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1、高级生物化学与分子生物学综合实验报告一、 实验目的以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线， 进行基因操作、 蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练， 通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。二、 实验原理利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA 在体外进行重组，然后把这种重组 DNA 转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。三、 实验内容一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化实验 1. 重组质粒的分离、纯化及检测实验 2. 质粒的酶切及琼脂糖凝胶
2、电泳回收实验 3. 感受态细胞的制备、连接与转化二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达实验 4. 细菌的大量培养及重组蛋白的诱导三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定实验 5. 细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化实验 6. 目标蛋白的 SDS-PAGE 鉴定实验 1 质粒 DNA的分离、纯化及检测材料、设备及试剂一、材料转化的细菌， 1.5ml 塑料离心管 , 离心管架。二、设备微量取液器 (20l,200 l,1000 l) ， 台式高速离心机， 恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1. LB 液体培养基 (Luria-Bertani)
3、：称取蛋白胨 (Tryptone)5 g，酵母提取物(Yeast extract) 2.5g，NaCl 5g，溶于 800ml去离子水中，用NaOH 调 pH至 7.5, 加去离子水至总体积500 mL，高压下蒸气灭菌20 分钟。2. LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉，高压灭菌。3. 氨苄青霉素 (Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml 水溶液 , -20 保存备。 4. 质粒提取试剂盒。操作步骤1. 细菌的培养和收集将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5ml LB 液体培养基 (含50g/ml Amp) 中，37振荡培养约 12 小时至
4、对数生长后期。2. 取液体培养物 1.2 mL 于 Eppendorf 管中，然后 6000 g/min 离心 2 min，弃上清。3. 质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。4 -20保存 DNA 以备电泳检测。实验 2 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收材料、设备及试剂一、 材料质粒； Hind 酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose) 二、 设备水平式电泳装置 , 电泳仪 , 台式高速离心机 , 恒温水浴锅 , 微量移液枪 , 微波炉或电炉, 紫外透射仪。三、 试剂 50 TAE电泳缓冲液； 6 电泳载样缓冲液。操作步骤一、 DNA酶切反应1. 反应体系组成：10X Buffer 5 LHi
5、ndIII 1 LPlasmid 20 LH2O 24 L2. 混匀反应体系后，将eppendorf 管置于泡沫板上， 37水浴保温1 小时，使酶切反应完全。3. 停止反应，置于冰箱中保存备用。二、 琼脂糖凝胶电泳1. 取 50TAE缓冲液 4ml 加水至 200ml，配制成 1TAE稀释缓冲液，待用。2. 胶液的制备： 称取 0.4g 琼脂糖 , 置于 200ml 锥形瓶中 , 加入 50ml 1TAE稀释缓冲液，轻轻摇匀，溶胀30min，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。将冷却至50-60的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层
6、。4. 加样：取 10l 酶解液与 2l 6载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。5. 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在 40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。6. 染色观察和拍照。7. 回收条带，用回收试剂盒。步骤参见试剂盒说明书。实验 3 感受态细胞的制备、连接与转化材料、设备及试剂一、材料E. coliBL21/DE3 菌株: Amp-；无菌 eppendorf 管。二、 试剂LB液体培养基、 T4 DNA连接酶、氨苄青霉素、含Amp 的 LB固体培养基操作步骤一、 连接反应1. 取新的经灭菌处理的1.5ml
7、eppendorf管, 编号。 2. 体系组成：共 10l Buffer 1X 回收的 DNA 片段 100 ng T4 DNA ligase 1 L 去离子水 3. 顺序：去离子水、回收的DNA 片段、回收的 DNA 片段、 T4 DNA ligase 。4. 混匀后用小离心机将液体全部甩到管底, 于 16保温 8-24h。二、 E. coli感受态细胞转化三、1. 从 4冰箱中取 200l 感受态细胞悬液，立即置冰上。四、2. 加入连接产物溶液 ( 体积不超过 10l) ， 轻轻摇匀，冰上放置 30分钟。 3. 42水浴中热击 90秒, 热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。4. 向管中加入
8、 0.8ml LB液体培养基 (不含 Amp) ， 混匀后 37低转速振荡培养 45min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5. 将上述菌液摇匀后取200l 涂布于含 Amp的筛选平板上，正面向上放置5-10min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养 16-24 小时。同时做两个对照 : 对照组 1: (-)感受态细胞，此组正常情况下应不产生菌落。对照组 2: （+）1l 质粒，此组正常情况下应产生大量。实验四细菌的大量培养及外源蛋白的诱导操作步骤种子培养液的准备和外源蛋白的诱导表达 1. 取冻存的菌种，接种入装有5-10ml LB培养基的瓶中， 37，200
9、rpm/min 过夜培养后接入 100ml LB 培养基，接种浓度为2% 。 2. 37， 200rpm/min 培养 3 小时后， 将摇床温度调节到诱导温度20并平衡 30min，然后加入 IPTG至终浓度 0.4mM ，继续培养过夜。实验五细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化材料及试剂一、材料经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌、Ni-NTA介质（ Ni 亲和介质）二、试剂1缓冲液 : 20mmol/L Tris-HCl，pH8.0；2缓冲液配制10mM 、 50 mM 、100 mM 、250 mM 咪唑。操作步骤一（细菌破碎）1.将菌液转入大离心瓶中，离心收菌，4000rpm ，10min ；2.
10、倒掉上清，将菌体悬于10mL 缓冲液中，超声破碎细菌；3.将破菌产物离心，12000rpm ，15 min ；4. 分别对上清和沉淀留样，通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达情况和蛋白操作步骤二（目标蛋白纯化）1.处理介质： 向柱中加入0.5mL NiTA介质后，用5 倍柱体积的去离子水洗涤介质；再用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤介质；以下步骤根据蛋白性质在16下进行操作；2.加入蛋白样品：加入超声破菌后的蛋白上清样品；3.洗涤杂蛋白：用5 倍柱体积的10mM 咪唑洗涤介质；4.洗涤目标蛋白：用50 mM 、100 mM 、250 mM 不同浓度的咪唑各2.5ml ，梯度洗脱介质，回收流出液，保
11、存于4，用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。实验六目标蛋白的SDS-PAGE 鉴定试剂10十二烷基硫酸钠（SDS）贮存液、 30%丙烯酰胺单体液、浓缩胶缓冲液1M pH6.8 的 Tris 缓冲液和分离胶缓冲液1.5M pH8.8 的 Tris 缓冲液、 10%过硫酸铵、 TEMED 、Tris- 甘氨酸电泳缓冲液、样品处理液、染色液、脱色液操作步骤一、 蛋白电泳用胶的配制1. 安装玻璃板。2. 按表 1 中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。表 2-1 SDS 不连续电泳凝胶配方贮液分离胶 /12% 浓缩胶 /3% 30%丙烯酰胺单体贮液/mL 4.0 0.85 分离胶缓冲液1.5M
12、Tris/mL (pH8.8) 2.5 - 浓缩胶缓冲液1M Tris /mL(pH6.8) - 0.6 双蒸水 /mL 3.4 3.5 10的 SDS溶液 / L 100 50 10的过硫酸铵溶液/ L 15 8 TEMED/ L 10 8 3. 迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间。再在胶面上小心注入一层水（约23 mm）高，以阻止氧气进入凝胶溶液。4. 分离胶聚合完全后（约30 分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。5. 按表 1 中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立
13、即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。7. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1：1 体积比加入样品处理液，在 100加热 5min 以使蛋白质变性。8. 浓缩胶聚合完全后（ 30-60 min ），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入 Tris-甘氨酸电泳缓冲液。二、上样电泳1. 按预定顺序加样，加样量通常为10 25 L。电泳检测样品至少包括：蛋白Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、10mM咪唑冲洗液、 50mM 咪唑冲洗液、 100mM 咪唑冲洗液、 250mM 咪唑冲洗液。2. 将电泳装置与电源相接， 凝胶上所加电压为8V/ cm。 当染料前沿进入分离胶后
14、，把电压提高到 15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色染色时间：现温度下不少于2h。脱色需 310 小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录， 应尽快对凝胶进行拍照。四、实验结果与讨论1、质粒的提取、酶切电泳图谱图 1-1 第四组电泳图谱图 1-2 第三组电泳图谱1：酶切后的质粒2：质粒M ：Marker 1、2：质粒4、5：酶切后质粒观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱，可以发现酶切后的
15、质粒条带在原质粒条带的前面，并且质粒泳道条带比较多； 电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很明显地观察结果。原因分析：1 2 M （1） 质粒泳道条带较多的原因可能是， 质粒有的是超螺旋的， 有的可能是开环质粒，还有的形成各种聚合物，因此呈现多条条带。由于形成聚合物，分子量增大，因此条带在酶切条带的后面，条带最亮说明呈聚合状态的质粒的量是最多的。（2）Marker 条带模糊，拖尾现象严重可能的原因有：电泳缓冲液最好现用现配，可以提高电泳效果； 琼脂糖的浓度可能不是很适合，应尽可能摸索出该质粒最适浓度；电泳时电压不是最适电压， 而且电压不是很稳，电泳时间太长，可能是电泳仪器太老化了；
16、正确合适的上样量是条带清晰的保证，条带模糊可能是上样量太大； 有时候可能是由于DNA 被蛋白质或一些酶污染。2、转化结果（培养基）3、目标蛋白的 SDS-PAGE 鉴定图谱1）电泳检测样品包括：蛋白Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、50mM咪唑冲洗液、 100mM 咪唑冲洗液、 250mM 咪唑冲洗液。2）各个小组将 100mM 咪唑冲洗液在一块胶上一起电泳。3）只有第二小组做了对照电泳，将未加IPTG 诱导的菌液进行了相应的电泳。图 3-1 目标蛋白的 SDS-PAGE 鉴定图谱以 Marker 为临界线，右边是我们第四组的电泳图谱，左边是第三组的电泳图谱。阳性对照阳性对照是将质
17、粒转入感受态细胞，此组正常情况下应产生大量菌落。我们组的菌落效果总体比其他小组好，这与涂布平板时的一些注意事项有关，比如涂板的时候温度不要太高，无菌操作等。实验组实验组菌落很多，说明菌液浓度有点高，但是还是有明显的单菌落。但是菌落培养时间有点长， 影响因素可能有培养基、培养条件、感受态细胞的质量等等。阴性对照阴性对照是将酶切以后没有连接的质粒用于感受态细胞的转化。 由于细菌本身对外源 DNA 有降解作用，因此目标基因在细菌里不能表达， 因此不能看到菌落。3 4 穿柱液M 1 2 45kD 33kD 1：破菌后的原液2：50mM 咪唑冲洗液3：100mM 咪唑冲洗液4：250mM 咪唑冲洗液我们
18、以第三组的穿柱液作为标本2）我们从图谱中可以看出目标蛋白在50mM 咪唑洗脱液和 100mM 咪唑洗脱液中被洗脱下的量是比较多的，因此我们可以在50-10mM 之间寻找最适咪唑液的浓度。3）图 3-2 是未加 IPTG 诱导目标蛋白产生的对照，通过与图3-1 对比，可以发现在33kD-45kD 之间没有蛋白条带的产生，而加IPTG 的组有明显的蛋白质条带，因此可知在诱导外源基因表达时诱导剂是必不可少的。五、实验总结1）通过本次试验，学到了很多以前没有接触过的实验技术，也锻炼了一下以前学过的方法，更从实验中的小细节领悟到许多知识，总体来说收获很大。2）在实验中要养成良好的习惯，不忽略任何小细节，
19、加强时间观念，加强团队合作精神，及时纠正自己的不良操作规范，不懂得东西要及时请教他人。3）最后，感谢三位老师的悉心指导，感谢第四组所有成员的共同努力，感谢所有同学在实验过程中对我们的帮助。图 3-2 对照组，未加 IPTG 诱导结果分析：1）通过 SDS-PAGE 鉴定图谱 3-1 我们可以看出，通过IPTG 的诱导，我们成功得到了目标蛋白。通过与Marker 标准蛋白对比，可以看到目标蛋白分子量在33kD-45kD之间；原液中含有大量的目标蛋白，穿柱液中没有，说明目标蛋白被吸附到了层析柱中。通过第三组和第四组结果的比对，可以看到第四组在不同浓度咪唑洗脱液得到的目标蛋白的量比第三组多，有可能是因为第四组加样量多于第三组，或者是50mM 没有完全洗脱便开始100mM 咪唑进行洗脱。1：原液 2：穿透液3：50mM 咪唑洗脱液4、100mM 咪唑洗脱液5、250mM 咪唑洗脱液
