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1、EPCsEPCs的分离培养的分离培养 .m内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞。m在生理或病理因素刺激下,可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。.应用前景应用前景m内皮祖细胞取材方便，在血管再生和心血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。例如，利用内皮祖细胞修复心肌梗死患者的心脏，治疗I临床肢体缺血，治疗冠状动脉疾病，改善血管移植物的通畅率，改善糖尿病患者的血管形成能力，定向抑制肿瘤血管生成，作为基因治疗导向载体和靶细胞，等等。应用内皮细胞治疗心血管疾病将是很有前途的新方法。.主要来源：骨髓和外周血主要来源：骨髓和外周
2、血骨髓来源：细胞数量多，集落状生长，增殖能力强外周血来源：细胞数量较少，散在生长，消化后能贴壁但不能传代两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、因子在不同时段呈阳性表达；激光共聚焦显微镜观察，Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞，但前者是早期内皮祖细胞，后者为晚期内皮祖细胞，两者生物学特性各不相同。.密度梯度离心法密度梯度离心法红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯
3、有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95，淋巴细胞约占9095，细胞获得率可达80以上，其高低与室温有关，超过25时会影响细胞获得率。.骨髓骨髓EPCsEPCs获取获取1.SD大鼠腹腔注射10水合氯醛（0.3mL/100g）进行麻醉后断尾放血，75乙醇浸泡3060mins消毒。2.无菌条件下分离股骨和胫骨，剔除肌肉组织，将骨两端沿骨骺处剪断。3.D-Hanks液反复冲洗骨髓腔，按4：1的体积比将骨髓冲洗液缓慢叠加于Histopaque-1083单个核细胞分离液的液面上，保持两种液体间界面清晰。.4.采用密
4、度梯度离心法，室温下2000r/min离心30min，无菌吸管取乳白色细胞层，移入另一离心管中，D-Hanks液1000r/min洗涤两次，最后EGM-2MV重悬细胞。5.将细胞以1 / 的密度接种在包被有纤联蛋白Fn的培养瓶或六孔板中，培养48小时后收集未贴壁细胞，置于包被有纤联蛋白Fn的培养瓶或六孔板中继续培养。.外周血外周血EPCsEPCs获取获取1.抽取SD大鼠（350450）动脉血10mL，加IMDM等倍稀释并混匀。将肝素抗凝并稀释后的血液加入含有淋 巴 细 胞 分 离 液 （ 密 度 1.088） 的 试 管 中 ，2000r/min离心25min，吸取单个核细胞层。2.加入5倍体
5、积以上的IMDM，以1300r/min离心5min，洗涤细胞两次，末次弃上清后加入IMDM重悬细胞。3.取一滴细胞悬液与一滴2.0g/L台盼蓝染液混合，滴于血球计数板上，计数4个大方格内的细胞总数。.3.以1 /L的密度接种于加有IMDM完全培养基的预涂纤联蛋白的培养皿中。4.3d后換液，将未贴壁细胞弃去。此后每3d更换培养液，大约于接种后10d左右，贴壁细胞完全铺满皿底。附：完全培养基中含有IMEM、100mL/L胎牛血清、100mL/L马血清、VEGF30uL/mL、bFGF10uL/mL.主要思路主要思路1.密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞，接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养2.用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养3.对获得的贴壁细胞进行细胞形态学，免疫细胞化学染色，流式细胞仪，透射电镜，以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。.
