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1、分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件现现代代分分子子生生物物学学的的快快速速发发展展，得得益益于于上上个个世世纪纪中中叶叶以以来来研研究究方方法法、特特别别是是基基因因操操作作和和基基因工程技术的进步。因工程技术的进步。基基因因操操作作主主要要包包括括DNA分分子子的的切切割割与与连连接接、杂杂交交、电电泳泳、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表达达、定定点点突突变变和和PCR扩扩增增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的
2、核心技术。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的
3、基因事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。区别于其它技术的根本特征。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是带者、即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；质，解决了遗传的物质基础问题；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分
4、子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制型和半保留复制机制, ,解决了基因的自我复解决了基因的自我复制和世代交替问题；制和世代交替问题；分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件三三、5050年年代代末末至至6060年年代代，相相继继提提出出了了“中中心心法法则则”和和操操纵纵子子学学说说, ,成成功功地地破破译译了了遗遗传传密密码码，阐阐明了遗传信息的流动与表达机制。明了遗传信息的流动与表达机制。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能能够够识识别别DNA上上的的特特定
5、定碱碱基基序序列列并并从从这这个个位位点切开点切开DNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRI是是Boyer实实验验室室在在1972年年发发现现的的，它它能能特特异异性性识识别别GAATTC序序列列，将将双双链链DNA分分子子在在这这个个位位点点切切开开并并产产生生具有粘性末端的小片段。具有粘性末端的小片段。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件（二）基因克隆的载体
6、（二）基因克隆的载体 载体三要素：载体三要素：自我复制能力；自我复制能力；携带外源基因片段大小；携带外源基因片段大小；插入位点多少；插入位点多少；易于鉴定识别程度。易于鉴定识别程度。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体质粒载体低低拷拷贝贝数数严严紧紧型型复复制制控控制制的的大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒载载体，平均每个寄主细胞仅有体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。个拷贝。长长9.09kb，带带有有四四环环素素抗抗性性基基因因（tetr）及及EcoRI、 HindIII、 BamHI、 SalI、 XhoI、PvuII以以及
7、及SmaI等等7种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的单单酶酶切切位位点点，在在HindIII、BamHI和和SalI等等3个位点插入外源基因，会导致个位点插入外源基因，会导致tetr失活。失活。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件大肠杆菌大肠杆菌pSC101质质粒载体示粒载体示意图。意图。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件是是第第一一个个真真核核基基因因克克隆隆载载体体。缺缺点点：它它是是一一种种严严紧紧型型复复制制控控制制的的低低拷拷贝贝质质粒粒，从从带带有有该该质质粒粒的寄主细胞中提取的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。，产量很低。分子学分
8、子学DNARNADNARNA技术课件技术课件2、ColE1质粒载体质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。一一般般情情况况下下，当当培培养养基基中中氨氨基基酸酸被被耗耗尽尽，或或是是在在细细胞胞培培养养物物中中加加入入氯氯霉霉素素以以抑抑制制蛋蛋白白质质的的合合成成，寄寄主主染染色色体体DNA的的复复制制便便被被抑抑制制，细胞的生长也随之停止。细胞的生长也随之停止。而而松松弛弛型型质质粒粒DNA却却继继续续复复制制数数小小时时，使使每每个个 寄寄 主主 细细 胞胞 中中 ColE1质质 粒粒 的的 拷拷 贝贝 数数 达达 到到10003000个，占细胞总个，占细胞总DN
9、A的的50%左右。左右。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件3、pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的：由三个不同来源的部分组成的：第第一一部部分分来来源源于于pSF2124质质粒粒易易位位子子Tn3的的氨氨苄青霉素抗性基因（苄青霉素抗性基因（AmpR）；）；第第二二部部分分来来源源于于pSC101质质粒粒的的四四环环素素抗抗性性基基因（因（tetr）；）；第第三三部部分分则则来来源源于于ColE1的的派派生生质质粒粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori）。）。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件AmpR分子学分子学DNARNADNARN
10、A技术课件技术课件优优点点是是具具有有较较小小的的分分子子量量，其其长长度度为为4363bp。不不仅仅易易于于纯纯化化，而而且且即即使使携携带带上上一一段段6-8kb的的外外源源DNA片段，操作起来仍较为便利。片段，操作起来仍较为便利。具具有有两两种种抗抗生生素素抗抗性性基基因因以以用用作作转转化化子子的的选选择择记记号号。有有较较高高的的拷拷贝贝数数，若若经经过过氯氯霉霉素素扩扩增增，每每个个细细胞胞中中可可累累积积1000300010003000个个拷拷贝贝，为为重重组组体体DNADNA的制备提供了极大的方便。的制备提供了极大的方便。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件4、
11、pUC质粒载体（包括四个部分）：质粒载体（包括四个部分）：(i)来自来自pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（ori）；）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampr）；）；(iii)大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖酶酶基基因因（lacZ）的的启启动动子子及及其其编编码码-肽肽链链的的DNA序序列列，此此结结构构特特称为称为lacZ基因；基因；(iv)位位于于lacZ 基基因因中中的的靠靠近近5-端端的的一一段段多多克克隆隆位位点点（MCS）区区段段，外外源源基基因因插插入入后后破破坏了坏了lacZ 基因的功能。基因的功能。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件
12、优点：优点： 更更小小的的分分子子量量和和更更高高的的拷拷贝贝数数。在在pBR322基基础础上上构构建建pUC质质粒粒载载体体时时，仅仅保保留留下下其其中中的的氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因及及复复制制起起点点，其其分分子子小小了了许许多多，pUC8为为2750bp，pUC18为为2686bp。由由于于缺缺失失rop基基因因，pUC质质粒粒不不经经氯氯霉霉素素扩扩增增时时，平均每个细胞即可达平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件可可用用组组织织化化学学方方法法检检测测重重组组体体。pUC8质质粒粒结结构构中中具具有有来来自自大大肠
13、肠杆杆菌菌lac操操纵纵子子的的lacZ基基因因，所所编编码码的的-肽肽链链可可参参与与-互互补补作作用用。因因此此，可可用用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。显色法实现对重组体转化子的鉴定。具具有有多多克克隆隆位位点点MCS区区段段，可可以以把把具具两两种种不不同同粘粘性性末末端端（如如EcoRI和和BamHI）的的外外源源DNA片片段直接克隆到段直接克隆到pUC8质粒载体上。质粒载体上。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5、 pGEM-3Z质粒质粒 长长度度为为2743bp，编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性基因和一个性基因和一个lacZ基因。基因。
14、含含有有两两个个噬噬菌菌体体启启动动子子（T7和和SP6），为为RNA聚聚合合酶酶的的附附着着作作用用提提供供了了特特异异性性的的识识别别位位点点。加加入入T7或或SP6 RNA聚聚合合酶酶，所所克克隆隆的的外源基因便会转录出相应的外源基因便会转录出相应的mRNA。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件6、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 指指由由人人工工构构建建的的具具有有两两种种不不同同复复制制起起点点和和选选择择记记号号，可可在在两两种种不不同同的的寄寄主主细细胞胞中中存存活活和和复复制制的的质质粒粒载载体体。由由于于这这类类质质
15、粒粒载载体体可可以以保保证证外外源源DNA序序列列在在不不同同物物种种的的细细胞胞之之间间得得到到扩扩增增，能能在在原原核核和和真真核核细细胞胞之之间间往往返返穿穿梭梭，具有广泛的用途。具有广泛的用途。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件7、pBluescript噬菌粒载体噬菌粒载体 pBluescript是是指指由由Stratagene公公司司发发展展的的一一类类从从pUC载载体体派派生生而而来来的的噬噬菌菌粒粒载载体体，简简称称为为pBS（+/-），如如今今则则更更多多地地叫叫作作pBluescript KS（+/-）或）或pBluescript SK（+/-）。）。分子学
16、分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件SK表表示示多多克克隆隆位位点点区区的的取取向向，即即lacZ基基因因是是按照按照SacIKpnI的方向转录；的方向转录；（+/ -）表表示示单单链链噬噬菌菌体体f1复复制制起起点点的的两两种种相相反的取向。反的取向。f1（+）起起点点表表示示当当pBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体和和辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细胞胞时时，能能够够回回收收到到lacZ基基因因的的有有意意义义链链DNA；而而f1（-）起起点点则则表表示示当当pBluesript噬噬菌菌粒粒载载体体与与辅辅助助
17、噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细胞胞时时，可可回回收收到到lacZ基基因因的的无无意意义义链链DNA。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件(i)在在多多克克隆隆位位点点区区（MCS）的的两两侧侧，存存在在一一对对T3和和T7噬噬菌菌体体的的启启动动子子，用用以以定定向向指指导导插插入入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具具有有单单链链噬噬菌菌体体M13或或f1的的复复制制起起点点和和一一个个来来自自ColE1质质粒粒的的复复制制起起点点，保保证证pBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体在在有有或或无无辅辅助助噬噬菌菌体体共共感
18、感染染的的不不同同情情况况下下，按按照照不不同同的的复复制制形形式式分分别别合合成成出出单单链链或双链或双链DNA；分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件(iii）编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，作作为为转化子克隆的选择标记；转化子克隆的选择标记；(iv)含含有有一一个个lacZ基基因因，可可以以按按照照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件LacZ编码编码-半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端氨基端146个氨基酸的个氨基酸的-肽， IPTG（异丙基（异丙基
19、- -D-硫代半乳糖苷）诱硫代半乳糖苷）诱导导该基因表达，合成的基因表达，合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽能与肽能与宿主细胞所编码的缺陷型宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶相互补，半乳糖苷酶相互补，产生有活性的产生有活性的-半乳糖苷酶，能水解外源加入半乳糖苷酶，能水解外源加入培养基中的培养基中的X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使生长于含糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使生长于含X-gal培养基中的转化菌落呈蓝色。培养基中的转化菌落呈蓝色。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件重组重组DNADNA操作过程示意图操作过程示意图分子学分
20、子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。中进行繁殖。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件具备自主复制能力的具备自主复制能力的
21、DNA分子就是分子克隆分子就是分子克隆的载体（的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件获获得得了了用用外外源源DNA片片段段和和载载体体分分子子重重组组而而成成的的杂杂种种DNA分分子子后后，还还必必须须通通过过一一个个被被称称为为细细菌菌转转化化的的过过程程将将其其重重新新导导入入到到寄寄主主细细胞胞中中，才能保证重组才能保证重组DNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-3）。）。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图
22、5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 2 DNA操作技术操作技术5. 2. 1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自自 从从 琼琼 脂脂 糖糖 （ agarose） 和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（polyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNA的的凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一种种分分析析鉴鉴定定重重组组DNA分分子子及及蛋蛋白白质质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课
23、件技术课件一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净电电荷荷数数成正比，与片段大小成反比。成正比，与片段大小成反比。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所以以，DNA和和RNA又又被被称称为为多多聚聚阴阴离离子子（polyanions）
24、，在在电电场场中中向向正正电电极极的的方向迁移。方向迁移。由由于于糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷，因因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，
25、孔隙越小，其分辨能力就越强。度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图
26、图5-4 5-4 溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易易于于鉴定。鉴定。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 2. 2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外
27、构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件细菌转化（细菌转化（transformation），是指一种细菌菌），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状而导致性状特征发生遗传改变的过程。特征发生遗传改变的过程。提供转化提供转化DNA的菌的菌株叫作供体菌株，接受
28、转化株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则的细菌菌株则被称为受体菌株。被称为受体菌株。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取理，增加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞细胞被称作感受态细胞（competent cells）。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件CaCl2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经
29、经0预预处处理理的的低低渗渗CaCl2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易与外源易与外源DNA相粘附。相粘附。将将该该体体系系转转移移到到42下下做做短短暂暂的的热热刺刺激激，外外源源DNA就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可达达到到51062107个个转转化化子子/g超超螺螺旋质粒旋质粒DNA。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨
30、膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细进入细胞质。胞质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E. coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（21010/ml）置置于于特特制制的的电电极极杯杯中中进进行电击。行电击。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件获获 得得 最最 大大 转转 化化 效效 率率 时时 场场 强强 一一 般般 为为12.515kV/cm，时时间间跨跨度度一一般般为为4.55.5毫毫秒。秒。电电击击转转
31、化化与与温温度度有有关关，一一般般在在04进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacZ基基因因，多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素（常常用用的的抗抗生生素素包包括括氨氨苄苄青青霉霉素素、卡卡那那霉霉素素和和四四环环素素等等）的的选选择择性性培培养养基基结结合合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 2. 3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNA序序列列最最常常用用的方法。的方法。PCR反反应应的的模模板板DNA若若是是基基因因组组上
32、上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic PCR，若若是是mRNA反反转转录产生的录产生的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件PCR技术的原理技术的原理首首先先将将双双链链DNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNA分分子子，DNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件 DNA解链（变性）解链（变性） 引物与模
33、板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNA区区段段的的拷拷贝贝数数，理理论论上上的的最最高高值值应应是是2n,实得实得1.8n.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量的比较量的
34、比较分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件将将含含有有待待扩扩增增DNA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（94）环环境境下下加加热热1分分钟钟，使使双双链链DNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNA。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件94加热，淬火加热，淬火分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件降降低低反反应应温温度度（退退火火，约约50），约约1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA结结合合在在靶靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。分子学分子学DNARNADNAR
35、NA技术课件技术课件5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到72左左右右保保温温1-数数分分钟钟，在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按53方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNA互补链。互补链。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件PCR扩增，扩增，72左右左右, 按按每每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复分子学分子学DNARNADNARNA技
36、术课件技术课件常规常规PCR技术能扩增两引物之间的技术能扩增两引物之间的DNA区段，区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之区段之外的未知外的未知DNA序列，这就需要应用序列，这就需要应用反向反向PCR（reverse PCR）技术）技术。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件 先用一种在靶先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的区段上没有识别位点的核酸内切限制酶，从距靶核酸内切限制酶，从距靶DNA区段有一定距离区段有一定距离的两侧位置切割的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶分子内连接成
37、环形。根据已知的靶DNA序列按序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶增的是位于靶DNA区段两侧的未知区段两侧的未知DNA序列。序列。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件反反向向PCR的的基基本本操操作作程程序序。波波纹纹线线表表示示靶靶DNA区区段段，箭箭头头表表示示限限制制性性内内切切酶酶位位点点，分分 别别 用用 方方 框框 表表 示示 靶靶DNA区区段段的的左左侧侧和和右右侧序列。侧序列。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件用用一一种种在在靶靶序序列列上上没没有有酶酶切切位位点点的的核核酸酸限限制
38、制性内切酶消化性内切酶消化DNA；产产生生大大小小不不同同的的线线性性DNA片片段段群群体体，其其中中靶靶DNA区区段段的的DNA分分子子长长度度不不超超过过23kb，经经连接后重新环化；连接后重新环化；按按靶靶序序列列设设计计的的一一对对引引物物与与互互补补序序列列退退火火结结合，其延伸方向如箭头所指；合，其延伸方向如箭头所指；分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件经经PCR扩扩增增产产生生的的主主要要是是线线性性双双链链DNA分分子子，它它是是由由左左侧侧序序列列和和右右侧侧序序列列首首尾尾连连接接而而成成，其其接接点点是是（1）中中所所用用的的限限制制性性内内切切酶酶的的识
39、识别别位位点。点。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Inter-Laced Polymerase Chain Reaction）热不对称交错多聚酶链式反应。热不对称交错多聚酶链式反应。常用于扩增常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。插入位点特异性分子证据。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件TAIL-PCR主要用于分离毗邻已知序列的未知主要用于分离毗邻已知序列的未知DNA序列，使用两个长度不同因而退火温度序列，使用两个长度不同因
40、而退火温度也不相同的引物。高退火温度的也不相同的引物。高退火温度的PCR循环有循环有利于由长引物引起的利于由长引物引起的DNA扩增，低温循环时扩增，低温循环时两个引物的扩增效率基本相同。两个引物的扩增效率基本相同。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件TAIL-PCR使用一套巢式（使用一套巢式（nest）特异引物）特异引物（T-DNA边界引物，边界引物，TR）和一个短的随机简并）和一个短的随机简并引物（引物（AD）。）。第一轮反应（第一轮反应（Primary reaction）是）是TAIL-PCR的重要环节，先进行的重要环节，先进行5轮高严谨性循环，轮高严谨性循环，特异性引物与
41、模板退火，只能发生单引物循环，特异性引物与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增。上游侧翼序列得到线性扩增。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件大幅度降低退火温度，使大幅度降低退火温度，使AD及及TR均与模板均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环。相结合，指数扩增一个循环。此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共共15个循环。特异性序列（两端分别拥有个循环。特异性序列（两端分别拥有TR1和和AD序列）和非特异性序列序列）和非特异性序列I（只有（只有TR1，没，没有有AD序列）大大超过特异性序列序列）大大超过
42、特异性序列II （两端均为（两端均为AD序列）。序列）。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件PCRII中，特异性序列再次被优先扩增，经稀中，特异性序列再次被优先扩增，经稀释的非特异性序列释的非特异性序列I也已大为降低，此时已没也已大为降低，此时已没有明显的背景片段了。有明显的背景片段了。PCRIII是真正意义上的是真正意义上的PCR，共，共20个循环，个循环，进一步扩增特异性序列。进一步扩增特异性序列。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件TAIL PCR 反反应流程应流程分子学分子学DNARNADNARNA技术
43、课件技术课件RACE技技术术（rapid amplification of cDNA ends）在在已已知知cDNA序序列列基基础础上上克克隆隆5或或3端端缺缺失失序序列列的的技技术术。根根据据已已知知序序列列设设计计基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物，由由该该片片段段向向外外侧侧进进行行PCR扩扩增增得得到到目目的的序序列列。用用于于扩扩增增5端端的的方方法法称称为为5RACE，用于扩增，用于扩增3端的称为端的称为3RACE。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5 RACE在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性在反转
44、录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（引物（GSP1）启始）启始cDNA第一条链合成。第一条链合成。RNase降解模板链降解模板链mRNA，纯化第一链。，纯化第一链。用末端转移酶在用末端转移酶在cDNA链链3端加入连续的端加入连续的dCTP。以连有以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部的锚定引物和基因片段内部特异的特异的nested引物进行引物进行PCR扩增，得到目的扩增，得到目的片段，用片段，用nest PCR检测。检测。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件3RACE1、用用oligo(dT)锚锚定定引引物物启启始始cDNA第第一一链的合成链的合成.2、降解模板
45、、降解模板mRNA.3、用用通通用用锚锚定定引引物物和和基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物进进行行PCR扩扩增增得得到到 目目 的的 3片片 段段 ， 用用nest PCR法检测法检测.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 2. 4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由由于于PCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。90年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR， 利利用用荧荧光光检检测测PCR仪仪绘绘制制DNA扩扩增增过过程程中中的的累累积积速速率率动动态态变变化化
46、图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产物丰度时变异系数较大的问题。产物丰度时变异系数较大的问题。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件混混合合在在PCR反反应应液液中中的的荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随随着着新新合合成成DNA片片段段的的增增加加，由由于于结结合合到到DNA上上的的荧荧光光探探针针增增加加，被被激激发发产产生生的的荧荧光光相应增加。相应增加。非非序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR Green I , 激激发发光波长光波长520nm。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课
47、件技术课件SYBR Green I作作探探针针的的实实时时定定量量PCR实实验验过程图示过程图示 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件为为确确保保荧荧光光检检测测的的确确实实是是靶靶DNA，又又设设计计了了仅能与目的仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。特异结合的荧光探针。TaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNA序序列列中中间间部部位位结结合合的的单单链链DNA，长长50bp-150bp，该该DNA
48、的的5和和3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不同同荧荧光光基基团团，由由于于彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRET）作作用用下下发发生生荧荧光光淬淬灭灭，因因而检测不到荧光。而检测不到荧光。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件随随着着PCR反反应应的的进进行行，TaqMan 探探针针结结合合到到目目的的DNA序序列列上上，并并且且会会被被具具有有外外切切酶酶活活性性的的Taq DNA聚聚合合酶酶逐逐个个切切除除而而降降解解。切切下下来来的的荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭的的束束缚缚，会会在在激激发发光光下下发发出
49、出荧荧光光，因因此此，产产生生的的荧荧光光强强度度直直接反映了所扩增靶接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件TaqMan探探针针 实实 时时 定定量量 PCR技技术术 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Ct值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超过过设设定定阈阈值值时时，PCR反反应应所所需需的的循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，可可以以确定样品中待检测靶确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-11用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因法分
50、析未知样品靶基因的绝对表达量。的绝对表达量。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件线性范围的确定线性范围的确定分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 2. 5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把把某某种种生生物物的的基基因因组组DNA切切成成适适当当大大小小，分分别别与与载载体体组组合合，导导入入微微生生物物细细胞胞，形形成成克克隆隆。汇汇集集包包含含基基因因组组中中所所有有DNA序序列列的的克克隆隆（理理论论上上每每个个序序列列至至少少有有一一个个代代表表
51、），这这样样的的克克隆片段的总汇，称为基因组隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。文库。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Clark和和Carbon于于1975年提出公式：年提出公式：N=ln(1-p) / ln(1-f)式式中中：N表表示示一一个个基基因因组组文文库库所所应应该该包包含含的的重重组组克克隆隆数数目目；p表表示示所所期期望望的的靶靶基基因因在在文文库库中中出出现现的的概概率率；f表表示示重重组组克克隆隆平平均均插插入入片片段的长度与基因组段的长度与基因组DNA总长的比值。总长的比值。为为获获得得整整个个基基因因簇簇或或一一个个基基因因及及其其两两翼翼延延伸伸序
52、序列列，基基因因组组文文库库中中的的DNA片片段段常常大大于于20kb。以以 人人 为为 例例 ， 其其 基基 因因 组组 大大 小小 为为 3109bp若若p=99%，平平均均插插入入片片段段大大小小为为20kb，则则N=6.7105。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件构构建建基基因因组组文文库库最最常常用用的的是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约1520kb）和和限限制制性性内内切切酶酶部部分分消消化化法法。例例如如用用识识别别4个个核核苷苷酸酸的的核核酸酸限限制制性性内内切切酶酶Sau3A，与与BamHI是是一一对对同同尾尾酶酶消消化化DNA，由由Sau3A酶
53、酶切切产产生生的的DNA片片段段可可插插入入到到经经BamHI消化的消化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-13 用用Sau3A限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化真真核核生生物物基基因因组组DNA并并利利用用 噬噬菌菌体体载载体体构构建建基基因因组文库的过程图示。组文库的过程图示。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件噬噬菌菌体体作作为为克克隆隆载体载体分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件此此外外，还还有有很很多多大大容容量量克克隆隆载载体体，如如柯柯斯斯质质粒粒、细细菌菌人人工工染染色色体体（BAC）
54、、P1源源人人工工染染色色体体（PAC）、酵酵母母人人工工染染色色体体（YAC）等等都都可可用用于基因组文库的构建。于基因组文库的构建。它它们们的的优优点点是是可可以以插插入入更更大大片片段段DNA，但但是是稳稳定定性性一一般般较较差差，在在大大量量复复制制的的过过程程中中容容易易出出现现缺失现象。操作也相对较困难。缺失现象。操作也相对较困难。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 3 RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组DNA庞庞大大，有有大大量量重重复复序序列列，很很难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA来来自自反反转转录录的
55、的mRNA，无无冗冗余余序序列列，通通过过筛筛选选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。文库，可较快地分离到相关基因。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件细细胞胞中中的的总总RNA包包括括mRNA，rRNA ，tRNA以以及一些小及一些小RNA（sRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：，其中：80%-85%为为rRNA15%-20%为为tRNA及及sRNAmRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是别是2
56、8S和和18S特征性条带是电泳鉴定总特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Li Q et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48: 114-120.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化过程简图。化过程简图。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件RNA的的浓浓度度和和纯纯度度可可以以通通过过测测定定其其OD260和和OD280 来来 判判 断断 。 OD260为为 1时时 相相 当
57、当 于于 浓浓 度度 为为40g/ml，而而OD260/OD280的的比比值值如如果果在在1.8-2.0之之间间，表表示示所所提提取取的的RNA纯纯度度较较好好，如如果果样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污污染染，则则OD260/ OD280的的比比值值将明显低于将明显低于1.8。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件由由于于RNA分分子子敏敏感感脆脆弱弱，在在自自然然状状态态下下难难以以被被扩扩增增，为为了了研研究究mRNA所所包包含含的的功功能能基基因因信信息息，一一般般将将其其反反转转录录成成稳稳定定的的DNA双双螺螺旋旋（cDNA，complementary DNA），
58、再再插插入入到到可可以以自自我复制的载体中。我复制的载体中。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件因因为为绝绝大大多多数数大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞都都会会切切除除带带有有5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶的的外外源源DNA，所所以以实实验验中中常常选选用用mcrA- mcrB-菌株以防止菌株以防止cDNA被降解。被降解。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件
59、cDNA文库的构建文库的构建cDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用文库常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescript载载体的全部序列。体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质
60、粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件基因文库的筛选基因文库的筛选基基因因文文库库的的筛筛选选是是指指通通过过某某种种特特殊殊方方法法从从基基因因文文库库中中鉴鉴定定出出含含有有所所需需重重组组DNA分分子子的的特特定定克克隆隆的的过过程程。筛筛选选的的方方法法有有很很多多种种，如如核核酸杂交法，酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件1、核酸杂交法：、核酸杂交法： 核核酸酸杂杂交交法法以以其其广广泛泛的的适适用用性性和和快
61、快速速性性成成为为基基因因文文库库筛筛选选中中最最常常用用的的一一种种方方法法，用用放放射射性性标标记记的的特特异异DNA探探针针适适用用于于高高密密度度的的菌菌落落杂杂交筛选。交筛选。 将将待待筛筛选选菌菌落落转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，适适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件取取出出已已经经长长有有菌菌落落的的膜膜，用用碱碱液液处处理理，使使菌菌落落发发生生裂裂解解，DNA随随之之变变性性。用用蛋蛋白白酶酶K处处理理硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜去去除除蛋蛋白白质质，形形成成菌菌落落DNA的
62、印迹。的印迹。80烘烘烤烤滤滤膜膜，将将DNA固固定定在在膜膜上上。将将滤滤膜膜与与放放射射性性标标记记的的DNA或或RNA探探针针杂杂交交，通通过过放放射射性性自自显显影影显显示示杂杂交交结结果果。通通过过对对应应于于平平板上的位置找到相应克隆。板上的位置找到相应克隆。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件2、PCR筛选法筛选法将将整整个个文文库库（以以质质粒粒的的形形式式或或者者细细菌菌的的形形式式均均可可）保保存存在在多多孔孔培培养养板板上
63、上，用用设设计计好好的的目目的的基基因因探探针针对对每每个个孔孔进进行行PCR筛筛选选，鉴鉴定定出出阳阳性性的的孔孔，把把每每个个阳阳性性孔孔中中的的克克隆隆再再稀稀释释到到次次级级多多孔孔板板中中进进行行PCR筛筛选选。重重复复以以上上程程序序，直直到到鉴鉴定定出与目的基因对应的单个克隆为止。出与目的基因对应的单个克隆为止。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件3、免疫筛选法、免疫筛选法该该法法仅仅适适用用于于对对表表达达文文库库的的筛筛选选。若若实实验验中中靶靶基基因因的的序序列列完完全全未未知知但但是是有有针针对对该该基基因因产产物物的的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。特
64、异性抗体，就可以采用免疫筛选法。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图5-18 噬噬菌菌体体表表达达文文库的的免免疫疫化化学学筛选法法示意示意图 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 4 SNP的理论与应用的理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism的的缩缩写写，即即单单核核苷苷酸酸多多态态性性，指指基基因因组组DNA序序列列中中由由于于单单个个核核苷苷酸酸（A，T，C和和G）的的突突变变而引起的多态性。而引起的多态性。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 4. 1 SNP概述概述科科学学上上把把染染
65、色色体体DNA同同一一位位置置上上的的每每个个碱碱基基类类型型叫叫做做一一个个等等位位位位点点。SNP是是基基因因组组中中最最简简单单最最常常见见的的多多态态性性形形式式，具具有有很很高高的的遗遗传传稳稳定定性性。SNP检检测测和和分分析析技技术术已已经经成成为为继继限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性（RFLP）和和微微卫卫星星标标记记（SSR）之之后的第三代遗传标记。后的第三代遗传标记。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图5-19 5-19 染色体上共同染色体上共同遗传的的SNPSNP组合。合。图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上
66、而且距离很近，SNP1有等位位点有等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。因。因此，染色体对有两种可能的此，染色体对有两种可能的SNP组合。组合。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件单单倍倍倍倍型型型型基因基因基因基因型型型型外外外外显显子子子子IVIV内含子内含子内含子内含子IVIV5757130130165165232232236236H1H1H-4H-4T TT TA AT TT TH-3H-3T TT TA AT TT TH-1H-1T TT TA AT TT TE-2E-2T TT TA AT TT TB-73B-73T TT TA AT TT TH
67、2H2MO17MO17C CT TA AC CC CB-1B-1C CT TA AC CC CH3H3H60H60C CC CT TT TT T玉米玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较不同单倍型和基因型之间的多态性比较分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件据据估估计计，人人类类DNA中中每每300-1000个个碱碱基基对对就就有有一一个个SNP，因因此此，一一个个人人类类个个体体大大约约携携带带300万万-1000万万个个SNPs。位位于于染染色色体体上上某某一一区区域域的的一一组组相相关关联联的的SNP等等位位位位点点被被称称作作单单倍倍型型（haploty
68、pe），相相邻邻SNPs的的等等位位位位点点倾向于以一个整体遗传给后代。倾向于以一个整体遗传给后代。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件根据根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区SNP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸
69、序列）和非同义基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列的改变使氨），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 4. 2 SNP的检测技术的检测技术通过通过DNA测序法获得新的测序法获得新的SNP。基基因因分分型型（genotyping）是是指指利利用用数数据据库库中中已已有有的的SNP进进行行特特定定人人群群的的序序列列和和发发生生频频率率的的研研究究，主主要要包包括括基基因因芯芯片片技技术术、Taqman技技术术、分分子子信信标标（mole
70、cular beacons）技技术术和焦磷酸测序法（和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件1基因芯片技术基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。列杂交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样样品的复杂性，有
71、些品的复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件2Taqman技术技术PCR反反应应系系统统中中加加入入2种种不不同同荧荧光光标标记记的的分分别别与与两两个个等等位位基基因因配配对对的的探探针针。随随着着PCR的的进进行行，与与模模板板完完全全配配对对的的探探针针逐逐步步被被Taq DNA聚聚合合酶酶的的53外外切切活活性性所所切切割割，荧荧光光基基团团与与3端端的的淬淬灭灭基基团团分分离离，荧荧光光基基团团被被激激活活。不不完完全全配配对对的的探探针针（代代表表另另一一种种等等位位基基因因）不不能能被被有有效效切切割，供体荧光基团依然被淬灭
72、。割，供体荧光基团依然被淬灭。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件3分子信标（分子信标（molecular beacon）技术）技术是是一一种种呈呈茎茎环环结结构构的的荧荧光光标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸，环环状状区区与与靶靶序序列列特特异异性性结结合合，茎茎干干区区由由5-8个个碱碱基基对对组组成成，5端端带带有有荧荧光光发发生生基基团团，3端端带带有有荧荧光光淬淬灭灭基基团团。自自由由状状态态时时，分分子子信信标标呈呈发发卡卡式式结结构构，荧荧光光几几乎乎完完全全淬淬灭灭。与与靶靶分分子子相相结结合合时时，荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团之之间间的的距距离离增大，分子信
73、标的荧光恢复。增大，分子信标的荧光恢复。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Taqman技技术（上）及（上）及分子信分子信标技技术（下）原（下）原理示意理示意图。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 5 基因克隆（基因克隆（clone）技术）技术在在多多细细胞胞的的高高等等生生物物个个体体水水平平上上，克克隆隆表表示示由由具具有有相相同同基基因因型型的的同同一一物物种种的的两两个个或或数数个个个个体体组组成成的的群群体体。从从同同一一受受精精卵卵分分裂裂而而来来的的单单卵卵双双生生子子（monozygotic twins）便便是是属属于于同同一一克克隆。隆。
74、分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件在在细细胞胞水水平平上上，克克隆隆一一词词是是指指由由同同一一个个祖祖细细胞胞（progenitor cell）分分裂裂而而来来的的一一群群带带有有完完全全相同遗传物质的子细胞。相同遗传物质的子细胞。在在分分子子生生物物学学上上，人人们们把把将将外外源源DNA插插入入具具有有复复制制能能力力的的载载体体DNA中中，使使之之得得以以永永久久保保存和复制这种过程称为克隆。存和复制这种过程称为克隆。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 5. 2 cDNA差示分析法差示分析法(RDA, Representation Differe
75、nce Analysis)通通过过降降低低cDNA群群体体复复杂杂性性和和更更换换cDNA两两端端接接头头等等方法，特异性扩增目的基因片段。方法，特异性扩增目的基因片段。因因为为Tester和和Driver在在接接受受差差示示分分析析前前均均经经一一个个4碱碱基基切切割割酶酶处处理理，形形成成平平均均长长度度256bp的的代代表表群群，保保证绝大部分遗传信息能被扩增。证绝大部分遗传信息能被扩增。每每次次T减减D反反应应后后仅仅设设置置72复复性性与与延延伸伸，94变变性性这这两两个个参参数数共共20个个PCR循循环环，PCR产产物物的的特特异异性性和和所得探针的纯度高。所得探针的纯度高。分子学
76、分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 5. 3 Gateway大规模克隆技术大规模克隆技术Gateway技技术术利利用用噬噬菌菌体体进进行行位位点点特特异异性性DNA片片段段重重组组，实实现现了了不不需需要要传传统统的的酶酶切切联联接接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。过程的基因快速克隆和载体间平行转移。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件5. 5. 4 基基因因的的图图位位克克隆隆法法（Map-based cloning）所所有有具具有有某某种种表表现现型型的的基基因因都都可可以以通通过过该该方方法克隆得到。法克隆得到。通通过过构构建建遗遗传传连连锁锁图图，将
77、将目目的的基基因因定定位位到到某某个个染染色色体体的的特特定定位位点点，并并在在其其两两侧侧确确定定紧紧密密连锁的连锁的RFLP或或RAPD分子标记。分子标记。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件通通过过对对不不同同的的生生态态型型及及限限制制性性内内切切酶酶和和杂杂交交探探针针的的分分析析，找找出出与与目目的的基基因因距距离离最最近近的的分分子子标标记记，通通过过染染色色体体步步移移法法将将位位于于这这两两个个标标记记之之间间的的基基因因片片段段克克隆隆并并分分离离出出来来，根根据据基基因因功功能能互互作原理鉴定目的基因。作原理鉴定目的基因。分子学分子学DNARNADNARN
78、A技术课件技术课件5. 6 蛋白质与蛋白质组学技术蛋白质与蛋白质组学技术蛋蛋白白质质组组学学是是蛋蛋白白质质（protein）和和基基因因组组（genome）研研究究在在形形式式和和内内容容两两方方面面的的组组合合，该该技技术术致致力力于于研研究究某某一一物物种种、个个体体、器器官官、组组织织或或细细胞胞在在特特定定条条件件、特特定定时时间间所所表表达的全部蛋白质图谱。达的全部蛋白质图谱。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件蛋蛋白白质质组组与与基基因因组组既既相相互互对对应应又又有有显显著著不不同同，基基因因组组是是确确定定的的，每每个个个个体体只只有有一一个个基基因因组组，而
79、而基基因因的的表表达达调调控控水水平平（蛋蛋白白组组）却却会会发发生生显著的变化。显著的变化。由由于于蛋蛋白白质质分分离离（双双向向电电泳泳和和高高效效液液相相层层析析技技术术）和和鉴鉴定定技技术术（现现代代质质谱谱）的的进进步步，以以及及基基因因组组学学和和生生物物信信息息学学的的交交叉叉渗渗透透，蛋蛋白白质组学研究在已经获得了长足的发展。质组学研究在已经获得了长足的发展。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件双双向向电电泳泳（TwoDimensional Electrophoresis，2-D）技术）技术等等电电聚聚焦焦（Isoelectric focusing，IEF）及及
80、SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（SDS-PAGE）双双向向电电泳泳技技术术。蛋蛋白白质质是是两两性性分分子子，在在不不同同pH缓缓冲冲液液中中表表现现出出不不同同的的带带电电性性，因因此此，在在两两性性电电解解质质电电泳泳体体系系中中，不不同同等等电电点点的的蛋蛋白白质质会会聚聚集集在在介介质质上上不不同同的的区区域域（等等电电点点）从从而而被被分离。分离。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件蛋蛋白白质质的的分分子子量量决决定定了了SDS-蛋蛋白白复复合合物物在在凝凝胶胶电电泳泳中中的的迁迁移移率率，因因为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的SDS带带有有大大量量的的负
81、负电电荷荷，与与之之相相比比，蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷量量可可忽忽略略不不计计。因因此此，蛋蛋白白质质在在SDS凝凝胶胶电电场场中中的的运运动动速速度度和和距距离离完完全全取取决决于其分子量。于其分子量。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件2D-E map of protein from Arabidopsis seeds 30h after germination分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件 Quantitative analysis of cp29A and cp29B from seeds at 0-96 h after germinatio
82、n 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件野生型和突变体棉花胚珠总蛋白质样品的双向电泳图谱比较分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件蛋白质的质谱分析技术蛋白质的质谱分析技术现现行行质质谱谱仪仪主主要要有有三三个个连连续续的的组组成成部部分分，即即离子源，离子分离区和检测器。离子源，离子分离区和检测器。较常用的有基质辅助的激光解析电离较常用的有基质辅助的激光解析电离-飞行时飞行时间质谱（间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spe
83、ctrometry，MALDI-TOF）和电喷雾质谱（）和电喷雾质谱（Electrospray ionization，ESI-MS）。）。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件MALDI-TOF的的工工作作原原理理：将将蛋蛋白白质质酶酶解解成成小小肽肽段段后后与与基基质质（主主要要是是有有机机酸酸）混混合合，将将样样品品混混合合物物点点到到金金属属靶靶表表面面上上并并使使之之干干燥燥结结晶晶，然然后后用用激激光光轰轰击击，将将呈呈离离子子化化气气体体状状态态的的待待分分析析物物从从靶靶表表面面喷喷射射出出去去。离离子子化化气气体体肽肽段段在在电电场场中中被被加加速速后后到到达达检
84、检测测器器的的时时间间由由肽肽段段的质量和其所带电荷数的比值（的质量和其所带电荷数的比值（m/z）决定。）决定。分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件图图5-31 MALDITOF5-31 MALDITOF分子质谱仪原理图分子质谱仪原理图 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Nano-ESI-MS/MS identification of N-terminal Nano-ESI-MS/MS identification of N-terminal acetylation of protein spots 2ace
85、tylation of protein spots 2分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Nano-ESI-MS/MS identification of N-terminal Nano-ESI-MS/MS identification of N-terminal acetylation of protein spots 4acetylation of protein spots 4分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Xu Y. et al. (2007) Identification of proteins expressed at extremely low
86、 level in Arabidopsis leaves. BBRC 358: 808812.Li H.B. et al. (2007) A cotton ascorbate peroxidase modulates the stead-state level of H2O2 during fiber cell development. New Phytol. 175: 462-471.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件Wang B.C. et al. (2006) Post-translational modifications, but not transcription
87、al regulation, of major chloroplast RNA-binding proteins are related to Arabidopsis seedling development. Proteomics，6: 2555-2563. Fu Q. et al. (2005) Proteomic analysis and extensive protein identification from dry, germinating Arabidopsis seeds and young seedlings. J Biochem. Mol. Biol. 38: 650-66
88、0. 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件蛋白质免疫印迹实验（蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting）：）：是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠方法。主要分为方法。主要分为a、蛋白样品的制备；、蛋白样品的制备；b、SDS-PAGE分离分离;c、转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特、转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特异性吸附；异性吸附；d、与相应非标记抗体（一抗）、与相应非标记抗体（一抗）反应；反应；e、洗去多余的一抗，加酶偶联或放射、洗去多余的一抗，加酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显性同位素标记的二抗，通
89、过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。影法检测凝胶中的蛋白成分。 分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件免疫印迹免疫印迹（Western Blotting）示）示意图意图.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件20 g total proteins extracted from Arabidopsis lines and 10 g extracted from E. coli before () and after (+) IPTG-induction. OEL, sample prepared from BARD1 over-expressing line.分子学分子学DNARNADNARNA技术课件技术课件
