化学药物结构确证研究的技术要求与案例分析-课件

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1、化学药物结构确证研究的技术要求化学药物结构确证研究的技术要求与案例分析与案例分析 nn王玉成王玉成n中国医学科学院中国医学科学院医药生物技术研究所医药生物技术研究所目录o(一一) 结构确证研究的一般原则和要求结构确证研究的一般原则和要求o(二二) 对不同类别药品结构确证的要求对不同类别药品结构确证的要求o(三三) 对特殊化学结构药品结构确证的要求对特殊化学结构药品结构确证的要求o(四四) 各项波谱和测试的技术要求各项波谱和测试的技术要求(案例案例) 1. 结构确证研究的主要对象结构确证研究的主要对象 2. 结构确证研究的基本方法结构确证研究的基本方法 3. 结构确证研究的主要内容结构确证研究的

2、主要内容 4. 结构确证研究的一般要求结构确证研究的一般要求(一一) 结构确证研究的一般原则结构确证研究的一般原则和要求和要求1. 结构确证研究的主要对象结构确证研究的主要对象 经化学全合成或半合成、微生物发经化学全合成或半合成、微生物发酵以及从动、植物中提取的原料药酵以及从动、植物中提取的原料药,包括包括新药、进口药和已有国家标准的药品新药、进口药和已有国家标准的药品.n按来源：按来源： 化学合成、半合成、天然产物中提取、发酵等化学合成、半合成、天然产物中提取、发酵等;n按组分：按组分： 单一组分、多组分混合物单一组分、多组分混合物;n按分子量：按分子量： 小分子化合物、大分子化合物小分子化

3、合物、大分子化合物;n按结构特点：按结构特点： 成成盐盐化化合合物物和和非非成成盐盐化化合合物物、手手性性化化合合物物和和非非手手性性化化合合物物、含含结结晶水晶水/溶剂和不含结晶水溶剂和不含结晶水/溶剂等溶剂等;2.2.结构确证研究的基本方法结构确证研究的基本方法 化学方法：理化分析、元素分析、化学关联等化学方法：理化分析、元素分析、化学关联等 物理方法：波谱方法、衍射技术物理方法：波谱方法、衍射技术 a. a. 射频波、微波与物质的相互作用：核磁共振、电子顺磁共振等射频波、微波与物质的相互作用：核磁共振、电子顺磁共振等(ESP(ESP根根据据谱谱图图中中吸吸收收峰峰的的位位置置、谱谱线线的

4、的积积分分强强度度、谱谱线线的的宽宽度度及及超超精精细细结结构构等等信信息息可可以以鉴鉴定定自自由由基基和和过过滤滤金金属属离离子子等等顺顺磁磁粒粒子子的的结构状态，检测它们的浓度（可检测到结构状态，检测它们的浓度（可检测到10-14摩摩/升）。升）。) ) b. b. 红红外外、可可见见、紫紫外外光光与与物物质质的的相相互互作作用用：红红外外光光谱谱、紫紫外外光光谱谱、拉拉曼曼光光谱谱等等 c. Xc. X射线与物质的相互作用：射线与物质的相互作用：X X射线衍射等射线衍射等 d. d. 电子与物质的相互作用：质谱、电镜等电子与物质的相互作用：质谱、电镜等 e. e. 其他：热分析、原子吸收

5、、原子发射等其他：热分析、原子吸收、原子发射等3.3.结构确证研究的主要内容结构确证研究的主要内容 骨架（平面）结构：骨架（平面）结构： 分子中各原子之间的连接顺序和方式分子中各原子之间的连接顺序和方式; ; 构型：构型： 分子中各原子之间的空间相对位置分子中各原子之间的空间相对位置; ; 结晶水结晶水/ /结晶溶剂：结晶溶剂： 与水、有机溶剂通过氢键等结合与水、有机溶剂通过氢键等结合; ; 晶型：晶型： 分子（或原子）在晶体中的排列方式分子（或原子）在晶体中的排列方式; ;骨架（平面）结构骨架（平面）结构 例：氟吗西尼例：氟吗西尼骨架（平面）结构的研究方法骨架（平面）结构的研究方法: : a

6、. a. 单晶单晶X X射线衍射射线衍射; ; b. b. 常常规规方方法法，如如元元素素分分析析（或或高高分分辨辨质质谱谱）、UVUV、IRIR、NMRNMR（包包括括二二维维谱谱）、MSMS等组合等组合; ; 应应根根据据化化合合物物骨骨架架结结构构的的特特点点及及其其复复杂杂程程度度、有有无无对对照照品品及及参参考考文文献献，合合理理选选用用测试项目。测试项目。 构构 型：型： 几何构型几何构型: 双键、环状化合物，常用顺反（双键、环状化合物，常用顺反（cistrans）或）或ZE表示表示 例：西尼地平例：西尼地平 （）-3-（2-甲氧基乙基）甲氧基乙基）-5-3-苯基苯基-2（E）-丙

7、烯基丙烯基-2,6-二甲基二甲基-4-（3-硝基苯基）硝基苯基）-1,4-二氢二氢- 3,5-吡吡啶二甲酸酯啶二甲酸酯 例：拉米夫定例：拉米夫定 (2R-(2R-顺式顺式)-4-)-4-氨基氨基-1-(2-1-(2-羟甲基羟甲基-1-1，3-3-氧硫杂环戊氧硫杂环戊-5-5-基基)-1H-)-1H-嘧啶嘧啶- -2-2-酮酮几何构型的研究几何构型的研究： 理化性质差别明显理化性质差别明显 a. 理化常数，例如熔点等理化常数，例如熔点等; b. 氢谱、碳谱氢谱、碳谱; c. 红外光谱、紫外光谱等红外光谱、紫外光谱等;光学异构：由于分子的不对称性引起，光学异构：由于分子的不对称性引起，常用常用D-

8、 L或或R-S表示。表示。 例：例：那格列奈那格列奈 （）（）N-N-（反（反-4-4-异丙基环基甲酰基）异丙基环基甲酰基）-D-D-苯苯丙氨酸丙氨酸 例：前列腺素例：前列腺素E1E1（1R1R，2R2R，3R3R）-3-3-羟基羟基-2-2- （E E）- -（3S3S）-3-3-羟基羟基-1-1-辛烯基辛烯基-5-5-氧代环戊烷庚酸氧代环戊烷庚酸光学异构的研究：光学异构的研究： a. 比旋度测定比旋度测定 b. 手性柱色谱（手性柱色谱（HPLC、GC） c. 核磁共振（核磁共振（NMR） d. 单晶单晶X射线衍射（射线衍射（SXRD） e. 旋光光谱（旋光光谱（ORD）(1. 决定化合物之

9、绝对立体构造。决定化合物之绝对立体构造。 2. 决定蛋白质决定蛋白质2级与级与3级构造。级构造。 ) f. 圆二色谱（圆二色谱（CD） g. 其他方法其他方法 对照品法对照品法根据对照品的构型推定根据对照品的构型推定 化学关联法化学关联法利用合成工艺分析利用合成工艺分析 例如，例如， 左旋西替利嗪的构型确证：左旋西替利嗪的构型确证： 手手性性柱柱色色谱谱定定位位（与与对对照照品品对对比比) )、 比比旋旋度度数数据据、光学纯度分析光学纯度分析晶型的研究晶型的研究: : 晶型晶型 是化合物一个重要特性;对于多晶型药物,因晶格结构不同,某些理化性质(如熔点、溶解度、稳定性)可能不同;而且在不同条件

10、下,同一化合物的各晶型之间可能会发生相互转化。对于难溶性固体口服制剂,其原料药晶型可能影响药物的溶解度、稳定性、药代动力学性质进而可能影响药效。所以对于已有文献报道的多晶型化合物应明确其晶型,晶型的一致性;对于创新药也应注意积累相关研究资料观察有无多晶型现象。晶型的研究晶型的研究: : a. a. 粉末粉末X-X-射线衍射法射线衍射法 b. b. 红外光谱法、拉曼光谱法红外光谱法、拉曼光谱法 c. c. 熔点法熔点法 d. d. 热分析热分析 e. e. 光学显微镜法光学显微镜法 无对照品和文献报道：无对照品和文献报道： 考考察察不不同同结结晶晶条条件件下下（溶溶剂剂、温温度度、结结晶晶速速率

11、率等等）制制备备样样品品的的熔熔点点、红红外光谱、粉末外光谱、粉末X X射线衍射等射线衍射等; ; 有对照品有对照品: : 对对比比自自制制药药物物与与已已上上市市药药物物的的熔熔点点、红红外外光光谱谱图图、粉粉末末X X射射线线衍衍射射图谱等图谱等; ; 有文献报道有文献报道: : 对文献资料进行分析，选取能够准确反映产品晶型的测试项目对文献资料进行分析，选取能够准确反映产品晶型的测试项目; ;结晶水结晶水/ /结晶溶剂的研究结晶溶剂的研究: : 药物分子通过氢键等和水、有机溶剂结合形成水合物/溶剂化物,含有不同数量结晶水/结晶溶剂的化合物可能具有不同的物理性质,进而可能影响药物的生物利用度

12、,因此对于原料药应明确其所含的结晶水/溶剂的情况。结晶水结晶水/ /结晶溶剂的研究结晶溶剂的研究: : a. a.元素分析元素分析 b.b.热分析热分析 c.c.干燥失重、水分检查干燥失重、水分检查 d.d.单晶单晶X-X-射线衍射射线衍射 创新药：创新药： 在在干干燥燥失失重重、水水分分测测定定研研究究的的基基础础上上，通通过过热热分分析析、元元素素分分析等确证样品分子中结晶水析等确证样品分子中结晶水/ /结晶溶剂的数量结晶溶剂的数量; ; 已上市的药品：已上市的药品： 采采取取合合适适的的分分析析方方法法对对样样品品进进行行分分析析，以以确确证证其其结结晶晶水水/ /结结晶溶剂的情况与已上

13、市产品一致晶溶剂的情况与已上市产品一致; ;小结： 在审评过程中专家评价的关注点一般包括:结构确证方案设计的合理性,是否对化合物所有要素进行了考虑;研究内容设置的全面性,所有的结构特征是否已被确证;分析方法选择的正确性,所用方法能否针对性地解决结构问题。 研发者在进行结构确证研究时,测试项目的选择要依据化合物结构特点、需要解决的结构问题、各种方法所能解决的结构问题等综合考虑。 对测试样品和对照样品的要求：对测试样品和对照样品的要求：测试样品测试样品: a. 精制方法精制方法 测试样品要采用和原料药制备工艺中相同的精制方法、工艺条件进行精制；对于进行晶型分析、结晶水/结晶溶剂分析时尤其需要注意，

14、因为不同的精制方法和工艺条件可能产生不同的晶型、结晶水/溶剂。 b. 纯度要求纯度要求 大于99.0%，杂质含量应小于0.5%； 对于手性药物，应增加对对映体、非对映体纯度要求，一般 不低于99.5%。 对照品对照品: a. 合法来源证明合法来源证明 购得的标准品购得的标准品(已有国家标准的药品已有国家标准的药品) 市售原料药市售原料药 市售制剂中提取得到的原料药市售制剂中提取得到的原料药 从正规试剂公司购得的试剂等从正规试剂公司购得的试剂等（有的申报资料中，未选择上市原料药或其他合法对照品，而是采用自己单位精制的产品，这种“自身”对照的数据和图谱对于结构确证没有任何帮助。 ） b. 精制方法

15、：精制方法： 对于用于晶型、结晶水等信息确证的对照品，不应采用处理后原料药或制剂中提取物作为对照品，因为原料药和制剂在不同溶媒处理后，会对样品真实的晶型和结晶水产生影响，造成误判。 c. 纯度检查：纯度检查： 对照品的纯度检查：申报资料中应提供对照品的纯度检查结果。一般来说，对照品纯度应不低于精制品纯度，以保证对照品对药物结构确证的支持力度。4. 结构确证研究的一般要求结构确证研究的一般要求对图谱、数据的要求对图谱、数据的要求 附附图图应应为为原原图图的的复复印印件件或或照照片片; 图图谱谱及及图图谱谱上上的的标标记记、数数据据应应清清晰晰，并并有有完完整整的的检检测测日日期期、各各项项参参数

16、数、测测试试条条件件、仪仪器器型号及样品编号等记录。型号及样品编号等记录。 各各项项检检测测数数据据应应按按规规定定列列表表说说明明，注注明明其其顺顺序序。有有对对照照品品的的应应将将测测试试品品和和对对照照品品同同一一波波谱谱的的数数据据在在一一个个表表中中对对比比列列出出。如如有有可可作作参参照照的的文文献献数数据据，也也可可列列在在同同一一表中。质谱应附离子裂解图。表中。质谱应附离子裂解图。(二二) 对不同类别药品结构确证的要求对不同类别药品结构确证的要求n未知结构的化合物：推论结构n已知结构的化合物：验证结构 未在国内外上市销售的原料药未在国内外上市销售的原料药 按按全全新新化化学学单

17、单体体要要求求：推推论论结结构构 a.完成必要的各项测试完成必要的各项测试; b.应提供充分的试验图谱和数应提供充分的试验图谱和数据据; c. 按新化合物要求进行图谱解按新化合物要求进行图谱解析和综合解析析和综合解析; 如有参考文献资料，可提供如有参考文献资料，可提供作参考。作参考。 已在国外上市销售但尚未在国内已在国外上市销售但尚未在国内销售的原料药或已有国家标准的原料销售的原料药或已有国家标准的原料药药 按已知化学结构的药物：验证结构按已知化学结构的药物：验证结构 可以使用对照品可以使用对照品 可以参考文献可以参考文献 a. 有合格对照品的化合物：有合格对照品的化合物： 提提供供测测试试样

18、样品品和和对对照照品品在在完完全全相相同同条条件件和和同同一一仪仪器器上上测测得得的的各各项项图图谱谱和和数数据据，完完成成所所需需的的各各项项目目测测试试，若若二二者者完完全全相相同同，并并对对重重要要的的波波谱谱讯讯号号和和测测试试数数据据进进行行了了正正确确解解析析，即即可可得得出出二二者者化化学学结结构构一一致致的的结结论。论。 b. 有详细文献数据的化合物：有详细文献数据的化合物： 可可对对结结构构确确证证研研究究的的内内容容、方方法法提提供供线线索索，并并为为解解析析提提供供参参考考，但但是是不不能能作作为为结结构构确确证证研研究究的的充充分分证证据，仍需要进行较为详尽的图谱解析和

19、综合解析。据，仍需要进行较为详尽的图谱解析和综合解析。 c. 无对照品和文献数据的化合物：无对照品和文献数据的化合物： 除除了了目目标标化化合合物物的的结结构构外外，缺缺乏乏其其他他支支持持性性资资料料，因因此此原原则则上上应应按按全全新新化化学学单单体体要要求求进进行行全全面面的的研研究究，提提供供充充分分的的试试验验图图谱谱和和数数据据，可可结结合合其其它它研研究究工工作作（例例如如合合成成工工艺艺路路线线的的确确定定）以以进进一一步步推推论论化合物的结构。化合物的结构。(三三) 对特殊化学结构药品结构确证的对特殊化学结构药品结构确证的要求要求 1. 立体异构体药物立体异构体药物 立体异构

20、体：立体异构体： 光学异构体光学异构体 a. 对映异构体对映异构体 b. 非对映异构体非对映异构体 几何异构体（顺、反异构体）几何异构体（顺、反异构体） 手性药物手性药物-绝对构型和相对构型绝对构型和相对构型 a. 单一对映体单一对映体-绝对构型绝对构型 比旋度测定比旋度测定 手性柱色谱手性柱色谱 (手性手性HPLC和和GC) 核磁共振核磁共振 单晶单晶X-衍射衍射 圆二色谱圆二色谱 旋光光谱旋光光谱 b. 消旋体消旋体-有多个手性中心时要求有多个手性中心时要求确定相对构型确定相对构型; c. 立体异构混合物立体异构混合物-确定异构体的确定异构体的组成和比例组成和比例;“手性药物申报资料及审评

21、要点手性药物申报资料及审评要点” (药审中心药审中心) 应应注注意意确确证证产产品品的的立立体体构构型型。可可根根据据手手性性中中心心的的多多少少、文文献献数数据据是是否否充充足足、对对照照品品的的有有无无来来选选择择合合适适的的确确证证的的方方法法，必要时可采用单晶必要时可采用单晶X射线衍射进行确证。射线衍射进行确证。 比比旋旋度度是是必必须须的的检检测测项项目目之之一一，已已知知的的起起始始原原料料的的构构型型和和化化学学合合成成方方法法的的立立体选择性也可作为依据之一。体选择性也可作为依据之一。2. 具有多晶型的药物具有多晶型的药物 晶型晶型: 是指结晶物质晶格内分子的排列形式。是指结晶

22、物质晶格内分子的排列形式。 多晶型物质晶格内部分子间力的差异可多晶型物质晶格内部分子间力的差异可能引起药物各种理化性质的变化，能引起药物各种理化性质的变化， 主要主要对熔点、溶解度及溶出速率、稳定性、对熔点、溶解度及溶出速率、稳定性、有效性的影响有效性的影响。 重点：重点： 以适宜的方法获得药物晶型的数据。以适宜的方法获得药物晶型的数据。 常用方法：常用方法： 粉末粉末X-衍射法衍射法 红外吸收光谱法红外吸收光谱法 熔点熔点 热分析热分析 光学显微镜光学显微镜 创新药物创新药物 a. 不同结晶条件下（溶剂、温度、结不同结晶条件下（溶剂、温度、结晶速率等）晶型的一致性；晶速率等）晶型的一致性；

23、b. 不同晶型是否影响药物活性和毒性不同晶型是否影响药物活性和毒性等等; 结构已知的仿制药品结构已知的仿制药品 a. 力求与被仿制品保持一致；力求与被仿制品保持一致； 特特别别是是被被仿仿制制药药为为晶晶型型选选择择性性药药物物，且且各各晶晶型型的的理理化化性性质质及及生生物物药药剂剂学学性性质质有有明明显显差差异异的的仿仿制制药药品品，要要重重点点确确定定与与被被仿仿制制品品种种晶晶型型的的完完全全一一致致性性（熔熔点点、红红外外吸吸收收光光谱谱、粉粉末末X射线衍射图等射线衍射图等)。 b. 重重点点关关注注难难溶溶性性固固体体口口服服制制剂剂晶型的研究；晶型的研究；3. 合成多肽类药物合成

24、多肽类药物 氨基酸分析氨基酸分析（证明多肽的组成是否正确）（证明多肽的组成是否正确）； 质谱测定（质谱测定（提供相对分子质量及序列的信息）；提供相对分子质量及序列的信息）； 序列分析以及肽图测绘等；序列分析以及肽图测绘等； 紫外：紫外：对具有生色团结构的小肽有一定的测试意义；对具有生色团结构的小肽有一定的测试意义； 红外：红外：适用于小肽（含三个氨基酸的肽）、拟肽等；适用于小肽（含三个氨基酸的肽）、拟肽等； 核磁共振：核磁共振：可对小肽的结构提供部分信息；可对小肽的结构提供部分信息； 其他方法：其他方法： HPLC、比旋度测定等。、比旋度测定等。 药物结构中有半胱氨酸，应明确其药物结构中有半胱

25、氨酸，应明确其状态（氧化态或还原态）；状态（氧化态或还原态）； 药物结构中存在二硫键，应明确二硫药物结构中存在二硫键，应明确二硫键的正确连接点；键的正确连接点； 结合合成工艺对中间体的研究，对终结合合成工艺对中间体的研究，对终产品的结构进行确证。产品的结构进行确证。4. 多糖类药物多糖类药物多糖结构的描述包括多糖结构的描述包括:n多糖的分子量范围；多糖的分子量范围；n多糖的单糖组分；多糖的单糖组分；n单糖的连接点类型；单糖的连接点类型；n单糖和糖苷键的构型；单糖和糖苷键的构型；n重复单位重复单位; n确证方法：确证方法： 单糖的分离、鉴定：单糖的分离、鉴定：纸色谱法、纸色谱法、TLC、HPLC

26、、气气-质联用技术等；质联用技术等； 多糖的相对分子量及分子量分布测定：多糖的相对分子量及分子量分布测定：凝凝胶色谱法；胶色谱法； 糖苷键的连接方式及糖苷键的位置：糖苷键的连接方式及糖苷键的位置：红外、红外、核磁共振、化学反应后产物的分析等核磁共振、化学反应后产物的分析等；5. 多组分药物多组分药物 明明确确各各组组分分的的组组成成比比例例，对对影影响响药药效效和和毒毒性性的的主主要要成成分分进行结构确证。进行结构确证。 可可使使用用经经典典的的提提取取方方法法或或其其它它分分离离技技术术，如如制制备备色色谱谱（TLC，HPLC），分分离离得得到到主主要要药药效效成成分分单单体体，按按单单体体

27、项项目要求进行化学结构确证。目要求进行化学结构确证。 在在组组分分多多，含含量量少少，难难于于得得到到单单体体时时，可可使使用用联联机机分分析析技技术术，如如气气一一质质联联用用（GCMS），液液质质联联用用（LCMS），气气付付利利叶叶红红外外联联用用（GCFTIR），质质质质联联用用（MSMS），辅助组分结构的验证及定量分析。），辅助组分结构的验证及定量分析。6. 不含金属元素的有机盐类或不含金属元素的有机盐类或复合物复合物 应同时提供应同时提供成盐前后成盐前后的两套波谱和试验数的两套波谱和试验数据。据。 对于某些波谱测定有困难或不易说明其结对于某些波谱测定有困难或不易说明其结构的盐或复合

28、物，可测定药物酸根或碱基的波构的盐或复合物，可测定药物酸根或碱基的波谱，并结合其他试验项目进行确证。谱，并结合其他试验项目进行确证。7. 金属盐类和络合物金属盐类和络合物 除除通通常常要要求求的的各各项项测测试试外外，还还应应提提供供确确证证分分子子中中金金属属元元素素的的种种类类、存存在在形形式式和和含含量量的的有有关图谱和分析数据。关图谱和分析数据。 不不适适于于或或不不能能测测试试金金属属盐盐本本身身的的项项目目，可可以以用用成成盐盐前前的的酸酸分分子子或或配配位位体体的的相相应应测测试试结结果果进行佐证。进行佐证。8. 半合成化合物半合成化合物 分分子子母母核核的的结结构构为为已已知知

29、并并可可以以确确证证其其原原分分子子母母核核结结构构在在合合成成过过程程中中未未发发生生改改变变的的，可可适适当当简简化化对对母母核核部部分分结结构构的的确确证证工工作作。重重点点对对新新引引入入基基团团进进行行结结构构确确证证，可可以以结结合合原原料料结结构构和和合合成成路路线线进进行行论证和说明。论证和说明。 如如涉涉及及构构型型确确证证，若若母母核核手手性性中中心心构构型型没没有有改改变变时时，重点在于侧链和取代基中新引入手性中心的构型确定。重点在于侧链和取代基中新引入手性中心的构型确定。n综合解析举例FABMS22 muM+HM+Na12364578910111213141512364

30、57891011121314CHCH2OCH3123645789101112131412a2b34591011131478612a2b34591011131478612a386452b97111014131236 4578910111213141512a2b345910111314786申报资料的格式和内容申报资料的格式和内容n 一一. 新药的化学结构式、分子式及分子量新药的化学结构式、分子式及分子量n 二二. 供确认化学结构用供试品的纯度及检查纯度的方法供确认化学结构用供试品的纯度及检查纯度的方法n 三三. 确证化学结构的方法确证化学结构的方法n 理化常数理化常数n 元素分析元素分析n 四四

31、. 各项波谱和测试的技术要求各项波谱和测试的技术要求n 紫外吸收光谱紫外吸收光谱n 红外吸收光谱红外吸收光谱n 核磁共振氢谱核磁共振氢谱n 核磁共振碳谱核磁共振碳谱n 质谱质谱n 差热分析差热分析n X-射线衍射谱射线衍射谱n 综合解析综合解析n 五五. 参考文献参考文献 一一. 新药的化学结构式、分子式及分子量新药的化学结构式、分子式及分子量n二二. 供确认化学结构用供试品的纯度及供确认化学结构用供试品的纯度及检查纯度的方法检查纯度的方法三三. 确证化学结构的方法确证化学结构的方法2 元素分析元素分析 主要应用：主要应用： 确定元素组成、分子式确定元素组成、分子式; ; 除氧元素外，其余各种

32、元素一般均能准确除氧元素外，其余各种元素一般均能准确测定其含量。测定其含量。 可以反映结晶水可以反映结晶水/ /结晶溶剂、成盐化合物的结晶溶剂、成盐化合物的酸根和碱基等。酸根和碱基等。 C C、H H、N N元素可采用自动元素分析仪测定，元素可采用自动元素分析仪测定，其他元素可采用适宜的物理或化学方法测定。其他元素可采用适宜的物理或化学方法测定。 技术要求：技术要求： a. 应应详详细细说说明明使使用用仪仪器器、测测定定方方法法及及条条件件。特特别别是是对对测测试试样样品品的的预预处处理理方方法法、条件。条件。 b. 同同一一样样品品测测定定两两次次，两两次次实实验验数数据据同时列出，不取平均

33、值。同时列出，不取平均值。 c. 应应给给出出计计算算理理论论值值所所依依据据的的分分子子式式，包包括括结结晶晶水水（或或结结晶晶溶溶剂剂) 。列列表表比比较较实实测测值值与与理理论论值值（一一般般要要求求误误差差不不超超过过0.30.3），初初步步判判定定供供试试品品与与目目标标化化合合物物的的分分子子组组成成是否一致。是否一致。 d. d. 附测试报告单的复印件。附测试报告单的复印件。n仪器型号与测定条件n仪器：Carlo-Erba 1106元素分析仪(意大利)n测定条件：1050催化燃烧 载气：N2 n 氧瓶法测定n测定结果与解析n测定结果：样品测定结果与对照品测定结果见附表1。n结果解

34、析：样品与对照品的实测值同理论计算值基本相符，C、H、N、的误差均在千分之五以内，同含5个结晶水的盐酸大观霉素分子式C14H24ClN2O72HCl5H2O符合。n表1 样品（020708）与对照品（DJS）的元素分析数据n CHN样品（020708）(%)33.667.285.6433.767.375.67对照品（DJS）(%)33.657.305.6733.627.295.68理论计算值(%)33.957.335.66(四四)各项波谱和测试的技术要求各项波谱和测试的技术要求1. 1. 红外吸收光谱红外吸收光谱(IR)(IR) 基本原理：基本原理： 分子中化学键振动能级的跃迁。分子中化学键振

35、动能级的跃迁。主要应用：主要应用： a.a.鉴定化合物的结构鉴定化合物的结构 有对照品、标准图谱有对照品、标准图谱 b.b.推测化合物的结构推测化合物的结构 确定特征官能团、区分晶型等确定特征官能团、区分晶型等 技术要求：技术要求： a. 按药典规定方法校正和检定仪器；按药典规定方法校正和检定仪器； b. 正确选择测试方法和条件正确选择测试方法和条件 固体样品首选溴化钾压片法；固体样品首选溴化钾压片法； 离子交换离子交换-氯化钾压片；氯化钾压片； 晶型变化晶型变化-糊法；糊法； c. 准确、合理、充分的图谱解析准确、合理、充分的图谱解析; d. 按要求格式列表和撰写资料按要求格式列表和撰写资料

36、; 仪器型号与测试仪器：Nicolet Impact-400型红外分光光度计仪器测试：用聚苯乙烯膜仪器的测定条件测定条件：样品测定用溴化钾压片法测定图谱：图1、2附图3： 聚苯乙烯膜红外吸收光谱。 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 测试条件测试条件 仪器校正和检定仪器校正和检定 数据表数据表 解析解析吸收峰(cm-1) 强 度振动类型基 团 2. 2. 紫外吸收光谱紫外吸收光谱(UV)(UV) 基本原理：电子跃迁基本原理：电子跃迁 主主要要应应用用：推推测测共共轭轭体体系系的的骨骨架架结结构构（发色团、助色团）（发色团、助色团） 紫外光谱紫外光谱定性定性 吸收系数吸收系数定量定量n技术要求技

37、术要求 a. 按药典规定方法校正和检定仪器；按药典规定方法校正和检定仪器； b. 通常要求三种溶剂：中性、通常要求三种溶剂：中性、0.1N HCl 、0.1N NaOH； c. 要求定量，准确计算摩尔吸收系数；要求定量，准确计算摩尔吸收系数； d. 归属主要吸收谱带；归属主要吸收谱带； e. 数据列表说明；数据列表说明；n 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 测试条件测试条件 仪器校正和检定仪器校正和检定 数据表数据表 解析解析 溶 剂 max 值基团和吸收带溶 剂max nmAbs水194.80200.00210,002.06232.28060.82090.1mol/L盐酸200.00204

38、.00210.002.05892.26251.2121三乙胺198.00203.00210.002.00952.27111.33163.3.核磁共振氢谱核磁共振氢谱( (1H-NMR) ) 基本原理：基本原理： 利用原子核的核自旋现象，通过一定振动频利用原子核的核自旋现象，通过一定振动频率的电磁波照射时，原子核吸收电磁波从低能率的电磁波照射时，原子核吸收电磁波从低能态向高能态跃迁，即核磁共振。态向高能态跃迁，即核磁共振。主要应用主要应用 可提供供试品中氢原子数目、周围化学可提供供试品中氢原子数目、周围化学环境、相互间关系、空间排列等信息。环境、相互间关系、空间排列等信息。 技术要求技术要求 a

39、. 应使用应使用200MHz以上高分辨以上高分辨NMR仪。仪。 b. 对对各各项项测测试试条条件件应应有有明明确确、详详尽尽的的说说明明，如如仪器型号、规格、溶剂、内标。仪器型号、规格、溶剂、内标。 c. 对对分分子子中中全全部部H原原子子均均要要有有明明确确的的解解析析和和归归属。属。 d. 对对复复杂杂结结构构化化合合物物，应应考考虑虑采采用用合合适适的的其其它它技术加以佐证。技术加以佐证。 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 溶剂、内标溶剂、内标 给出原子编号的分子结构式给出原子编号的分子结构式 数据表数据表 (如有对照品或文献数据可以对比列入表中) 解析解析原子序号化学位移质子数多重性

40、 J 值相应质子4.4.核磁共振碳谱核磁共振碳谱( (13C-NMR) ) 基本原理基本原理： 利用原子核的核自旋现象，通过一定利用原子核的核自旋现象，通过一定 振动频率的电磁波照射时，原子核吸收电振动频率的电磁波照射时，原子核吸收电 磁波从低能态向高能态跃迁，即核磁共振。磁波从低能态向高能态跃迁，即核磁共振。 主要应用主要应用: : 可提供供试品中碳原子的数目、所处的可提供供试品中碳原子的数目、所处的不同化学环境信息。不同化学环境信息。 技术要求技术要求 a. 对各项测试条件应有明确、详尽的说明，对各项测试条件应有明确、详尽的说明，如仪器型号、规格、溶剂、内标。如仪器型号、规格、溶剂、内标。

41、 b. 在图谱复杂时，应使用质子噪声去偶或偏在图谱复杂时，应使用质子噪声去偶或偏共振去偶技术，使图谱简化。共振去偶技术，使图谱简化。 c. 对对分分子子中中全全部部C原原子子均均要要有有明明确确的的解解析析和和归归属。属。 d. 对对复复杂杂结结构构化化合合物物，可可与与类类似似结结构构化化合合物物的的化学位移进行计算比较，确定合理结构。化学位移进行计算比较，确定合理结构。 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 溶剂溶剂 给出碳原子编号的分子结构式给出碳原子编号的分子结构式 数据表数据表 (如有对照品或文献数据可以对比列入表中) 解析解析 碳原子序号 化学位移 碳原子类型5. 其他核磁共振谱其他

42、核磁共振谱 DEPTDEPT谱谱: :可区分碳原子的类型可区分碳原子的类型; ;1 1H H1 1Hcosy: Hcosy: 可可以以显显示示相相隔隔2 23 3键键相相互互之之间间存存在偶合的质子对信息在偶合的质子对信息; ;C- C- Hcosy Hcosy (HMQC (HMQC , ,异异核核多多量量子子相相关关谱谱): ): 可可以以了解分子中了解分子中C-HC-H联结情况联结情况; ; HSQC (HSQC (异核单量子相关谱异核单量子相关谱):):用于测定用于测定1 1H-H-1313C C相关相关信息，可以直接明确信息，可以直接明确C C、H H之间的连接关系之间的连接关系;

43、; HMBC ( HMBC (异核多重键相关谱异核多重键相关谱):):可以显示可以显示1 1H H、1313C C 之之间远程偶合的信息，即相隔二键和三键的间远程偶合的信息，即相隔二键和三键的1 1H H、1313C C之间相关信号之间相关信号; ;解析化合物中存在的结构单元，解析化合物中存在的结构单元，推测化合物中各官能团、结构单元之间的连接关推测化合物中各官能团、结构单元之间的连接关系系; ;1919F F、3131P P等等: :可提供相应元素的种类及数目、在可提供相应元素的种类及数目、在分子中所处的化学环境等信息分子中所处的化学环境等信息; ; n常用的二维核磁共振测试包括H-Hcos

44、y（H-H Correlated spectroscopy）、HMBC（1H-detected multiple-bond heteronuclear multiple-quantum coherence）、HMQC（1H-detected heteronuclear multiple-quantum coherence）等，对于结构复杂或用一般NMR方法难以进行结构确证的化合物，进行二维谱测试可更有效地确证药物的结构。碳谱注意点：n1. 碳信号数目比实际的少，原因可能为信号重叠，或有些季碳信号弱，或隐藏在溶剂信号内；n2. 碳信号数目比实际的多，原因可能是某些化合物存在构象异构。n分子式：C

45、44H69NO12.H2O n结构式为C44H69NO12，在其13C全去偶谱中应显示44个峰，但实际显示多达83个峰，这是因为在溶剂中有两种构像,一种为优势一种为劣势，（文献报道在氯仿中比例为3:1） 6. 质谱(MS) 基本原理：基本原理： 将将气气体体分分子子经经电电子子流流轰轰击击, ,使使分分子子中中的的电电子子成成为为带带正正电电荷荷的的分分子子离离子子, ,而而后后裂裂解解成成一一系系列列的的碎碎片片离离子子, ,再再通通过过磁磁场场使使不不同同质质荷荷比比的的正正离离子分离并记录其相对强度子分离并记录其相对强度, ,画出质谱图。画出质谱图。 主要应用：主要应用： 提提供供分分子

46、子离离子子峰峰、碎碎片片峰峰、丰丰度度等等信信息息，可可以以确定分子量、分子式以及推测部分结构单元。确定分子量、分子式以及推测部分结构单元。 对对含含有有同同位位素素元元素素( (如如ClCl、BrBr等等) )的的药药物物, ,利利用用同同位位素素簇簇的的丰丰度度比比，可可推推断断药药物物中中部部分分元元素素的的种种类、数量，乃至分子式、裂解方式等。类、数量，乃至分子式、裂解方式等。技术要求技术要求: a. 应应尽尽量量设设法法获获得得化化合合物物分分子子离离子子峰峰。当当用用EI法法不不能能出出现现分分子子离离子子峰峰时时，可可试试用用其其它它电电离源，如离源，如CI，FAB，FI，FD，

47、ESI等。等。 b. 所所获获数数据据按按规规定定列列表表，并并对对重重要要的的碎碎片片离离子峰的产生进行解释，提供离子裂解图。子峰的产生进行解释，提供离子裂解图。 c. 高高分分辨辨质质谱谱不不能能反反映映药药品品的的纯纯度度和和结结晶晶水水，结晶溶剂，残留溶剂的情况结晶溶剂，残留溶剂的情况。 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 测试条件测试条件 数据表数据表 裂解图裂解图 解析解析 M/ Z 相对丰度相对丰度 碎片离子碎片离子7. 热分析热分析 基本原理：基本原理： 采采用用程程序序控控温温下下，精精确确记记录录待待测测物物质质理理化化性性质质与与温温度度的的关关系系，研研究究其其受受热热

48、过过程程中中晶晶型型转转变变、熔熔融融、升升华华等等物物理理变变化化和和脱脱水水、热热分解、氧化、还原等化学变化。分解、氧化、还原等化学变化。 主要应用：主要应用： 差差示示扫扫描描量量热热法法（DSC): 测测定定熔熔点、结晶水点、结晶水/结晶溶剂、考察晶型等。结晶溶剂、考察晶型等。 热热重重法法（TGA): 测测定定结结晶晶水水、吸吸附水和结晶溶剂、分解温度等。附水和结晶溶剂、分解温度等。 技术要求：技术要求： a. 应应说说明明使使用用仪仪器器型型号号、参参数数设设定定值值，包包括括升温度速度、样品重量、温度范围。升温度速度、样品重量、温度范围。 b. 供供试试品品与与对对照照品品应应在

49、在同同一一仪仪器器、相相同同条条件件下测定。下测定。 c. 差差热热分分析析曲曲线线表表达达：纵纵坐坐标标为为热热流流率率（dp/dt），横横坐坐标标为为温温度度（）。气气体体一一般般为氮气，流速为为氮气，流速为40ml/min。 热重分析曲线表达：纵坐标为重量热重分析曲线表达：纵坐标为重量（mg）或重量百分数，横坐标为温度（）或重量百分数，横坐标为温度（），），气体一般为氮气，流速为气体一般为氮气，流速为40ml/min。 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 测试条件测试条件 测试结果和讨论测试结果和讨论8.X8.X射线衍射射线衍射 粉末粉末X-X-射线衍射射线衍射 主要应用主要应用: :

50、a. a. 固体状态下单一化合物的鉴别固体状态下单一化合物的鉴别 b. b. 晶型确定晶型确定 c. c. 晶态与非晶态物质的判断等晶态与非晶态物质的判断等 单晶单晶X射线衍射射线衍射 主要应用主要应用: a. 化合物的骨架结构信息化合物的骨架结构信息 b. 化合物的相对或绝对构型化合物的相对或绝对构型 c. 构象及差向异构构象及差向异构 d. 盐键及配位键盐键及配位键 f. 结晶水结晶水/溶剂溶剂 资料撰写格式资料撰写格式 仪器仪器 测试条件测试条件 结构解析结构解析 晶体学参数晶体学参数 结构测定方法结构测定方法 结构数据结构数据 结构图结构图 结论结论9. 9. 综合解析综合解析 在结构

51、确证申报资料中存在的问题主要体在结构确证申报资料中存在的问题主要体现在解析不充分现在解析不充分, ,未对各项研究提供的数据和未对各项研究提供的数据和信息进行有机、深入、合理地综合分析信息进行有机、深入、合理地综合分析, ,仅是仅是机械式地罗列测试数据和图谱机械式地罗列测试数据和图谱, ,没有综合解析没有综合解析过程过程, ,割裂了各种测试数据的联系割裂了各种测试数据的联系, ,以致未达以致未达到对药物结构进行准确认识的目的到对药物结构进行准确认识的目的, ,特别是在特别是在药物结构中的某些信息需多种方法相互结合药物结构中的某些信息需多种方法相互结合才能作出准确判断或多种方法相互结合方可才能作出

52、准确判断或多种方法相互结合方可进一步深入了解药物结构信息的情况下进一步深入了解药物结构信息的情况下, ,该现该现象表现得尤为明显。象表现得尤为明显。 综合解析的一般过程综合解析的一般过程: :a. a. 确定化合物的分子式确定化合物的分子式 元素分析元素分析 质谱法（尤其是高分辨质谱）质谱法（尤其是高分辨质谱） 综合各种谱图提供的碳、氢等原子数综合各种谱图提供的碳、氢等原子数b. b. 根据分子式计算不饱和度根据分子式计算不饱和度c. c. 确定分子中存在的主要官能团和结构单元确定分子中存在的主要官能团和结构单元d. d. 明确各官能团、结构单元的连接方式明确各官能团、结构单元的连接方式e.

53、e. 对构型、晶型、结晶水对构型、晶型、结晶水/ /结晶溶剂进行分析结晶溶剂进行分析 技术要求：技术要求： a. a. 有对照品有对照品 样品和对照品的测试结果是否一致样品和对照品的测试结果是否一致 波谱信号的归属波谱信号的归属 b. b. 无对照品无对照品 详细的解析、正确的归属详细的解析、正确的归属 参考文献可以作为重要的参考资料参考文献可以作为重要的参考资料 资料撰写要求：资料撰写要求： 简明扼要简明扼要 有机有机 合理合理 深入深入 药物的结构确证研究是药物研发的基础,不论是新药还是仿制药,都必需先明确其结构。由于原料药的结构确证存在很多特殊情况和不断出现更为先进的分析方法,在实际工作中,应根据药物本身的特点,选择合适的结构确证方法或手段,科学、合理地将药物的结构进行严密地阐述,而不能机械地照搬照抄指导原则的方法。