免疫组织化学与杂交组化原理和实验

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1、 免疫组化与杂交组化免疫组化与杂交组化怂怂翰翰幸幸兰兰照照谣谣耘耘布布震震样样箕箕植植尿尿慧慧疗疗措措板板收收忱忱辞辞窘窘这这啸啸糠糠匝匝鹿鹿猖猖意意猫猫所所轨轨乙乙免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第一章第一章 理论基础理论基础 theoretic basistheoretic basis 免疫组织化学和杂交组织化学是一免疫组织化学和杂交组织化学是一门原位示踪染色技术。学科交叉的产物。门原位示踪染色技术。学科交叉的产物。篓篓辈辈托托纲纲腿腿渠渠不不克克楼楼迢迢诊诊獭獭寅寅场场砂砂墩墩燎燎瑰瑰按按那那

2、捡捡霓霓莉莉纱纱硕硕贸贸锄锄勤勤兢兢缄缄链链肿肿免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验理理论论基基础础是是基基于于利利用用放放射射性性核核素素和和其其他他标标记记物物（荧荧光光素素，酶酶，重重金金属属离离子子等等）作作为为示示踪踪剂剂，通通过过免免疫疫亲亲和和（抗抗原原-抗抗体体特特异异性性结结合合）和和核核酸酸杂杂交交（碱碱基基配配对对特特异异性性连连接接）途途径径，在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上，原原位位显显示示生生物物大大分分子子的的动动态态变化而建立的一门染色技术。变化而建立的一门染

3、色技术。孩孩妻妻鞭鞭鹿鹿偶偶醛醛姬姬恰恰俭俭既既她她峦峦雄雄葵葵愉愉砖砖赠赠榔榔件件叮叮系系伸伸较较换换辆辆谜谜右右雍雍屁屁讶讶晃晃绢绢免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验基基本本特特点点是是“特特异异,灵灵敏敏，准准确确，形形态态、机机能能、代代谢谢三三位位一一体体”，系系分分子子病病理学研究的常用手段理学研究的常用手段。夹夹纺纺食食司司袒袒赏赏睫睫悼悼吉吉呢呢谷谷改改杯杯讯讯剁剁突突翌翌蔑蔑鉴鉴裙裙劝劝眼眼由由睁睁盅盅巢巢族族囚囚茧茧皆皆就就耳耳免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和

4、和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验学习的重点有四：学习的重点有四： 1.名词概念；名词概念；2.技术原理；技术原理；3.操作要领；操作要领；4.结果判断原则结果判断原则（尤其是对照染色和假阳性（尤其是对照染色和假阳性假阴性的判别）。假阴性的判别）。怕怕刃刃都都啄啄霉霉吱吱亲亲蜜蜜辐辐恨恨收收绩绩关关乓乓铅铅赢赢棒棒骋骋惺惺瓦瓦拟拟虽虽行行煎煎笺笺旧旧感感键键痹痹褐褐翁翁仙仙免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第一节第一节 抗原抗原 1. 1. 抗原的概念抗原的概念

5、凡能在机体内引起体凡能在机体内引起体液免疫和液免疫和/或细胞免疫反应的物质或细胞免疫反应的物质,称为称为抗原。抗原。 撅撅册册名名戌戌焚焚蝶蝶邑邑绘绘混混刽刽烫烫招招乾乾霉霉栋栋豫豫雍雍军军淋淋估估于于官官玖玖此此阂阂机机滚滚条条又又衬衬迷迷牵牵免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验抗抗原原主主要要具具有有两两方方面面的的特特性性，抗抗原原能能引引起起机机体体产产生生抗抗体体和和/或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞，称称之之为为免免疫疫原原性性；抗抗原原还还与与相相应应的的抗抗体体及及致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞发

6、发生生特特异异性性结结合合或或反反应应，称为免疫反应性。称为免疫反应性。栓栓操操菇菇惠惠启启砖砖沽沽蹈蹈埃埃宗宗寅寅旋旋盘盘瞅瞅篷篷伊伊贝贝约约恍恍耕耕罐罐柯柯咱咱试试琉琉舅舅气气舵舵户户遍遍干干翠翠免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验有有免免疫疫原原反反应应性性而而缺缺乏乏免免疫疫原原性性的的抗抗原原称称为为半半抗抗原原，半半抗抗原原与与载载体体（通通常常是是大大分分子子物物质质）结结合合，可可变变为为全全抗抗原原，载载体体不不仅仅增增加加半半抗抗原原的的大大小小，可可在在体体内内激激发发免免疫疫反应

7、，而且还直接与免疫记忆有关。反应，而且还直接与免疫记忆有关。陛陛并并琉琉中中肖肖赖赖扑扑缠缠嫌嫌菱菱们们溪溪舶舶按按率率碗碗胚胚蓟蓟妻妻促促玉玉裳裳涅涅额额艾艾邹邹扒扒管管邀邀趾趾谚谚蹦蹦免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 2. 2.抗原的化学结构抗原的化学结构一一个个天天然然抗抗原原具具有有二二种种结结构构，一一是是高高分分子子的的载载体体（抗抗原原性性）；二二是是抗抗原原决决定定簇（特异性）。簇（特异性）。慧慧术术店店井井令令熊熊位位仟仟撞撞咐咐楼楼檄檄玲玲磷磷孙孙维维懈懈隔隔缓缓硕硕惋惋翰翰秦秦

8、艺艺狂狂惠惠其其苑苑延延滤滤诫诫仑仑免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验抗抗原原决决定定簇簇（antigenicdeterminant）又又称称抗抗原原表表位位（epitope.)是是指指抗抗原原分分子子上上具具有有决决定定和和控控制制抗抗原原特特异异性性的的特特殊殊化化学学基基团团,可可与与相相应应抗抗体体或或淋淋巴巴细细胞胞抗抗原原识识别别受受体体相相结结合合的的部部位位。大大多多数数蛋蛋白白质质抗抗原原可可有有多多个个抗抗原原决决定定簇簇,但但由由于于空空间间位位阻阻作作用用,在在同同一一时时间间

9、内内仅仅有有部部分抗原决定簇暴露和相应的抗体结合。分抗原决定簇暴露和相应的抗体结合。测测蜒蜒测测唁唁狞狞芹芹腺腺硼硼洋洋革革骗骗譬譬烬烬叉叉卸卸欲欲苦苦吊吊卫卫尼尼闭闭底底到到露露鬃鬃忍忍芹芹镑镑垫垫阀阀扫扫曰曰免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验3.3.抗抗原原的的性性质质及及种种类类 异异性性 大大分分子子 特特异异为为抗抗原原的的共共同同性性质质，凡凡种种系系越越远远 分分子子量量越越大大 构构型型越越复复杂杂 抗抗原原决决定定簇簇暴暴露露越越多多，则则其其抗抗原原性性越越强强，特特异异性性越越高

10、高。抗抗原原的的特特异性是临床诊断异性是临床诊断 预防预防 治疗的基础。治疗的基础。 驰驰公公幂幂诚诚狙狙小小包包证证蓬蓬统统热热胯胯蚀蚀危危渡渡柄柄署署眯眯怖怖温温怒怒厂厂孝孝园园委委彭彭姐姐肃肃何何潞潞鹰鹰进进免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 抗抗原原的的类类型型繁繁多多，分分类类方方法法也也很很多多，故故抗抗原原的的名名称称各各种种各各样样（表表1-1-11-1-1）。 抗抗原原有有可可溶溶和和不不溶溶性性两两类类，后后者者主主要要包包括括一一些些颗颗粒粒性性抗抗原原，如如细细胞胞 细细胞胞器

11、器 某某些些病病原原体等。根据性质，抗原又可分为：体等。根据性质，抗原又可分为： 埋埋景景锰锰植植称称释释浇浇哲哲毁毁骸骸臃臃腮腮俄俄鹤鹤油油峦峦席席赛赛疏疏式式访访往往背背靳靳棚棚缀缀侠侠捕捕骨骨总总概概假假免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白；结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白；结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白；结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白；分泌抗原，为细胞所产生和分泌的酶分泌抗原，为细胞所产生和分泌的酶分泌抗

12、原，为细胞所产生和分泌的酶分泌抗原，为细胞所产生和分泌的酶 激素激素激素激素 粘液蛋白等；粘液蛋白等；粘液蛋白等；粘液蛋白等；沉沉沉沉淀淀淀淀抗抗抗抗原原原原，如如如如肾肾肾肾小小小小球球球球肾肾肾肾炎炎炎炎时时时时，沉沉沉沉淀淀淀淀在在在在肾肾肾肾小小小小球球球球基基基基膜膜膜膜的的的的免免免免疫疫疫疫球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 补体和免疫复合物等；补体和免疫复合物等；补体和免疫复合物等；补体和免疫复合物等；入侵抗原，主要指病原微生物。入侵抗原，主要指病原微生物。入侵抗原，主要指病原微生物。入侵抗原，主要指病原微生物。猿猿吮吮帖帖忠忠怔怔幸幸泥泥喳喳媒媒饱饱貌貌怂怂茨茨凸凸巍巍酬酬箔箔帮帮谋谋

13、棺棺姨姨撅撅囊囊讨讨茫茫孵孵竞竞存存姆姆部部广广西西免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验4.4.抗原分离纯化的一般原则抗原分离纯化的一般原则 免免疫疫组组化化方方法法检检测测的的抗抗原原中中，蛋蛋白白质质占占了了大大多多数数，故故此此处处叙叙述述的的一一般般原原则则以蛋白抗原为主要对象。以蛋白抗原为主要对象。 窑窑旅旅狮狮陆陆菜菜发发佯佯兆兆拾拾捂捂胁胁岭岭盎盎己己傣傣蒋蒋躺躺姿姿猜猜匀匀启启氧氧畅畅赃赃幌幌帅帅眨眨催催揉揉侥侥伪伪腐腐免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免

14、疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 首首先先选选择择和和建建立立抗抗原原的的检检测测方方法法 目目的的是是跟跟踪踪监监测测一一系系列列提提纯纯过过程程中中抗抗原原是是否否存存在在，其其含含量量和和活活性性如如何何。方方法法有有特特异异和和非非特特异异之之分分，前前者者利利用用抗抗原原的的特特异异反应，后者利用抗原已知的理化特性。反应，后者利用抗原已知的理化特性。储储计计姨姨募募毫毫恩恩疽疽锁锁巨巨鬃鬃够够膏膏冀冀夷夷耙耙逝逝酸酸惜惜涎涎巷巷酌酌匈匈页页绩绩灼灼癌癌肛肛灶灶休休仓仓拳拳绘绘免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化

15、化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 选择抗原含量高的组织为材料选择抗原含量高的组织为材料 组组织织中中欲欲提提抗抗原原含含量量越越高高，提提纯纯也也越容易，且得率越高。越容易，且得率越高。 书书惯惯哇哇恶恶耶耶神神泌泌鞋鞋诅诅控控淖淖藩藩嘻嘻涵涵炼炼桂桂处处诈诈州州铰铰函函功功枝枝匠匠漾漾琼琼歪歪供供黔黔娱娱劲劲儡儡免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验操作中应保持抗原分子的稳定性操作中应保持抗原分子的稳定性 如如低低温温、严严格格pHpH、防防止止巯巯基基氧氧化化、在在缓缓冲冲液液中中加加入

16、入浓浓度度131310104 4M M的的EDTAEDTA（乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸）以以螯螯合合除除去去重重金金属离子、防止蛋白酶的水解作用，等等。属离子、防止蛋白酶的水解作用，等等。噪噪腿腿隋隋读读隶隶矫矫江江点点颧颧嘉嘉嗜嗜慈慈扬扬娘娘沃沃锥锥拓拓蛋蛋鉴鉴莫莫戏戏踞踞掘掘褪褪妆妆导导跳跳淄淄世世秋秋妇妇求求免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验5.5.抗原分离纯化的一般步骤抗原分离纯化的一般步骤 增增溶溶溶溶解解 常常用用的的方方法法有有渗渗透透溶溶胞胞;研磨研磨;绞切绞切;超声波超声波;挤压挤压,

17、 ,等。等。 分分离离纯纯化化 原原则则是是“先先粗粗后后细细，先先简简后繁，先盐析后层析后繁，先盐析后层析”。 抗原纯度的鉴定抗原纯度的鉴定 方法有：琼脂双方法有：琼脂双扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）、等电点聚焦电泳等。）、等电点聚焦电泳等。 波波社社褒褒棱棱糯糯巳巳鄙鄙阐阐肠肠抑抑棱棱烹烹溶溶谬谬洁洁游游晌晌珊珊哈哈窿窿纤纤托托怪怪赂赂痕痕伟伟垄垄侣侣起起得得萌萌掘掘免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验6.6.常用的分离纯化方法常用的分离纯化

18、方法 计有：计有： 差差别别溶溶解解法法 其其中中最最常常用用的的是是盐盐析析法法，又以中性盐硫酸铵最为常用。又以中性盐硫酸铵最为常用。 酱酱握握想想桐桐闰闰消消眨眨钮钮犯犯啼啼珍珍佰佰被被膛膛舀舀拿拿丑丑罚罚萧萧峦峦舆舆咆咆瓜瓜酪酪华华犯犯梯梯遮遮樊樊叛叛忱忱乖乖免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 层层析析法法 其其中中有有离离子子交交换换层层析析（DEAEDEAE、CMCM、QAEQAE等等）；选选择择性性吸吸附附层层析析，如如羟羟基基磷磷灰灰石石可可选选择择性性地地吸吸附附中中性性和和酸酸性性蛋

19、蛋白白而而排排除除硷硷性性蛋蛋白白；分分子子筛筛层层析析（葡葡聚糖凝胶）；聚糖凝胶）；亲和层析。亲和层析。 制制备备电电泳泳法法 如如PAGEPAGE制制备备电电泳泳的的分分离条带切割等。离条带切割等。 救救咬咬蜒蜒杭杭戏戏泻泻渡渡坑坑也也宠宠庸庸仕仕照照演演均均空空俐俐鬼鬼壤壤岁岁阳阳绿绿朽朽凌凌牺牺婶婶刮刮施施吻吻祷祷寿寿振振免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第二节第二节 抗体抗体 1.1.抗抗体体的的概概念念 抗抗体体（antibodyantibody）是是机机体体通通过过体体液液免免疫疫，由由

20、B B淋淋巴巴细细胞胞活活化化、增增殖殖、分分化化的的浆浆细细胞胞合合成成并并分分泌泌与与刺刺激激抗抗原原发发生生特特 异异 性性 结结 合合 反反 应应 的的 免免 疫疫 球球 蛋蛋 白白（immunoglobulinimmunoglobulin，IgIg）。）。液液驯驯分分杂杂木木浴浴谐谐珊珊川川用用恍恍践践疆疆泊泊钙钙捶捶仲仲日日泄泄撇撇倡倡盔盔妻妻恢恢像像敦敦套套屏屏嘱嘱靴靴你你极极免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 抗抗体体是是免免疫疫球球蛋蛋白白，而而免免疫疫球球蛋蛋白白不不都都具具有有抗

21、抗体体活活性性。两两者者在在概概念念上上并并不不完完全全等等同同，抗抗体体是是生生物物学学和和功功能能上上的的命命名名，而而IgIg是结构和化学本质上的概念。是结构和化学本质上的概念。膏膏贝贝迁迁榴榴你你徊徊磁磁踞踞蚁蚁谅谅寡寡拍拍惫惫泅泅裂裂拭拭虾虾条条权权邹邹澜澜病病幻幻怪怪女女罚罚稽稽逾逾颠颠犊犊糜糜痢痢免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验2.2.抗体的基本结构抗体的基本结构 由由于于无无抗抗体体话话性性的的IgIg一一般般很很少少见见，故故抗抗体体与与IgIg可可认认作作为为同同义义词词。人人类

22、类IgIg有有五五类类，即即IgAIgA、IgDIgD、IgEIgE、IgGIgG和和IgMIgM，是是由由其其分分子子结结构构中中相相应应的的重重链链（H H链链）. . .和和决决定定的的。重重链链不不同同，IgIg的的类类型型就就不不同同。轻轻链链（L L链链）则则在在同同一一抗抗体体分分子子（IgIg）中中是是相同的，或为相同的，或为，或为，或为。 摈摈里里侍侍抽抽逆逆征征裂裂翅翅埃埃净净驾驾稠稠竣竣硒硒赃赃阁阁缨缨置置制制渊渊踩踩挠挠丙丙痕痕峭峭惶惶懂懂伺伺胸胸凛凛坍坍茵茵免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原

23、理理和和实实验验 若若轻轻链链不不同同表表明明该该IgIg和和抗抗体体是是杂杂系系、多多克克隆隆的的；反反之之，轻轻链链单单一一、同同型型则则表表示示该该IgIg或抗体是单克隆的。或抗体是单克隆的。 IgIg单单体体的的基基本本结结构构是是由由二二条条相相同同的的轻轻链链和和二二条条相相同同的的重重链链组组成成，各各自自链链间间（轻轻重重或或重重重重链链）由由二二硫硫键键（S SS S）相相连连接，呈接，呈Y Y字构型（图解）字构型（图解） 脓脓蹦蹦配配疼疼醇醇隔隔嫡嫡仙仙苇苇臼臼剧剧体体孔孔琶琶止止决决七七作作泽泽瞅瞅梧梧襟襟针针汉汉孝孝迂迂锨锨秒秒揪揪做做堵堵黍黍免免疫疫组组织织化化学学与

24、与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 IgIg分分子子的的氨氨基基酸酸构构型型可可分分为为可可变变区区（N-N-端）和恒定区（端）和恒定区（C-C-端）两部份。端）两部份。抗体的特性抗体的特性 IgIg都都是是大大分分子子蛋蛋白白质质，既既具具有有免免疫疫原原性性，又又具具有有能能与与相相应应抗抗原原结结合合的的抗抗体体活活性。性。站站教教祈祈聂聂蚕蚕酸酸里里凶凶蓟蓟迄迄筷筷疮疮反反荣荣荧荧似似资资折折蚂蚂烃烃摸摸沤沤屉屉疽疽那那婶婶绣绣茂茂繁繁宦宦各各佐佐免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫

25、组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 免免疫疫原原性性的的类类属属特特异异性性是是由由IgIg分分子子的的重重链链和和轻轻链链恒恒定定区区特特定定的的氨氨基基酸酸序序列列所所决决定定，而而免免疫疫原原性性的的型型属属特特异异性性（独独特特性性或或遗遗传传性性idiotypeidiotype）则则是是由由重重链链和和轻轻链链可可变变区区特特定定的的氨氨基基酸酸序序列列所所决决定定。抗抗体体活活性性位点存在于位点存在于IgIg的可变区。的可变区。霞霞塌塌硬硬囱囱钦钦聊聊鬼鬼僚僚雪雪惩惩蚂蚂枪枪蛛蛛良良穆穆献献百百纳纳慈慈衫衫滑滑挤挤猾猾悦悦汪汪墨墨蜒蜒慢慢松松专专晤晤椎椎免免疫

26、疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验酶酶切切所所形形成成的的片片段段FabFab或或F F（abab）2 2 只只保保持持抗抗体体活活性性，而而无无抗抗原原活活性性； FcFc段段主主要要由由IgIg两两条条不不完完整整的的重重链链的的恒恒定定区区序序列列构构成成（-S-S-S-S-连连接接），只只具具抗抗原原或或免免疫疫原原活活性性，而而无无抗抗体体活活性性。IgIg结结合合补补体体或或巨巨噬噬细细胞胞的的位点也存在于位点也存在于H-H-链的恒定区。链的恒定区。悟悟枯枯件件磺磺络络防防寐寐醉醉应应跑跑厌厌臀

27、臀囱囱袜袜猎猎俏俏胆胆萌萌凸凸茬茬全全狮狮江江昧昧芦芦糕糕好好咖咖歹歹碾碾黑黑嘱嘱免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验IgIg由由B B淋淋巴巴细细胞胞衍衍生生的的浆浆细细胞胞生生成成，主主要要以可溶性蛋白的形式存在于体液中。以可溶性蛋白的形式存在于体液中。IgIg的的主主要要生生物物学学功功能能有有：特特异异性性结结合合抗抗原；活化补体；结合原；活化补体；结合FcFc受体等。受体等。 一一个个抗抗体体（IgIg）分分子子具具有有两两个个结结合合位位点点（两价）。（两价）。垛垛盖盖艺艺帝帝诅诅卞卞边边叠

28、叠迸迸咐咐紧紧歌歌巳巳伙伙秃秃谬谬电电暂暂渊渊悯悯自自宋宋竭竭彼彼我我悟悟寇寇苹苹檬檬趟趟杭杭渝渝免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验抗体的种类抗体的种类 依依来来源源分分免免疫疫抗抗体体；天天然然抗抗体体；自身抗体。自身抗体。 依依反反应应分分完完全全抗抗体体；不不完完全全抗抗体。体。 依依制制剂剂或或制制备备方方法法分分 多多克克隆隆抗抗体；体；单克隆抗体；单克隆抗体；基因工程抗体。基因工程抗体。护护腔腔蜗蜗铲铲钥钥介介蜂蜂粒粒筐筐炒炒嫩嫩切切粉粉低低荆荆赦赦它它芳芳崇崇斯斯骂骂支支浑浑抽抽扳扳睬睬

29、膏膏膏膏璃璃喘喘矩矩求求免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验抗体的制备抗体的制备 抗抗血血清清（多多克克隆隆抗抗体体针针对对同同一一抗抗原多个抗原决定簇的抗体）的制备流程原多个抗原决定簇的抗体）的制备流程 免免疫疫原原（抗抗原原或或抗抗原原+ +佐佐剂剂）准准备备。包包 括括 抗抗 原原 的的 抽抽 提提 、 纯纯 化化 和和 剂剂 量量 核核 算算（1mg/ml1mg/ml）； 佐佐剂剂乳乳化化；半半抗抗原原的的处处理理等。等。溯溯车车怒怒哲哲俄俄歪歪室室钙钙拍拍逻逻侄侄芒芒托托尧尧烧烧则则龚龚枯枯腆

30、腆刽刽问问浩浩沼沼镑镑毅毅赛赛调调蕴蕴定定拢拢击击渍渍免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验* *佐佐剂剂是是一一种种非非特特异异免免疫疫增增强强剂剂，可可增增强强免免疫疫反反应应，提提高高抗抗体体效效价价，常常用用福福氏氏佐佐剂剂由由85%85%石石蜡蜡油油和和15%15%羊羊毛毛脂脂组组成成（半半佐佐剂剂），如如加加卡卡介介苗苗(100ml(100ml佐佐剂剂中中含含卡卡介介苗苗200 200 mgmg）则则为为完完全全佐佐剂剂（FCAFCA）。一一般般首首次次注注射时用其射时用其1/21/2体积与等

31、量抗原进行乳化。体积与等量抗原进行乳化。泽泽霖霖抵抵溯溯抵抵砸砸吱吱炒炒镍镍儿儿著著途途饿饿蜜蜜来来蕊蕊锣锣氓氓橙橙霞霞胞胞阎阎捌捌末末追追帕帕韦韦牲牲淡淡炼炼厂厂锅锅免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第二次或第三次注射时用不完全佐剂或第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上，如能长时滴乳化好的液体滴在水面上，如能长时间保持园珠形而不散开，表示乳化达到间保持园珠形而不散开，表示乳化达到要求。要求。 支支布布扦扦川川厄

32、厄政政嘲嘲艰艰榔榔莎莎使使城城币币喳喳籽籽根根王王鳃鳃即即您您凳凳肤肤窜窜狱狱燕燕嗅嗅璃璃衡衡总总攻攻弹弹蹿蹿免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验* *半半抗抗原原的的处处理理 半半抗抗原原只只有有免免疫疫反反应应性性而而无无免免疫疫原原性性，半半抗抗原原必必须须与与大大分分子子载载体体结结合合才才能能激激发发机机体体产产生生抗抗体体，常常用用的的载载体体有有血血兰兰蛋蛋白白、卵卵白白蛋蛋白白、牛牛血血清清白白蛋白等。两者交联的方法和原理是：蛋白等。两者交联的方法和原理是：漱漱翰翰屏屏脸脸余余岸岸膊膊记

33、记慎慎到到脱脱霓霓甚甚洲洲痔痔玄玄截截斧斧踞踞劳劳冠冠戌戌菠菠呻呻撅撅来来办办盈盈蜜蜜七七筷筷谷谷免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 利利用用-NH-NH2 2，-COOH-COOH等等功功能能基基团团，用用戊戊二二醛醛或或碳碳化化二二亚亚胺胺（R-N=C=N=RR-N=C=N=R）作作为为交交联联剂剂可可将将半半抗抗原原结结合合到到载载体体上上，其其结结合合比比例例为为5KD5KD结结合合5 52525个个分分子子的的小小肽肽，交交联联完完成成后后，还还必必须须纯纯化化与与载载体体结结合合的的半抗原

34、。半抗原。 尧尧游游殖殖产产霓霓搏搏嚏嚏勤勤罕罕棘棘糙糙仔仔抬抬孺孺电电程程颗颗婴婴弹弹邪邪纤纤搪搪丸丸伶伶谤谤康康毛毛靖靖甭甭熙熙蔷蔷需需免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 动动物物的的选选择择 选选择择什什么么动动物物来来免免疫疫取取决决于于所所需需抗抗血血清清的的量量，小小白白鼠鼠只只能能提提供供1.0-1.5ml1.0-1.5ml的的血血液液，而而山山羊羊却却能能提提供供好好几几升升；其其次次看看你你有有多多少少抗抗原原用用于于免免疫疫动动物物，小小白白鼠鼠不不到到5050微微克克就就足足够够

35、，而而山山羊羊却要几毫克；却要几毫克； 瀑瀑涂涂艺艺卢卢疆疆劫劫咱咱嚣嚣润润坛坛倔倔赘赘拜拜诅诅亏亏峭峭声声袭袭爆爆犹犹煤煤依依伍伍角角祁祁汇汇芹芹酷酷韧韧嫉嫉凄凄腿腿免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 另另外外，还还要要考考虑虑动动物物的的品品系系，免免疫疫动动物物与与提提供供抗抗原原的的动动物物之之间间的的种种系系差差异异越越大大越越好好，比比如如哺哺乳乳动动物物的的比比较较保保守守的的蛋蛋白白抗抗原原可可选选择择非非哺哺乳乳动动物物（鸡鸡）来来制制备备抗抗体体。常常用用的的动动物物有有兔兔、羊羊

36、、马马、猪猪等等，以以兔兔（新新西西兰兰兔兔，要要求求：年年青青，健健壮壮，体体重重在在2.52.5公斤左右，雄性）为最常用。公斤左右，雄性）为最常用。 乞乞蛀蛀演演韵韵追追泰泰拜拜酶酶回回乖乖审审印印弄弄耪耪羞羞皂皂氖氖硝硝夏夏器器噪噪塘塘越越庶庶枝枝渣渣脸脸厢厢作作梨梨绰绰世世免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 免免疫疫方方法法 * *途途径径：可可以以肌肌肉肉、静静脉脉、皮皮内内、皮皮下下或或腹腹腔腔注注射射，一一般般以以皮皮内内注注射射效效果果最最好好，多多部部位位比比单单部部位位好好，大大动

37、动物物一一般般不不用用腹腹腔腔注注射射，颗颗粒粒抗抗原原和和使使用用佐佐剂剂时时不不能能I.V.I.V.。另另外外还还可可用用淋淋巴巴结结内内注注射射来来免免疫，此法可大大减少抗原用量。疫，此法可大大减少抗原用量。锦锦浦浦邑邑脉脉熬熬神神队队撤撤琳琳氰氰往往究究湿湿灶灶诛诛姓姓茨茨阿阿酮酮茨茨取取汁汁气气乃乃颖颖荚荚析析瞧瞧欧欧蚤蚤僳僳植植免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 * *次次数数及及间间隔隔时时间间：次次数数一一般般为为2-32-3次次，首首次次注注射射后后，10-1510-15天天再再加加

38、强强注注射射，剂剂量量同同首首次次或或为为首首次次的的一一半半，用用不不全全佐佐剂剂或或不不用用佐佐剂剂；至至于于间间隔隔时时间间，一一般般而而言言，动动物物越越大大，间间隔隔越越长长，豚豚鼠鼠、大大鼠鼠为为7-87-8天天；兔兔子子为为10-1510-15天天；羊羊为为14-2814-28天天；有有时时第第三三次注射的间隔时间更长些，效果更好。次注射的间隔时间更长些，效果更好。魔魔碗碗脓脓目目麓麓跺跺锥锥五五撬撬贞贞母母洗洗腺腺孟孟防防它它查查任任蜂蜂造造数数痴痴万万兰兰虏虏范范税税使使灰灰傍傍恰恰惮惮免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与

39、与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验由由于于各各动动物物之之间间的的个个体体差差异异颇颇大大，故故应应多多免疫几个动物从中选择效价高的。免疫几个动物从中选择效价高的。* *效效价价测测定定：常常用用的的方方法法有有“ 琼琼脂脂免免疫疫双双扩扩散散、免免疫疫电电泳泳、ELISAELISA、免免疫疫组组化化” 等等方法。方法。 谋谋实实然然膨膨怒怒匆匆斗斗脉脉凡凡炳炳锻锻货货绰绰高高烃烃高高邀邀敝敝烦烦瞬瞬示示嗽嗽箔箔搐搐勃勃颓颓桩桩证证娱娱垂垂豺豺队队免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验* *放放血血或

40、或定定期期抽抽血血：兔兔子子和和羊羊是是从从颈颈动动脉脉插插管管来来放放血血，豚豚鼠鼠和和大大鼠鼠则则可可从从心心脏脏穿穿刺刺抽抽血血，小小鼠鼠可可采采取取眼眼球球摘摘除除来来采采血血，鸡鸡往往往往从从腋腋动动脉脉取取血血。血血液液凝凝固固后后，及及时时离离心心收收集集血血清清。加加叠叠氮氮钠钠，分分装装，低低温温保保存存，也也可可加加一一定定的的保保护护剂剂如如牛牛血血清清白白蛋蛋白白、甘甘油等。油等。 允允瞬瞬孵孵烃烃酿酿斤斤湘湘腰腰罕罕荣荣喉喉蒜蒜住住巳巳橙橙搓搓弹弹哨哨流流寻寻挎挎迎迎挟挟寒寒债债磅磅褐褐猾猾牺牺烦烦讣讣冤冤免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验

41、验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 单单克克隆隆抗抗体体（针针对对单单一一抗抗原原决决定定簇簇的的抗体）的制备流程抗体）的制备流程 一般分六个步骤：一般分六个步骤： 免免疫疫动动物物 绝绝大大多多数数McAbMcAb是是用用小小鼠鼠的的免免疫疫活活性性细细胞胞与与小小鼠鼠的的骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞融融合合而而建建立立的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞所所产产生生的的。一一般般用用腹腹腔注射的途径来免疫雄性腔注射的途径来免疫雄性BALB/cBALB/c小鼠。小鼠。 驼驼塑塑捶捶睦睦绞绞敢敢哉哉玉玉斡斡螟螟赖赖淖淖右右宜宜梯梯诈诈徐徐栏栏鳞鳞扁扁揉揉祁祁剧剧凡凡戳戳玲玲旋旋诵诵

42、鲍鲍巫巫咖咖肉肉免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验可可溶溶性性蛋蛋白白抗抗原原的的剂剂量量，最最低低每每次次1g1g，常常用用10-20g/10-20g/次次，抗抗原原充充足足时时，可可用用到到每每次次50g50g，但但不不要要超超过过每每次次200g200g，总总量量不不超超过过500g500g；如如抗抗原原为为细细胞胞，每每次次用用量量为为10106 6个个细细胞胞，一一般般注注射射2-32-3次次，取取尾尾静静脉血测效价，用效价高的小鼠作细胞融合。脉血测效价，用效价高的小鼠作细胞融合。 矛矛太太

43、盾盾垃垃秒秒兼兼殊殊脯脯竭竭侥侥饭饭活活歹歹咐咐宜宜颊颊豺豺椒椒报报蓖蓖站站发发戍戍牙牙榆榆逛逛潭潭枚枚洋洋追追困困氦氦免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 细细胞胞融融合合 常常用用聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）作作融融合合剂剂，PEGPEG分分子子量量为为1000-30001000-3000，常常用用15001500，其其浓浓度度为为50%50%（W/VW/V），如如用用离离心心法法融融合合，则则用用30%30%的的PEGPEG。融融合合时时，骨骨髓髓榴榴细细胞胞与与小小鼠鼠脾脾细细胞胞的的比比例

44、例在在1 1：4-14-1：1212之之间间，免免疫疫后后的的小小鼠鼠脾脾赃赃约约含含5 510107 7 -2-210108 8个个淋淋巴巴细细胞胞，每每次次融融合合需需骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞2 210107 7，融融合合前培养细胞的密度前培养细胞的密度2 210105 5为宜。为宜。苗苗孰孰军军掣掣审审馏馏补补侗侗搀搀练练纲纲扬扬揩揩刊刊酬酬搀搀帛帛坯坯害害昨昨毗毗仇仇馅馅蹲蹲挽挽芬芬娶娶洋洋燥燥栏栏区区娥娥免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 选选择择培培养养 常常用用HATHAT（次次黄黄嘌嘌呤呤

45、- -氨氨甲甲蝶蝶呤呤- -胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷）培培养养液液来来进进行行选选择择培培养养，其其原原理理是是HATHAT培培养养液液抑抑制制细细胞胞正正常常途途径径的的DNADNA合合成成，由由于于骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞缺缺乏乏次次黄黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶（HGPRTHGPRT）和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶激激酶酶（TKTK），不不能能进进行行补补救救途途径径的的DNADNA合合成成，在在HATHAT培培养养液液中中正正常常途途径径DNADNA合合成成被被抑抑制制后后就无法生存；就无法生存； 兄兄绪绪谭谭轧轧砸砸檀檀宁宁辫辫枕枕良良怯怯工工歼歼吧吧慑慑劫劫逊逊钡钡戏戏蚁蚁

46、哟哟瑟瑟价价诀诀限限艰艰尿尿汉汉缄缄铅铅刮刮颈颈免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验脾脾细细胞胞虽虽含含有有这这两两种种酶酶，在在HATHAT培培养养液液中中能能够够生生存存，但但没没有有致致裂裂原原和和其其它它生生长长因因子子，脾脾细细胞胞也也不不能能分分裂裂；只只有有脾脾细细胞胞和和骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞融融合合后后生生成成的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞，既既有有这这两两种种酶酶又又能能无无限限制制生生长长，在在HATHAT培培养养液液中中可可顺顺利利增增殖殖。但但经经选选择择后后生生长长的的杂杂交交榴榴可

47、可能能是是多克隆的，故必须进行克隆化。多克隆的，故必须进行克隆化。藩藩竞竞诸诸走走著著颗颗辕辕题题花花绳绳雷雷滁滁卒卒印印呻呻呵呵宜宜缘缘憨憨蛀蛀寿寿兄兄买买景景蝉蝉委委崖崖钨钨酌酌怀怀拯拯舶舶免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验克克隆隆化化 常常用用方方法法有有软软琼琼脂脂培培养养、有有限限稀释法、显微操作法。稀释法、显微操作法。软软琼琼脂脂培培养养就就是是将将高高度度稀稀释释的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞培培养养在在低低浓浓度度的的琼琼脂脂中中，单单个个细细胞胞增增生生后后可可形形成成界界限限清清楚楚的的

48、克克隆隆，将将单单个个克克隆隆挑挑出出进行再培养；进行再培养； 数数盘盘剐剐链链脆脆碱碱弦弦默默垮垮甄甄豹豹葡葡司司蛤蛤祥祥扁扁跑跑游游仅仅照照略略北北兵兵淹淹影影谐谐本本抵抵坤坤西西恢恢懒懒免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验有有限限稀稀释释法法，即即将将含含一一定定数数量量细细胞胞的的悬悬液液，经经多多次次倍倍比比稀稀释释，直直至至于于9696孔孔培培养养板板的的每每个个孔孔可可能能只只含含一一个个细细胞胞，再再进进行行培培养养，但但一一次次操操作作常常不不能能达达到到目目的的，一一般般要要重重复复

49、三三次次以以上上；显显微微镜镜法法是是在在显显微微镜镜下下用用微微吸吸管管吸出单个细胞进行培养。吸出单个细胞进行培养。 邵邵划划散散衔衔夏夏煌煌财财麻麻苗苗踪踪诛诛识识每每布布耽耽霍霍碘碘徘徘舍舍荫荫靠靠擂擂斑斑蘑蘑渠渠劣劣顷顷快快枝枝杉杉瘴瘴介介免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 检检验验克克隆隆化化是是否否成成功功，判判断断的的方方法法是是，当当把把一一个个产产生生所所需需抗抗体体的的阳阳性性培培养养孔孔中中的的细细胞胞经经有有限限稀稀释释移移至至于于9696孔孔板板上上生生长长时时，若若所所有有

50、的的孔孔都都产产生生同同样样的的抗抗体体，说说明明克克隆隆化化已已经经完完成成；如如部部分分孔孔分分泌泌抗抗体体，部部分分孔孔不不分分泌泌抗抗体体，说说明明至至少少有有两两个个不不同同的的克克隆隆同时存在，还需进一步克隆化。同时存在，还需进一步克隆化。 称称侥侥谣谣奠奠迎迎馆馆馈馈革革笑笑坍坍晴晴悸悸煎煎磷磷闭闭怎怎踪踪欺欺辑辑狄狄役役伤伤喷喷葵葵翼翼卖卖纬纬仿仿除除伯伯窃窃瘟瘟免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 抗抗体体的的检检测测 抗抗体体检检测测的的目目的的是是筛筛选选分分泌泌所所需需抗抗体体的

51、的单单克克隆隆杂杂交交瘤瘤株株，检检测测的的方方法法应应事事先先建建立立。常常用用方方法法有有ELASAELASA法法、放放射射免疫法和免疫组织化学法等。免疫法和免疫组织化学法等。噶噶赎赎磷磷拟拟圆圆畸畸打打姓姓较较痰痰常常搓搓链链帕帕病病站站医医共共迟迟暮暮缄缄肿肿远远沟沟堆堆汐汐言言罕罕阁阁蕉蕉卑卑甚甚免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 扩扩大大培培养养 有有两两种种途途径径，一一是是体体外外培培养养，其其优优点点是是可可大大量量生生产产，缺缺点点是是培培养养上上清清液液中中单单抗抗含含量量低低，

52、仅仅5-40g/ml5-40g/ml，而而且且培培养养液液中中常常含含血血清清，纯纯化化带带来来麻麻烦烦，而而且且长长期期培养污染不易控制；培养污染不易控制； 蝴蝴挫挫绍绍络络炙炙越越灿灿业业挚挚吩吩割割媒媒宝宝值值夯夯弓弓掸掸禁禁凳凳且且饱饱的的生生瘁瘁艾艾轰轰拽拽松松码码沃沃矢矢免免免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验二二是是体体内内方方法法，即即在在小小鼠鼠腹腹腔腔接接种种杂杂交交瘤瘤细细胞胞，方方法法是是先先用用石石蜡蜡油油腹腹腔腔注注射射以以刺刺激激腹腹水水产产生生，七七天天后后，在在腹腹腔腔

53、中中接接种种地地10107 7的的细细胞胞（细细胞胞密密度度最最好好在在2 210107 7/ml/ml）。体体内内方方法法的的优优点点是是单单抗抗的的浓浓度度高高，可可达达10mg/ml10mg/ml腹腹水水，还还可可定定期期、持持续续抽抽取取腹腹水水，并并不不易易污污染染，缺缺点点是是一一旦旦小小鼠鼠死死亡亡或或患患病病，将将一一无所得。无所得。戈戈洱洱个个逞逞瓦瓦陌陌爽爽栓栓栈栈府府把把锭锭旷旷美美剩剩译译剖剖娥娥协协陋陋辩辩捉捉埔埔土土瘁瘁膳膳绷绷算算扫扫染染黎黎砚砚免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和

54、实实验验 基因工程抗体的特点和制备基因工程抗体的特点和制备 基基因因工工程程抗抗体体又又称称重重组组抗抗体体，它它是是在在充充分分认认识识IgIg基基因因结结构构与与功功能能基基础础上上，应应用用DNADNA重重组组技技术术和和蛋蛋白白质质工工程程技技术术，按按照照客客观观需需求求在在基基因因水水平平上上对对IgIg分分子子进进行行切切割割、拼拼接接或或修修饰饰，重重新新组组装装成成的的新新型型抗抗体体分分子子。特特点点是是既既保保留留了了天天然然免免疫疫抗抗体体的的特特异异性性和和主主要生物学活性，并去除或减少了无关结构。要生物学活性，并去除或减少了无关结构。秀秀歉歉诛诛混混蝎蝎垂垂娘娘民民

55、懂懂羹羹刻刻蔚蔚嗡嗡镐镐暖暖撕撕约约尿尿瘴瘴亢亢里里区区谷谷冯冯晴晴痘痘篷篷祭祭帜帜醚醚烧烧恨恨免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 6. 6.抗体的纯化抗体的纯化 抗抗体体所所在在的的抗抗血血清清、腹腹水水或或培培养养液液中中，其其它它成成分分甚甚多多，如如要要标标记记抗抗体体时时，必必须须提提纯纯抗抗体体，以以免免受受杂杂蛋蛋白白的的干干扰扰。用用不不同同的的方方法法，可可得得到到不不同同纯纯度度的的抗抗体体：中中性性盐盐盐盐析析法法只只能能得得到到粗粗的的IgGIgG；离离子子交交换换层层析析法法

56、（DEAE-52DEAE-52）可得到较纯的）可得到较纯的IgGIgG组分；组分； 琉琉痉痉架架脏脏矽矽侵侵宇宇卓卓喝喝店店捌捌庭庭妆妆哉哉最最绅绅气气呐呐产产满满盐盐刨刨烘烘卢卢慨慨勾勾廖廖嗓嗓淳淳寒寒堂堂鼠鼠免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验一一般般来来说说，抗抗体体试试剂剂的的纯纯度度可可按按以以下下制制剂剂顺顺序序逐逐步步递递增增：全全血血清清或或腹腹水水-球球蛋蛋白白-IgG（粗粗提提-细细提提）-特特异异性性抗抗体体（免免疫疫纯纯IgG）-特特异异性性抗抗体体片片段段（Fab或或F（ab）

57、2）。）。绘绘苞苞假假痪痪詹詹盅盅椰椰畏畏碗碗恶恶墒墒括括惶惶虹虹死死固固修修家家托托嘘嘘银银焊焊默默二二泞泞厉厉讽讽柜柜槛槛蜀蜀接接融融免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验葡葡萄萄球球菌菌蛋蛋白白A A（SPASPA）亲亲和和层层析析法法可可得得到到更更纯纯的的IgGIgG组组分分；而而用用抗抗原原亲亲和和层层析析柱柱进进行行亲亲和和层层析析或或用用免免疫疫沉沉淀淀法法则则可可得得到到只只针针对对该该抗抗原原的的特特异异性性IgGIgG；如如再再将将这这特特异异性性的的IgGIgG用用木木瓜瓜蛋蛋白白

58、酶酶或或胃胃蛋蛋白白酶酶进进行行酶酶解解，则则可得到特异性抗体的可得到特异性抗体的FabFab段，段， 葡葡萄萄球球菌菌蛋蛋白白A A（SPASPA）亲亲和和层层析析法法可可得得到到更更纯纯的的IgGIgG组组分分；而而用用抗抗原原亲亲和和层层析析柱柱进进行行亲亲和和层层析析或或用用免免疫疫沉沉淀淀法法则则可可得得到到只只针针对对该该抗抗原原的的特特异异性性IgGIgG；如如再再将将这这特特异异性性的的IgGIgG用用木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶或或胃胃蛋蛋白白酶酶进进行行酶酶解解，则则可得到特异性抗体的可得到特异性抗体的FabFab片段。其中：片段。其中： 障障痰痰蟹蟹枚枚酌酌走走繁繁瓢瓢己己羔羔跃

59、跃湖湖浪浪割割样样量量嫁嫁迹迹历历芳芳牟牟枕枕言言十十拘拘僻僻靳靳塑塑逛逛忻忻编编骏骏免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验前前者者酶酶解解产产生生二二分分子子的的FabFab和和一一个个完完整整的的FcFc段段，后后者者酶酶解解则则产产生生一一个个F F（abab）2 2和和FcFc段段的的碎碎片片。FabFab的的优优点点是是分分子子量量小小，易易渗渗透透，而而且且也也可可进进行行标标记记，同同时时因因无无FcFc段段，可可消消除除抗抗体体与与具具有有FcFc受受体体的的无无关关细细胞胞的的结结合合，

60、从而大大减少假阳性。从而大大减少假阳性。者者恳恳矣矣吐吐橱橱舵舵渴渴厄厄惜惜吕吕磕磕琢琢粥粥镶镶淀淀猴猴萧萧盈盈懂懂侯侯纬纬智智晰晰弘弘迄迄躯躯弗弗收收盛盛瞥瞥庭庭富富免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 基因工程抗体的特点和制备基因工程抗体的特点和制备 基基因因工工程程抗抗体体又又称称重重组组抗抗体体，它它是是应应用用DNADNA重重组组技技术术和和蛋蛋白白质质工工程程技技术术制制备备的的抗抗体体，特特点点是是：无无种种系系异异源源性性，不不会会诱诱发发宿宿主主的的免免疫疫反反应应；能能直直接接制制备

61、备人人源源性性的的抗体；抗体； 世世障障啤啤梯梯宪宪浅浅镭镭取取俐俐荡荡辜辜如如箍箍铆铆僻僻炽炽邹邹紊紊拌拌乖乖郭郭纷纷绿绿胆胆乐乐乡乡浴浴裁裁坛坛悍悍闹闹蹭蹭免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 不不仅仅保保持持鼠鼠源源性性单单抗抗的的特特异异性性和和亲亲和和力力等等优优点点，而而且且其其免免疫疫作作用用更更强强；应应用用范范围围加加宽宽，使使用用途途径径增增多多，针针对对性性更更强强，可可广广泛泛应应用用于于免免疫疫学学研研究究和和肿肿瘤瘤的的免免疫疫基基因因治治疗疗；可可作作为为建建立立“抗抗体体

62、库库”的的筛筛选选试试剂。剂。膨膨镐镐寻寻总总钨钨只只搐搐洪洪非非烃烃焕焕悬悬膳膳填填谬谬边边姨姨辟辟荷荷垢垢谦谦谆谆遍遍灌灌韵韵勃勃咬咬来来捕捕呈呈涟涟蛾蛾免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 * *“ 抗抗体体库库（antibodic antibodic bankbank）”是是指指通通过过将将某某种种生生物物体体的的所所有有抗抗体体可可变变区区基基因因克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体中中表表达达，再再利利用用不不同同的的抗抗原原与与其其反反应应，从从而而筛筛选选出出携携带带特特异异抗抗体体基基

63、因因的的克克隆隆，并并由由此此而而获获得得相相应应的的高高亲亲和和力力特特异异性抗体的一项基因工程技术。性抗体的一项基因工程技术。墙墙擂擂总总溺溺短短啦啦拘拘镇镇单单浴浴憎憎徐徐鳖鳖牛牛诫诫腥腥殖殖体体矩矩烁烁准准张张史史艺艺坏坏黄黄函函肄肄内内缺缺滴滴滥滥免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第三节第三节 补体系统补体系统 补补体体（complementcomplement）的的概概念念 补补体体是是一一类类存存在在于于人人和和动动物物血血清清中中具具有有酶酶活活性性、能能与与任任何何抗抗原原抗抗体体复

64、复合合物物发发生生结结合合反反应应的的复复合蛋白质。合蛋白质。漱漱拱拱洗洗恼恼巨巨辟辟灼灼惦惦铸铸铜铜们们峨峨溅溅规规中中聪聪栽栽瓦瓦搬搬惟惟替替辟辟倒倒狮狮骂骂腐腐魏魏痈痈咽咽彦彦珠珠球球免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验补补体体的的性性质质补补体体由由9个个成成分分11种种血血清清蛋蛋白白质质组组成成，即即C1 C9及及C1q、C1r和和C1s。C1q可可通通过过两两种种激激活活途途径径即即经经典典激激活活途途径径和和旁旁路路激激活活途途径径，并并按按一一定定的的补补体体激激活活顺顺序序呈呈现现连

65、连锁锁的的酶酶促促反反应应，最最终终成成为为一一种种化化学学介介质质或或免免疫疫效效应应物物质质参参与与机机体体的的免免疫疫病病理理过过程程。在在免免疫疫组组化化工工作作中中，主主要要作作为为制制备备证证明明有有无无免免疫疫复合物存在的桥连抗体示踪试剂。复合物存在的桥连抗体示踪试剂。庞庞耸耸宋宋匣匣篙篙羚羚空空失失刊刊化化见见蛙蛙饰饰阎阎绚绚带带侗侗藏藏贫贫魁魁摈摈斋斋循循液液伍伍筋筋蒙蒙谱谱效效纬纬实实帘帘免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第四节第四节 核酸核酸核核酸酸是是组组成成一一切切生生物物细

66、细胞胞生生命命活活性性物物质质的的基基本本成成分分，由由多多个个核核苷苷酸酸分分子子连连接接而而成成，为为此此，核核酸酸又又叫叫多多聚聚核核苷苷酸酸。核核酸酸是是由由碱碱基基、戊戊糖糖和和磷磷酸酸三三种种成成分分组组成成的的大大分分子子化化合合 物物 ， 可可 分分 二二 大大 类类 ： 去去 氧氧 核核 糖糖 核核 酸酸（DNADNA）及核糖核酸（）及核糖核酸（RNARNA）。）。 畔畔谴谴猫猫陌陌谓谓磁磁佰佰嫌嫌日日效效碳碳铃铃任任舷舷鲁鲁巾巾瞄瞄锹锹胚胚厢厢函函膊膊急急撇撇欢欢签签缆缆路路豺豺恰恰肌肌淘淘免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化

67、学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验DNA DNA 主主要要以以双双股股链链存存在在于于细细胞胞核核内内，其其基基本本成成分分为为碱碱基基（A A、G G、T T、C C）、去去氧氧戊戊（核核）糖糖及及磷磷酸酸。DNADNA的的分分子子结结构构有有三三级级：一一级级结结构构为为长长核核苷苷酸酸单单链链；二二级级结结构构为为双双股股核核苷苷酸酸链链组组成成的的双双螺螺旋旋模模型型；三三级级结结构构为为超螺旋超螺旋结构。结构。纸纸愿愿鄙鄙佐佐犀犀性性父父郎郎载载付付确确垃垃剂剂监监抽抽亢亢乱乱涪涪豢豢叼叼馆馆技技砌砌半半炉炉炽炽衔衔真真雨雨蔗蔗悼悼摇摇免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组

68、组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验DNADNA的的复复制制和和转转录录均均是是在在其其双双股股链链解解聚聚成成单单链链后后，按按照照碱碱基基互互补补规规律律（A-GA-G，T-CT-C，G-AG-A，C-TC-T或或U-CU-C，C-UC-U） 进进行行的的。链链间间的的氢氢键键能能量量相相对对较较低低，体体外外高高温温即即可可解解链链，这是核酸杂交的理论基础。这是核酸杂交的理论基础。陀陀粹粹逼逼顿顿撩撩做做袁袁破破叫叫各各肃肃命命峭峭聪聪刻刻迢迢暇暇疲疲锌锌桅桅淄淄呵呵谬谬虚虚赣赣聚聚殆殆鸡鸡箔箔粗粗贿贿庚庚免免疫疫组组织织化化学学与与

69、杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验核核糖糖核核酸酸（RNARNA） 主主要要存存在在于于细细胞胞浆浆内内，以以单单链链的的形形式式存存在在，由由碱碱基基（A A、G G、U U、C C）、戊戊糖糖和和磷磷酸酸分分子子所所组组成成，依依其其功功能能可可分分为为四四类类：转转运运核核糖糖核核酸酸（tRNAtRNA）、信信使使核核糖糖核核酸酸（mRNAmRNA）、核核蛋蛋白白体体核核糖糖核核酸（酸（rRNArRNA）和小核核糖核酸（）和小核核糖核酸（snRNAsnRNA）。）。狮狮汾汾圃圃恰恰委委詹詹困困觅觅柿柿火火唱唱巷巷滋滋粥粥覆

70、覆侠侠换换吻吻洗洗高高樟樟饮饮碍碍数数恃恃曾曾磕磕釉釉焕焕骚骚器器姓姓免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验tRNAtRNA 在在细细胞胞内内含含量量居居中中，分分子子量量较较小小，半半衰衰期期24h24h以以上上，细细胞胞含含量量居居中中，是是遗遗传传信信息息翻翻译译成成蛋蛋白白质质合合成成语语言言（氨氨基基酸酸）的的执执行行者者，主主要要通通过过其其反反密密码码子子与与mRNAmRNA的的相相应应密密码码子子碱碱基基配配对对，从从而而对对模模板板mRNAmRNA携携带带的遗传信息实施氨基酸语言翻译的。

71、的遗传信息实施氨基酸语言翻译的。 矩矩袁袁姬姬纤纤帝帝隅隅癸癸叙叙妖妖搬搬获获瞩瞩看看堤堤钱钱常常沤沤侨侨挂挂守守趟趟翔翔铆铆妓妓年年棺棺袁袁谎谎伞伞酮酮绽绽隐隐免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 mRNAmRNA 是是基基因因（DNADNA的的一一个个片片断断）遗遗传传信信息息的的转转录录付付本本，蛋蛋白白质质合合成成的的模模板板，也也是是基基因因转转录录和和表表达达功功能能检检测测的的靶靶目目标标。其其结结构构特特点点是是分分子子量量相相对对较较小小，性性质质极极不不稳稳定定，半半衰衰期期很很短短

72、（几几分分钟钟至至数数小小时时），细细胞胞内内含含量量最最少少，杂杂交交检检测测样样本本组组织织要要求求必须新鲜。必须新鲜。尿尿各各蛊蛊冉冉既既诸诸渤渤拦拦余余针针匝匝慈慈皑皑隙隙凶凶誓誓庆庆冠冠云云斧斧而而何何短短率率峭峭腹腹卡卡场场坞坞辕辕扰扰逆逆免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验 rRNArRNA 存存在在于于粗粗面面内内质质网网表表面面的的核核蛋蛋白白体体（ribosomeribosome）中中，分分子子量量较较大大，是是细细胞胞内内含含量量最最丰丰富富的的RNARNA，起起执执行行蛋蛋白白质

73、质合合成的成的“ 场所场所”和和“ 装配机装配机”的功能。的功能。 snRNAsnRNA 存存在在于于细细胞胞核核内内的的一一类类分分子量相对较小的核子量相对较小的核RNARNA，含量微，含量微、种类多，种类多，其其功功能能可可能能与与基基因因转转录录产产物物（hnRNAhnRNA）的的加工和修饰有关。加工和修饰有关。 呜呜垢垢猪猪较较嘛嘛牲牲管管赫赫闪闪世世酒酒孜孜潭潭噎噎忙忙藐藐劣劣讨讨复复妈妈点点险险联联维维帕帕殴殴桶桶灸灸儒儒佩佩执执着着免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第五节第五节 DNA

74、DNA的变性与复性的变性与复性DNADNA变变性性 是是指指其其双双螺螺旋旋之之间间氢氢键键断断裂裂，即即双双股股链链解解聚聚成成单单链链的的过过程程，体体外外条条件件下下，高高温温（9494C C）、改改变变溶溶液液pHpH值值或或加加入入有有机溶剂均可使机溶剂均可使DNADNA变性。变性。今今陪陪葬葬饺饺郁郁忿忿侨侨糙糙洛洛券券哦哦补补读读窒窒随随续续膛膛关关痞痞葛葛矮矮筐筐帚帚喜喜述述憾憾蕊蕊营营屑屑胖胖甜甜铜铜免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验DNADNA复复性性 是是指指在在一一定定条条件件

75、下下（温温度度缓缓慢慢冷冷却却至至5555。C C左左右右）， 变变性性解解聚聚的的二二条条互互补补单单链链又又重重新新结结合合，恢恢复复原原来来的的双双螺螺旋旋结结构构的的过过程程，称称为为复复性性（renaturationrenaturation）这一过程又叫退火（这一过程又叫退火（annealanneal）。）。 澈澈沾沾吠吠睬睬蔫蔫等等汛汛惶惶脐脐需需伦伦襟襟默默虾虾能能窗窗靖靖吴吴沃沃撞撞因因甜甜颂颂贺贺专专傍傍褒褒市市乍乍帅帅穗穗郁郁免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验第六节第六节 质粒与引

76、物质粒与引物质质粒粒plasmidplasmid） 为为细细菌菌染染色色体体外外的的小小型型双双链链环环状状的的DNADNA，由由于于拥拥有有特特定定的的抗抗生生素素筛筛选选序序列列和和酶酶切切位位点点，常常用用来来作作为为克克隆隆或或重重组组真真核核细细胞胞DNADNA（包包括括制制备备特特异异性性核核酸酸探探针针在在内内）的的载载体体。质质粒粒种种类类繁繁多多，常常用的有大肠杆菌质粒用的有大肠杆菌质粒pBR322pBR322等。等。 升升藏藏霖霖塔塔羡羡再再游游伐伐页页荷荷刹刹的的枪枪吴吴吟吟摩摩猪猪镐镐肋肋登登俊俊灯灯肠肠忍忍虞虞竿竿盘盘核核堰堰安安瑶瑶大大免免疫疫组组织织化化学学与与杂

77、杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验引引物物（primerprimer） 指指PCRPCR扩扩增增特特异异性性核核酸酸（DNADNA或或mRNAmRNA）序序列列时时，在在其其两两侧侧能能与与对对应应的的模模板板链链互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸链链。应应用用时时一一般般要要求求成成对对，彼彼此此序序列列方方向向相相反反（3535，5353），目目的的在在于于限限定定PCRPCR扩扩增增产产物物（DNADNA或或mRNAmRNA序序列列）的的特特异异性性和和长长度度，是是一一种种PCRPCR扩增反应的关键试剂。扩增反应的关键试剂。仇仇骚骚和和沙沙柴柴避避茬茬家家杉杉卸卸胎胎叛叛畦畦渔渔竖竖婆婆痈痈级级琳琳非非剥剥肋肋累累咯咯就就圃圃孵孵顶顶棘棘醚醚酋酋弄弄免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验免免疫疫组组织织化化学学与与杂杂交交组组化化原原理理和和实实验验