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1、PCR 技术及习题PCR （polymerasechainreaction） ：聚合酶链式反应1、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条 DNA单链作为母链，以4 中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3 端开始延伸DNA链，即 DNA的合成方向是从子链的5 端自 3 端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内 DNA 的复制过程。 DNA 的复制需要引物，其主要原因是DNA 聚合酶只能从 3端延伸 DNA 链。2、PCR 反应过程是：变性复性延伸类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性- 退火（复性） -
2、 延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性）：温度下降到 50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合；引物的延伸： 72左右时， TaqDNA 聚合酶有最大活性，可使DNA 新链由 5 端向 3端延伸。3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA 分子就变成了两个DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n的形式增加。PCR 的反应过程都是在PCR 扩增仪中完成的。4、细胞被 DNA 复制与 PCR 技术的比较：细胞内 DNA 复制体外 DNA 扩增
3、（ PCR ）不 同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制 80100高温解旋，双链完全分开酶DNA 解旋酶、 DNA 聚合酶TaqDNA 聚合酶引物RNA DNA 、RNA 温度体内温和条件高温相同点需提供 DNA 模板四种脱氧核苷酸为原料子链延伸的方向都是从5 端到 3 端知识点拨：1、DNA 分子复制的人工控制解开螺旋：在 80100时， DNA 双螺旋打开，形成两条DNA 单链，称为变性。恢复螺旋：在 5060左右时，两条DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液， DNA 模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA 聚合酶、两种引物。控制仪器： PCR 仪（温度周期性自动调节仪）
4、。2、PCR 的含义是多聚酶链式反应。3、PCR技术反应的条件：稳定的缓冲溶液环境（一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为 10mmol/L,并将其调节到 8.38.8 之间） ；DNA模板；合成引物（ 2 个） ；四种脱氧核甘酸； DNA 聚合酶；温控设备4、PCR 技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。5、TaqDNA 聚合酶的特点是：耐高温。知识拓展：1、DNA聚合酶不能够从头合成DNA ，只能从 DNA的 3 端开始延伸 DNA链，因此 DNA复制需要引物。2、引物: 引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任
5、何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。3、PCR 引物设计原则：（1）PCR 引物通常长 15-25 碱基，其中 G C约占 50% 。（2）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。（3）引物的 3末端必须与目的片段完全相配。（4）引物的 5末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成习题训练1聚合酶链式反应 (PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量 DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的 4 种脱氧核苷酸
6、及ATP等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。（1）某个 DNA样品有 1000 个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4 ， 则经过PCR仪 五 次 循环后，将产生个 DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是个。（2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是。（3）请指出 PCR 技术与转录过程的三个不同之处：。2通过 DNA 重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程
7、中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是一GGATCC 一，请回答：（1）从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是。（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。微量 DNA样品DNA互补链分离开为单链以单链为模板合成子代DNA 循环重复（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是，“插入”时常用的工具是。3 下面甲图中 DNA 决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品 DNA经 PCR 技术( 聚合酶链式反应 ) 扩增，可以获取大量DNA 克隆分子。分析回答：（1）甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是。该图表示了DNA 中遗传信息的过程。（2）有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。此种贫血症的根本原因是，即发生了改变。（3）乙图的“ PCR ”与人体内的DNA 复制相比有何特殊之处 ?。（4）现在要通过“ PCR ”得到甲图中 DNA 片段的 1024个克隆片段，则至少要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸。
