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1、前言中心法则：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 11 页第一章PCR 一、概念：PCR(聚合酶链式反应， Polymerase Chain Reaction ）是利用 DNA 在体外摄氏95 高温时变性会变成单链， 低温（经常是 60 C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（ 72 C 左右） ，DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖 (5-3)的方向合成互补链。二、原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA 聚合酶
2、的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，加入设计引物， DNA 聚合酶、 dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本原理类似于DNA 的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性 -退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板DNA 经加热至 95左右一定时间后，使模板DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA 与引物的退火
3、（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 60左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸： DNA 模板-引物结合物在 72、DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“ 半保留复制链 ” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -
4、第 2 页，共 11 页三、引物PCR反应中有两条引物，即5 引物和 3 引物。设计引物时以一条DNA 单链为基准（常以信息链为基准） ，5 端引物与位于待扩增片段5 端上的一小段 DNA序列相同； 3 端引物与位于待扩增片段3 端的一小段 DNA 序列互补。引物设计的基本原则引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右， Tm 值在 60比较好。引物碱基： G+C 含量以 40-60%为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。常用引物设计软件有： Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit 、DNAstar 等Tm 值：Tm 值就是 D
5、NA 熔解温度， 指把 DNA 的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的 DNA ，Tm 值不同。DNA 中 GC 含量越高，Tm 值越高，成正比关系。Tm 计算公式为： Tm = 4(G + C)+ 2(A + T) 四、示意过程：例如： Taq Plus DNA Polymerase(P201) 反应体系：DDW To 20 lTaq DNA Polymerase (5 U/l)1U-2U 10 Taq Plus Buffer(with 15mM MgCl2) 2l25mM MgCl2optional dNTP Mix (10 mM each) 0.4 l引物 F (10 M)0.8l引物
6、 R (10 M)0.8l模板 DNA 根据说明书提供的参考浓度选择反应程序：955 min (预变性 ) 9530 sec 30-35 循环6030 sec 7260 sec/kb 727 min (彻底延伸 ) 附：DNA 与 RNA 的区别？1、组成单位不同： DNA 的组成单位是脱氧核苷酸，RNA 的组成单位是核糖核苷酸，2、组成碱基不同： DNA 的组成碱基是 ATGC，RNA 的组成碱基是 AUGC 3、组成五碳糖不同： DNA 的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA 的组成五碳糖是核糖，4、空间结构不同： DNA 是双螺旋结构， RNA 一般是单链。5、功能不同： DNA 是遗传物质，
7、RNA 一般在细胞中不作为遗传物质。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 11 页第二章逆转录一、概念：逆转录 (reverse transcription) 是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程。以 DNA 为模板合成 RNA 的过程叫做转录，此过程与该流动方向（DNA 到 RNA）相反，故称为逆转录。二、原理：人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建 cDNA 文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。三、mR
8、NA：Messenger RNA (mRNA）又叫做信使 RNA，是一类在蛋白质合成时充当模板的 RNA。信使 RNA 是脱氧核糖核酸（ DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链RNA。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。 mRNA 存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。在真核生物中，最初转录生成的RNA 称为核不均一RNA （heterogeneous nuclear RNA，hnRNA） ，然而在细胞浆中起作用，作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的是 mRNA（messenger RNA ） 。hnRNA 是 mRNA 的未成熟前
9、体。两者之间的差别主要有两点：一是hnRNA 核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA 中，这些片段称为内含子（intron） ，而那些保留于mRNA 中的片段称为外显子（ exon） 。也就是说， hnRNA 在转变为 mRNA 的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是mRNA 的 5 末端被加上一个 m7pGppp 帽子，在 mRNA3 末端多了一个多聚腺苷酸（polyA）尾巴。mRNA 的核苷酸序列与DNA 序列相应，决定着合成蛋白质的氨基酸序列。三个核苷酸组成一个密码子， 每个密码子由三个前后相联的核苷酸组成，一个密码子只为一种氨基酸编码。共有64 个密
10、码子。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 11 页四、示意过程反应体系：DEPC 水To 20 l5 RT buffer 4ldNTP Mix (10 mM each) 1lOligo dT（50m ）/N6 1lRNase inhibitor （40U/l）1lReverse Transcriptase （200U/l）1lRNA 模板1ng-1g反应程序：逆转录5045min 逆转录酶失活855min 附：逆转录实验的注意事项：1、RNA 容易降解。 RNase A 酶非常稳定，是导致RNA 降解最主要的物质。它在一些极
11、端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。 用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。2、用 TRIZOL 或 RNA 提取试剂盒提取的总RNA，包括信使 RNA(mRNA) ，转运 RNA(tRNA) 和核糖体RNA(rRNA) 。其中核糖体RNA(rRNA) 占总 RNA 的80-85%，信使 RNA(mRNA) 只占 1-2%。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 11 页第三章荧光定量 PCR 一、概念
12、：是指在 PCR反应体系中加入能够指示DNA 片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，通过对 PCR 过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR 过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA 片段的初始浓度。二、信号产生原理三、重要概念1、荧光基线：指 PCR循环起始时，虽然荧光信号积累，但仍在仪器可以检测的灵敏度下，接近一条直线。2、荧光阈值：等于 3-18个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，处于 PCR 扩增的指数期，一般仪器会自动给出一个荧光阈值，也可人为调节。精选学习资料 - - -
13、 - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 11 页3、Ct 值：指荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。4、内参基因：又叫管家基因，是细胞中持续、恒量转录表达的基因，每个细胞中管家基因的转录水平相差很小，且始终和待测靶序列经过相同的处理过程，因而可以校正各个操作环节如组织样本的多少、RNA 提取过程的得率及完整度、逆转录效率、 RNA 定量过程产生的误差，将靶基因归一化到相同细胞数比较。常用的内参基因有GAPDH、 -Actin、 -Tubulin 等。四、分类目前常用的定量方法有两种： 绝对定量和相对定量。 两者的区别在于制作标准曲线的标准品的靶
14、基因拷贝数是否已知。1、绝对定量： DNA 标准品的拷贝数是已知的，可以根据标准曲线和待测样本的Ct 值，计算出待测样本靶序列的拷贝数。2、相对定量： DNA 标准品的拷贝数是未知的，只已知稀释倍数，可以根据各待测样本和相应内参基因的Ct 值，计算出待测样本靶序列的拷贝数之间相差的倍数。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 11 页第四章克隆和点突变一、传统克隆概念：一般意义上，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA 序列中插入外源的目的基因， 以质粒为载体， 将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的
15、过程。二、实验流程：1）线性化载体的制备2）插入片段 PCR 扩增3）进行重组反应4）反应产物转化、涂板可概括为切、连、转、选。切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA ，或者切出目的基因； 连是指用 DNA 连接酶将目的 DNA 同载体 DNA 连接起来，形成重组的 DNA 分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA 分子的个体。附：基本概念1、质粒载体：质粒是独立于细菌染色体外自我复制的遗传因子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，一般包括三部分：遗传标记基因（抗生素抗性基因），复制区，多酶位点区域。天然的质粒
16、都是环状双链DNA ，大小从几个到数百个kb。2、限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶是可以识别DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶，简称限制酶。限制性内切酶识别DNA 序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 11 页侧（如 EcoR I、BamH I、Hind 等） ，因而可形成粘性末端，另一些类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal 、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。三、点突变是指通过聚合酶链式反应 （PCR
17、）等方法向目的 DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。通俗的说，通过设计引物，并利用 PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 11 页第五章细胞生物学一、细胞凋亡：细胞凋亡（ apoptosis）指为
18、维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的， 有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究， 已成为生物学、 医学研究的一个热点。 因此，细胞凋亡的检测是实验研究过程中的重要手段。用于早期凋亡： Annexin V Apoptosis Detection Kit 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。 Annexin V 是一种分子量为 3536 kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与
19、凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行绿色荧光 (FITC 或 EGFP)标记，以标记了的Annexin V 作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞， PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与 PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - -
20、 - -第 10 页，共 11 页用于晚期凋亡： TUNEL Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡晚期的一个显著特点是细胞染色体的DNA 被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180-200 bp 的整倍数的片段。 TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法 应 用 末 端 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 转 移 酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞的断裂DNA 的 3 -OH 末端催化掺入荧光分子标记的dUTP，使得凋亡细胞可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定
21、量。二、细胞增殖周期：细胞分裂具有周期性， 即连续分裂的细胞， 从一次分裂完成时开始， 到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期细分为以下几个阶段：G0 期：分裂停止期，具有分裂能力的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期；G1 期：DNA 合成准备期，开始合成细胞生长需要的各种蛋白质，糖类，脂类、RNA 等生化物质，细胞DNA 总量不变，主要为S期做准备；S期：DNA 合成期，此阶段 DNA 数目加倍；G2 期：分裂准备期， DNA 合成已经终止，但是蛋白质、RNA 等仍在合成，主要为 M 期做准备；M 期：分裂期，细胞开始分裂，一分为二，分裂结束后，再次进入G0 期，循
22、环分裂过程。三、细胞转染：转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、 化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、 显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多， 如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法， 应该具有转染效率高、 细胞毒性小等优点。 病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂， 常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点， 无论采用哪种转染技术， 要获得最优的转染结果， 可能都需要对转染条件进行优化。 影响转染效率的因素很多， 从细胞类型、 细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 11 页
