合合种种系系分分析析，发发现现来来源源于于土土耳耳其其东东南南部部Karacadag山山脉脉的的一一个个野野生生一一粒粒小小麦麦（T. boeoticum）群群体体与与栽栽培培一一粒粒小小麦麦（T. monococcum ）遗
81、遗传传上上最最为为相相近近，从从而而推推断断该该地地区区为为现现代代栽栽培培一一粒粒小小麦麦的发源地（的发源地（Heun等等1998）。植物起源、分类和进化研究植物起源、分类和进化研究品种的DNA指纹图谱 定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：特点：特点：特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性的多态性的多态性的多态性。用途：鉴定品种真实性和纯
82、度，用于新品种登记用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中和品种知识产权保护等。其中和品种知识产权保护等。其中和品种知识产权保护等。其中AFLPAFLPAFLPAFLP被推荐为指纹被推荐为指纹被推荐为指纹被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。图谱绘制的最佳方法之一。图谱绘制的最佳方法之一。图谱绘制的最佳方法之一。n negegegeg. Law. Law. Law. Law等（等（等（等（1998199819981998）利用）利用）利用）利用6 6 6 6个个个个AFLPAFLPAF
83、LPAFLP引物组合产生引物组合产生引物组合产生引物组合产生90909090多条多态性条带，建立了英国多条多态性条带，建立了英国多条多态性条带，建立了英国多条多态性条带，建立了英国1934-19941934-19941934-19941934-1994广泛种植广泛种植广泛种植广泛种植的的的的55555555份小麦的指纹图谱。份小麦的指纹图谱。份小麦的指纹图谱。份小麦的指纹图谱。 基因定位质量性状的基因定位 近等基因系（近等基因系（近等基因系（近等基因系（Near Near Near Near IsogenicIsogenicIsogenicIsogenic Lines, Lines, Line
84、s, Lines, NILsNILsNILsNILs）NILsNILsNILsNILs几几几几乎乎乎乎仅仅仅仅在在在在目目目目标标标标性性性性状状状状上上上上存存存存有有有有差差差差异异异异，一一一一般般般般凡凡凡凡是是是是能能能能在在在在近近近近等等等等基基基基因因因因系系系系间间间间揭揭揭揭示示示示多多多多态态态态性性性性的的的的分分分分子子子子标标标标记记记记，就就就就极极极极可可可可能位于目标基因的两翼附近。能位于目标基因的两翼附近。能位于目标基因的两翼附近。能位于目标基因的两翼附近。利利利利用用用用NILsNILsNILsNILs方方方方法法法法已已已已定定定定位位位位了了了了许许许
85、许多多多多质质质质量量量量性性性性状状状状基基基基因因因因，egegegeg. . . .番番番番茄茄茄茄抗抗抗抗病病病病毒毒毒毒基基基基因因因因Tm-2aTm-2aTm-2aTm-2a，番番番番茄茄茄茄抗抗抗抗细细细细菌菌菌菌病病病病毒毒毒毒基基基基因因因因及及及及水稻半矮杆基因水稻半矮杆基因水稻半矮杆基因水稻半矮杆基因SdySdySdySdy等。等。等。等。原原原原理理理理：将将将将分分分分离离离离群群群群体体体体(F2(F2(F2(F2、BCBCBCBC、DHDHDHDH）中中中中的的的的个个个个体体体体依依依依据据据据目目目目标标标标性性性性状状状状( ( ( (如如如如抗抗抗抗病病病
86、病、感感感感病病病病) ) ) )分分分分成成成成两两两两组组组组，在在在在每每每每一一一一组组组组中中中中将将将将若若若若干干干干个个个个体体体体DNADNADNADNA等等等等量量量量混混混混合合合合，形形形形成成成成两两两两个个个个DNADNADNADNA混混混混合合合合池池池池( ( ( (如如如如抗抗抗抗病病病病池池池池和和和和感感感感病病病病池池池池) ) ) )。由由由由于于于于分分分分组组组组时时时时仅仅仅仅对对对对目目目目标标标标性性性性状状状状进进进进行行行行选选选选择择择择，因因因因此此此此两两两两个个个个池池池池之之之之间间间间理理理理论论论论上上上上就就就就应应应应主
87、主主主要要要要在在在在目目目目标标标标基基基基因因因因区区区区段段段段存存存存有差异，也称近等基因池法。有差异，也称近等基因池法。有差异，也称近等基因池法。有差异，也称近等基因池法。优优优优点点点点：克克克克服服服服了了了了许许许许多多多多作作作作物物物物没没没没有有有有或或或或难难难难以以以以创创创创造造造造相相相相应应应应NILsNILsNILsNILs的的的的限制限制限制限制( ( ( (MichelmoreMichelmoreMichelmoreMichelmore等等等等1991)1991)1991)1991)。n n定定定定位位位位基基基基因因因因：莴莴莴莴苣苣苣苣抗抗抗抗霜霜霜霜
88、霉霉霉霉病病病病基基基基因因因因、水水水水稻稻稻稻抗抗抗抗瘿瘿瘿瘿蠓蠓蠓蠓基基基基因因因因水水水水稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等分离群体分组分析法分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)产产产产量量量量、品品品品质质质质、熟熟熟熟期期期期等等等等大大大大多多多多数数数数重重重重要要要要农农农农艺艺艺艺性性性性状状状状，均均均均表表表表现现现现数数数数 量量量量 性性性性 状状状状 的的的的 遗遗遗遗 传传传传 特特特特 点
89、点点点 ， 受受受受 许许许许 多多多多 数数数数 量量量量 基基基基 因因因因 座座座座 位位位位（QuantitativeQuantitativeTraitTraitLoci,Loci,QTLsQTLs）和和和和环环环环境境境境因因因因子子子子的的的的共同作用。共同作用。共同作用。共同作用。数数数数量量量量遗遗遗遗传传传传学学学学无无无无法法法法确确确确定定定定控控控控制制制制数数数数量量量量性性性性状状状状的的的的QTLsQTLs数数数数目目目目，也无法确定单个也无法确定单个也无法确定单个也无法确定单个QTLQTL的遗传效应及染色体位置。的遗传效应及染色体位置。的遗传效应及染色体位置。的
90、遗传效应及染色体位置。分分分分子子子子连连连连锁锁锁锁图图图图谱谱谱谱的的的的发发发发展展展展，可可可可以以以以实实实实现现现现对对对对单单单单个个个个QTLQTL遗遗遗遗传传传传效效效效应应应应的的的的追追追追踪踪踪踪，从从从从而而而而应应应应用用用用于于于于分分分分子子子子标标标标记记记记辅辅辅辅助助助助选选选选择择择择。目目目目前前前前已已已已发展了发展了发展了发展了QTLsQTLs定位定位定位定位的多种方法。的多种方法。的多种方法。的多种方法。数量性状基因的定位数量性状基因的定位基于图谱的基因克隆 谁最先了解基因的功能，谁就拥有了该基谁最先了解基因的功能，谁就拥有了该基因的知识产权，也
91、就获得了更多的利润。因的知识产权，也就获得了更多的利润。克隆基因途径克隆基因途径正向遗传学和反向遗传正向遗传学和反向遗传学。学。 前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型的突变进行；物或某种表型的突变进行；物或某种表型的突变进行；物或某种表型的突变进行； 后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行。在基因组中
92、的特定位置进行。在基因组中的特定位置进行。在基因组中的特定位置进行。图位克隆条件：条件：n n(1)(1)目标基因附近紧密连锁的目标基因附近紧密连锁的DNADNA标记；标记；n n(2)(2)知道这些标记与目的基因的位置知道这些标记与目的基因的位置n n一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。从而进行定位克隆。比较基因组研究n n利利用用相相同同的的DNADNA分分子子标标记记（主主要要是是cDNAcDNA标标记记和和基基因因克克隆隆）在在相相关关物物种种之之间间进进行行遗遗传
93、传或或物物理理作作图图，比比较较这这些些标标记记在在不不同同物物种种基基因因组组中中的的分分布布特特点点，揭揭示示染染色色体体或或染染色色体体片片段段上上的的基基因因及及其其排排列列顺顺序序的的相相同同或或相相似似性性，并并由由此此对对相相关关物物种种的的基基因因组组结结构构和和起起源进化进行分析。源进化进行分析。新新新新发发发发现现现现：不不不不同同同同物物物物种种种种之之之之间间间间在在在在标标标标记记记记探探探探针针针针的的的的同同同同源源源源性性性性、拷拷拷拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。贝数及连
94、锁顺序上都具有很大程度的保守性。 egegegeg 番番番番茄茄茄茄、马马马马铃铃铃铃薯薯薯薯和和和和辣辣辣辣椒椒椒椒（TanksleyTanksleyTanksleyTanksley等等等等1988198819881988；1992199219921992）；）；）；）； 水稻、小麦和玉米（水稻、小麦和玉米（水稻、小麦和玉米（水稻、小麦和玉米（AhnAhnAhnAhn等，等，等，等，1993199319931993；1994199419941994）；）；）；）； 小麦、大麦和黑麦（小麦、大麦和黑麦（小麦、大麦和黑麦（小麦、大麦和黑麦（DevosDevosDevosDevos等，等，等，等，
95、1993199319931993）；）；）；）； 高粱和玉米（高粱和玉米（高粱和玉米（高粱和玉米（PereiraPereiraPereiraPereira等，等，等，等，1994199419941994）；）；）；）； 以及大麦和水稻（以及大麦和水稻（以及大麦和水稻（以及大麦和水稻（MaroofMaroofMaroofMaroof等，等，等，等，1996199619961996） n n比较基因组学研究表明，不同物种之间比较基因组学研究表明，不同物种之间在标记探针的同源性，拷贝数及连锁顺在标记探针的同源性，拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。序上都具有很大程度的保守性。n n启示：模式植
96、物上遗传作图成果可推而启示：模式植物上遗传作图成果可推而广之。广之。可借助比较基因组共享分子标记，可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。标基因很近分子标记的的可能性。应用比较基因组学进行基因的克隆n n绿色革命绿色革命Rht1、Rht2基因的克隆基因的克隆拟南芥拟南芥GAI 水稻水稻ESTEST筛选小麦筛选小麦BAC文库文库 Rht1、Rht2Blast探针标记探针标记深远意义深远意义n n比比较较基基因因组组研研究究已已使使得得传传统统
97、的的植植物物遗遗传传学学突突破破了了物物种种的的框框架架限限定定，发发展展成成了了新新的系统遗传学。的系统遗传学。n n随随着着最最近近一一些些生生物物的的基基因因组组全全序序列列的的获获得得，比比较较基基因因组组研研究究也也随随之之步步入入了了一一个个新的时代。新的时代。研究基因表达与调控传传 统统 方方 法法 是是 利利 用用 cDNA文文 库库 筛筛 选选 和和Northern杂交。杂交。AFLP研研究究基基因因表表达达是是非非常常有有效效的的方方法法，可可同同时时比比较较植植物物发发育育的的不不同同时时期期以以及及分分离某些重要基因（离某些重要基因（cDNA-AFLP）。）。n n利利
98、用用cDNA-AFLPcDNA-AFLP的的方方法法，阐阐明明了了马马铃铃薯薯块块茎茎在在不不同同发发育育阶阶段段基基因因表表达达的的情情况况，并并克克隆隆了了2 2个个与与块块茎茎脂脂肪肪氧氧合合酶酶高高度度同同源源的的cDNAcDNA片片段段（BachemBachem等等19961996） 。在植物育种上的应用n n在在杂杂交交育育种种中中，单单单单根根据据育育种种材材料料的的表表型型特特点点选选配配亲亲本本，往往往往会会受受到到环环境境条条件件的干扰。的干扰。n n辅辅之之以以DNADNA分分子子标标记记的的差差异异性性分分析析，将将使使得得亲亲本本选选配配更更为为快快速速、准准确确，从
99、从而而提提高育种效率。高育种效率。揭示育种材料之间的亲缘关系揭示育种材料之间的亲缘关系n n杂杂种种优优势势利利用用正正成成为为许许多多作作物物提提高高产产量量和改善品质的重要途径。和改善品质的重要途径。n n对遗传差异与杂种优势关系的评价方法对遗传差异与杂种优势关系的评价方法经历了从形态性状遗传距离，到生化标经历了从形态性状遗传距离，到生化标记遗传差异，亲缘系数，以及分子标记记遗传差异，亲缘系数，以及分子标记遗传差异等各种尝试。遗传差异等各种尝试。杂种优势预测及机理研究杂种优势预测及机理研究n n DNADNA分子标记的应用，使得能够在整个分子标记的应用，使得能够在整个基因组范围内对大量亲本
100、材料间的遗传基因组范围内对大量亲本材料间的遗传距离进行估测，并在此基础上有效地预距离进行估测，并在此基础上有效地预测具有强优势的组合（测具有强优势的组合（SmithSmith等，等，19921992；BernardoBernardo，19941994）。）。n n结果：既有相关性很高的报道，又有完结果：既有相关性很高的报道，又有完全相反的结果。全相反的结果。 张启发认为张启发认为： 分子标记杂合度与杂种优势的相关性因遗分子标记杂合度与杂种优势的相关性因遗传材料而异，在经过改良的优良种质中，传材料而异，在经过改良的优良种质中，两者之间高度相关，而在一些未经改良的两者之间高度相关，而在一些未经改良
101、的优良种质中，相关程度很低。优良种质中，相关程度很低。 提出了提出了“上位性是杂种优势的主要遗传基上位性是杂种优势的主要遗传基础础”的重要观点。的重要观点。n n应用应用cDNAcDNAAFLPAFLP技术进行杂种优势机技术进行杂种优势机理的研究表明，强优势与弱优势组合理的研究表明，强优势与弱优势组合间基因表达有明显差异，有增强型、间基因表达有明显差异，有增强型、减弱型和沉默型。减弱型和沉默型。n n杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉默有密切关系。默有密切关系。l l大量研究表明，虽然分子标记揭示的遗大量研究表明，虽然分子标记揭示的遗传距离与杂种优势的关系比较复杂
102、，但传距离与杂种优势的关系比较复杂，但亲本之间的遗传差异是产生的主要原因。亲本之间的遗传差异是产生的主要原因。l l通过对与杂种优势相关通过对与杂种优势相关QTLs效应的研究，效应的研究，可以加深对杂种优势机理的了解。可以加深对杂种优势机理的了解。我国玉米种质基础我国玉米种质基础亚群亚群类群类群 标准测验种标准测验种四平头四平头Dom黄早四黄早四旅大红骨旅大红骨丹丹340BSSSAB73PA掖掖478LancasterBMo17PB齐齐319分子标记辅助选择（MAS,marker assisted selection) n n分分分分子子子子标标标标记记记记辅辅辅辅助助助助选选选选择择择择几几
103、几几乎乎乎乎不不不不受受受受环环环环境境境境条条条条件件件件的的的的影影影影响响响响，还还还还可可可可以以以以跟跟跟跟踪踪踪踪外外外外源源源源基基基基因因因因，克克克克服服服服回回回回交交交交的的的的缺缺缺缺点点点点，可可可可大大提高选择的效率。大大提高选择的效率。大大提高选择的效率。大大提高选择的效率。n n长长长长期期期期以以以以来来来来，选选选选择择择择都都都都是是是是基基基基于于于于植植植植株株株株的的的的表表表表型型型型性性性性状状状状进进进进行行行行的的的的。植植植植物物物物的的的的许许许许多多多多性性性性状状状状为为为为数数数数量量量量性性性性状状状状，受受受受许许许许多多多多微
104、效基因的控制，且易受环境的影响。微效基因的控制，且易受环境的影响。微效基因的控制，且易受环境的影响。微效基因的控制，且易受环境的影响。快速有效地选择出带有目标基因的单株n n表现在表现在: :n n1.1.不受环境条件及生长发育阶段的影响，不受环境条件及生长发育阶段的影响，在苗期或低世代就可进行筛选在苗期或低世代就可进行筛选; ;n n2.2.利用共显性标记可直接对隐性目标基因利用共显性标记可直接对隐性目标基因进行选择，无需测交或自交检验进行选择，无需测交或自交检验; ;n n3.3.如果目标性状不能在当代进行选择，采如果目标性状不能在当代进行选择，采用用MASMAS可直接在当代确定。可直接在
105、当代确定。快速选出以轮回亲本为遗传背景的单株n n在回交育种中不仅要考虑优良性状的导在回交育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑保持其整个基因组的遗入，还必须考虑保持其整个基因组的遗传背景基本不变。传背景基本不变。n n通过通过MASMAS技术，借助于饱和的分子标记技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。标性状而且遗传背景良好的理想个体。n n当当回回交交转转移移性性状状由由隐隐性性基基因因控控制制时时，需需在在选选择择前前先先自自交交
106、一一代代使使其其纯纯合合化化；而而且且当当选选择择的的是是如如抗抗病病这这样样的的性性状状时时，还还要要借借助助于于繁琐的接种鉴定等。繁琐的接种鉴定等。 贾贾继继增增等等（20012001）根根据据AFLPAFLP标标记记进进行行小小麦麦白白粉粉病病抗抗性性的的回回交交选选择择，对对小小麦麦的的外外源源染染色色质质及及基基因因可可以以进进行行准准确确的的跟跟踪踪鉴鉴定定，从从而加速种质创新的进程。而加速种质创新的进程。n n计算机模拟表明：计算机模拟表明：如果从每个回交世代含有目标基因的如果从每个回交世代含有目标基因的3030个个的单株中，通过的单株中，通过MASMAS选出选出1 1株带有轮回
107、亲株带有轮回亲本基因组比率最高的个体作为下一次回本基因组比率最高的个体作为下一次回交的亲本，则完全恢复到轮回亲本基因交的亲本，则完全恢复到轮回亲本基因组的基因型只需组的基因型只需3 3代。在传统育种方法中，代。在传统育种方法中，要达到要达到99%99%轮回亲本比率则需轮回亲本比率则需6.56.5代代（TanksleyTanksley等等19981998）。）。有效选择目标基因附近发生重组的个体n n回交育种中回交育种中, , 传统解决连锁累赘方式是通传统解决连锁累赘方式是通过扩大选择群体或增加回交次数。但研究过扩大选择群体或增加回交次数。但研究表明，即使回交表明，即使回交2020代，还能发现相
108、当大与代，还能发现相当大与目标基因连锁的供体染色体片段。目标基因连锁的供体染色体片段。n nTanksleyTanksley研究表明，用位于目标基因两侧研究表明，用位于目标基因两侧1cM1cM的两个分子标记进行辅助选择，通过的两个分子标记进行辅助选择，通过两个世代就可获得含目标基因长度不大于两个世代就可获得含目标基因长度不大于2cM2cM的个体，如果采用传统的育种方式则的个体，如果采用传统的育种方式则需要需要100100代。代。n n通过对通过对Opaque-2基因中开发的基因中开发的SSR引物，以及与引物，以及与Opaque-2共分离的共分离的RFLP标记，我们正在进行标记，我们正在进行QP
109、M分子分子标记辅助育种。标记辅助育种。基因聚合将多个有利基因通过选育途径聚合到一将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种之中个品种之中, ,这些基因可以控制相同的这些基因可以控制相同的性状也可以控制不同的性状。性状也可以控制不同的性状。基因聚合突破了回交育种改良个别性状基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限的局限, ,使品种在多个性状上同时得到使品种在多个性状上同时得到改良。改良。数量性状遗传改良由于数量性状遗传的复杂性，存在以下问题由于数量性状遗传的复杂性，存在以下问题由于数量性状遗传的复杂性，存在以下问题由于数量性状遗传的复杂性，存在以下问题: : : :1)QTL1)QTL1)QTL1
110、)QTL与环境之间的互作降低了对数量性状基因与环境之间的互作降低了对数量性状基因与环境之间的互作降低了对数量性状基因与环境之间的互作降低了对数量性状基因定位的准确性定位的准确性定位的准确性定位的准确性; ; ; ;2)2)2)2)由于单个由于单个由于单个由于单个QTLQTLQTLQTL呈微效作用呈微效作用呈微效作用呈微效作用, , , ,所以必须同时操作多所以必须同时操作多所以必须同时操作多所以必须同时操作多个个个个QTLQTLQTLQTL才能使性状发生显著变化才能使性状发生显著变化才能使性状发生显著变化才能使性状发生显著变化; ; ; ;3)QTL3)QTL3)QTL3)QTL之间存在互作关
111、系之间存在互作关系之间存在互作关系之间存在互作关系, , , ,使得对使得对使得对使得对QTLQTLQTLQTL的效应估计的效应估计的效应估计的效应估计发生偏差发生偏差发生偏差发生偏差; ; ; ;4)4)4)4)在对在对在对在对QTLQTLQTLQTL进行转移时进行转移时进行转移时进行转移时, , , ,如果没有转移互作如果没有转移互作如果没有转移互作如果没有转移互作QTL,QTL,QTL,QTL,则则则则不会达到预期的结果。不会达到预期的结果。不会达到预期的结果。不会达到预期的结果。n nKhanKhanKhanKhan等等等等（2000200020002000）以以以以AFLPAFLPA
112、FLPAFLP等等等等分分分分子子子子标标标标记记记记辅辅辅辅助助助助选选选选择择择择，将将将将二二二二粒粒粒粒小小小小麦麦麦麦6BS6BS6BS6BS的的的的高高高高谷谷谷谷蛋蛋蛋蛋白白白白QTLQTLQTLQTL成成成成功功功功地地地地转转转转入入入入普普普普通通通通小麦品种小麦品种小麦品种小麦品种GluproGluproGluproGlupro。n nStuberStuberStuberStuber（ 1995199519951995） 把把把把 产产产产 量量量量 有有有有 关关关关 的的的的 QTLsQTLsQTLsQTLs分分分分 别别别别 从从从从Tx303Tx303Tx303T
113、x303和和和和oh43oh43oh43oh43转转转转移移移移到到到到B73B73B73B73和和和和Mo17Mo17Mo17Mo17两两两两个个个个玉玉玉玉米米米米自自自自交交交交系系系系中中中中，由由由由这这这这两两两两个个个个改改改改良良良良的的的的自自自自交交交交系系系系组组组组配配配配杂杂杂杂交交交交种种种种，产产产产量量量量比对照杂交种增产比对照杂交种增产比对照杂交种增产比对照杂交种增产15%15%15%15%以上。以上。以上。以上。n nXiaoXiaoXiaoXiao等等等等(1996)(1996)(1996)(1996)利利利利用用用用分分分分子子子子标标标标记记记记从从从从普普普普通通通通野野野野生生生生稻稻稻稻中中中中鉴鉴鉴鉴别出别出别出别出2 2 2 2个增产的个增产的个增产的个增产的QTL,QTL,QTL,QTL,并转移到栽培稻中。并转移到栽培稻中。并转移到栽培稻中。并转移到栽培稻中。n n成功的报道成功的报道
