DNA的生物合成1课件

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1、第三章第三章DNADNA的生物合成的生物合成Biosynthesis of DNABiosynthesis of DNA(Replication of DNA)(Replication of DNA)第一节第一节 DNADNA复制的一般特征复制的一般特征一、一、DNADNA的生物学功能的生物学功能 1 1、储存遗传信息、储存遗传信息 2 2、复制遗传信息、复制遗传信息 3 3、表达遗传信息、表达遗传信息 4 4、遗传变异、遗传变异Watson(Nature) :Watson(Nature) :我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制

2、机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致代双螺旋与母本完全一致。他们在另一篇论文中：由此产生了在当他们在另一篇论文中：由此产生了在当时难于解决的解开双链结构的困难。时难于解决的解开双链结构的困难。许多科学家难于接受许多科学家难于接受WatsonWatson提提出的机制。出的机制。二、二、 DNADNA复制方式复制方式 全保留全保留半保留半保留分散式分散式DNA如何进行复制？如何进行复制？可能的三种方式可能的三种方式根据实验结果：第一代的根据实验结果：第一代的DNADNA仅有一条带否定了仅有一条带否定了全保留

3、复制的可能，第二代出现两条带，一条完全保留复制的可能，第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明DNADNA只能是半保留方式进行复制只能是半保留方式进行复制1 1 、 DNADNA的半保留复制的半保留复制 SemiconservativeSemiconservative Replication Replication DNA DNA双链解开，以单链做模板，碱基互补双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条链。在新合成的原则，各自合成一条链。在新合成的DNADNA双链分子中，双链分子中，一条是原来的老链，一条一条是原来的老

4、链，一条是新链是新链。如果是半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。如果是半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。250Mb的的1 1号染色体，需要旋转号染色体，需要旋转250250万次。万次。DNADNA拓扑异构酶解决了拓扑异构酶解决了 解开解开DNADNA双螺旋的问题双螺旋的问题DNADNA复制速率复制速率大肠杆菌完成复制需大肠杆菌完成复制需4040分钟。分钟。大肠杆菌基因组有大肠杆菌基因组有400400万万bpbp，复制速率：复制速率：1700 1700 bpbp/ /秒。秒。真核生物复制速率：真核生物复制速率：60 60 bpbp/ /秒。秒。但完成整但完成整个基因组复制所需的时间比大肠杆

5、菌短。个基因组复制所需的时间比大肠杆菌短。原因是大肠杆菌基因组仅有一个复制起原因是大肠杆菌基因组仅有一个复制起始位点，而真核基因组有多个起始位点。始位点，而真核基因组有多个起始位点。2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式：链延伸可能有三种方式：12 3 日本日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段，然后又消失的短片段，然后又消失没有从没有从3 5 延长延长DNA链链的聚合酶的聚合酶2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性一一条条链链连连续续合合成成，称称主主导导链链，Leading

6、Leading Strand Strand 另另一一条条链链分分段段合合成成，称称随随从从链链（随后链）（随后链）Lagging Strand Lagging Strand 。原原因因：DNADNA双双螺螺旋旋分分子子两两条条链链方方向向相相反反，新链合成的方向只能新链合成的方向只能5 53 3一个方向合成。一个方向合成。3 DNA复制的双向性复制的双向性在两个方向同时进行，形成两个复制叉在两个方向同时进行，形成两个复制叉Replication Fork .复制子复制子 RepliconRepliconRepliconReplicon 基因组中能独立进行复制的结构单基因组中能独立进行复制的结构

7、单位称复制子位称复制子, , 或者说单个复制起始点控制的或者说单个复制起始点控制的DNADNA。复制的起始位点复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点。控制并起始复制的特定位点。终止位点终止位点 终止复制的位点终止复制的位点复制子包含起始位点和终止位点，从起始位点复制子包含起始位点和终止位点，从起始位点至终止位点的全部至终止位点的全部DNADNA。第二节第二节 DNA DNA 复制的基本过程复制的基本过程一一 复制的起始复制的起始（一） 起始部位起始部位的的序列特征序列特征 复制复制在特定部位起始。在特定部位起始。 原核生物原核生物仅有一个起始部位。仅有一个起始部位。 真核生物有多个起始部位。

8、真核生物有多个起始部位。1 1、 M M1313噬菌体的起始部位顺序特征噬菌体的起始部位顺序特征 59 59bpbp的发夹结构。的发夹结构。2 2、大肠杆菌的起始部位顺序特征大肠杆菌的起始部位顺序特征 2 2个区个区域：起始蛋白识别区：域：起始蛋白识别区：4 4个个9 9bpbp重复顺序重复顺序和邻近的和邻近的ATAT富含区富含区3 3个个1313bpbp重复顺序重复顺序。 大肠杆菌基因组复制起始部位大肠杆菌基因组复制起始部位3 3、酵母、酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征酵母酵母4 4、 SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征5211 5220 5230 5240 1 10

9、20 30CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列反转重复序列 大大T抗原结合部位抗原结合部位 II A/T 富含区富含区 图图3-7 SV40 复制起始部位结构复制起始部位结构5 5、起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）高等真核生物）多个复制起始点，有人发现任何大于多个复制起始点，有人发现任何大于15kb15kb的的DNADNA就能自主复

10、制就能自主复制。起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序列。列。（二）（二） 起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体噬菌体（ X174X174） priApriA 识别起始位点，识别起始位点，ATPATP酶活性酶活性 priBpriB 起始引发起始引发 priCpriC 起始引发起始引发 DnaTDnaT 起始引发起始引发 DnaBDnaB 起始引发起始引发 DnaCDnaC 起始引发起始引发, ,与与DnaBDnaB一起作用一起作用 DnaGDnaG RNA RNA引物合成引物合成2 2 大肠杆菌大肠杆菌 DnaADnaA 结合于结

11、合于oriCoriC区区，有有ATPATP酶活性，使酶活性，使ATAT富含富含 区区解解链，促进链，促进DnaBDnaB结合形成起始复合物结合形成起始复合物。 DnaBDnaB DNA DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。螺旋酶，有解旋和解链作用。 DnaCDnaC 运输运输DnaBDnaB，形成起始复合物形成起始复合物。 DnaGDnaG DNA DNA复制引发酶，合成引物。复制引发酶，合成引物。 HuHu 促进复制复合物的形成促进复制复合物的形成。 回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链松弛正超螺旋，促进单链DNADNA产生。产生。 单链结合蛋白单链结合蛋白 促进促进DNADNA解链，稳定单链解

12、链，稳定单链DNADNA。3 3、真核细胞（真核细胞（SV40）真核细胞（真核细胞（SV40）的）的DNA复制至少需要复制至少需要6个蛋白因子参与。个蛋白因子参与。T抗原抗原：N端为端为DNA结合区，识别起始位点，结合区，识别起始位点， C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在酶活性，在RFA的协助下解开双链。的协助下解开双链。RFA：人单链结合蛋白人单链结合蛋白拓补异构酶拓补异构酶I或或II：解开超螺旋。解开超螺旋。 复制因子复制因子C（replication facter C, RFC）：）：形成起始复合物。形成起始复合物。DNA聚合酶聚合酶-引物酶复合物引物酶复合物：合成引物，起始：合成引物，

13、起始DNADNA合成。合成。4、真核细胞（真核细胞（Yeast）（1） ORC（ Origin Recognition Complex） 6 6个亚基组成个亚基组成 在真核生物中相当保守在真核生物中相当保守 特异识别特异识别ARS ARS （Autonomously replicating sequenceAutonomously replicating sequence） ORC1pORC1p，ORC2pORC2p，ORC4p ORC4p 与与A A 元件结合，元件结合， ORC5pORC5p与与B B元件结合元件结合 结合过程需要结合过程需要ATPATP（2） Cdc6/Cdc18（3 3

14、）微染色体支持蛋白（微染色体支持蛋白（MinichromosomeMinichromosome maintenance proteinsmaintenance proteins，MCMpMCMp）（4） Cdc45（三）三） 复制的起始引发（复制的起始引发（PrimingPriming）SSB的作用的作用无无SSB结合非特异引发结合非特异引发有有SSB结合特异引发结合特异引发1、M13噬菌体噬菌体 单链结合蛋白单链结合蛋白SSB与与M13噬菌体单链噬菌体单链DNA结结 合，在发夹结构前合，在发夹结构前6 bp处，处，RNA聚合酶合成聚合酶合成 2030个碱基的个碱基的RNA. 破坏发夹结构；破

15、坏发夹结构；SSB结合；结合；DNA聚合酶聚合酶III在在3OH延长延长DNA链。链。 DNA聚合酶聚合酶I水解水解RNA，并并补补平缺口，连接酶连接平缺口，连接酶连接。SSB与与DNA结合结合priA,priB,priC识别起始点识别起始点在在DnaT帮助下帮助下DnaB,DnaC复合物结复合物结合形成前引发体合形成前引发体引发体引发体引发体可沿着引发体可沿着DNA链移动，在链移动，在合适的位点起始合适的位点起始引物引物RNA的合成的合成引发体引发体的装配只能在起始点，的装配只能在起始点，引物合成可在多处。引物合成可在多处。引发体移动的方向与引发体移动的方向与DNA链延链延长的方向相反。长的

16、方向相反。类似冈崎片段的合成类似冈崎片段的合成2、 X174DNA 复制叉前进方向复制叉前进方向3ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-53ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-5 链延长方向链延长方向 TTCGTTTG-3TTCGTTTG-3 GACGCAA GACGCAA TAGCCTTG TAGCCTTG5 TAGCCT 55 TAGCCT 5 3 3 3、大肠杆菌大肠杆菌DnaA与起始位点与起始位点OriC结合形成起始复合物结合形成起始复合物DnaA与与A-T富含区作用，解富含区作用，解 链，形成开放复合物链，形成开放复合物SSB与单链与单链

17、DNA结合结合DnaA指导指导DnaB-DnaC复合物结合到解链复合物结合到解链 区，形成前引发复区，形成前引发复合物合物。DnaB 引导引导DnaG引物合成酶的结合形成引发复合物，合成引物合成酶的结合形成引发复合物，合成RNA引引物物Hu因子促进引发过程因子促进引发过程4 SV404 SV40T抗原识别起始点和解链抗原识别起始点和解链RFA结合到单链结合到单链DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体拓扑异构酶参与下形成前引发体DNApol -引物酶结合形成引发体引物酶结合形成引发体ORC：Origin Recognition Complex5、真核生物复制的起始真核生物复制的起始二二 DNADNA

18、链的延长链的延长（一）一） 原核生物原核生物DNADNA链的延伸链的延伸延伸延伸反应反应：在在RNARNA引物的引物的OHOH端由端由DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII，按碱基互补按碱基互补规则延伸规则延伸。主导链主导链的延长的延长： 3 35 5方向这条链做模板链的方向这条链做模板链的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成（5 5 3 3）。 随从链的延长随从链的延长5 5 3 3 方向这条链做模板链的新链合成则不方向这条链做模板链的新链合成则不能随着复制叉向前移动能随着复制叉向前移动进行进行连续合成，只能分连续合成，只能分段合成一小段，这一小段新

19、合成的段合成一小段，这一小段新合成的DNADNA链称冈链称冈奇片段。每一段新合成的一小段中奇片段。每一段新合成的一小段中有有RNARNA，由由RNARNA酶水解，酶水解，DNADNA聚合酶聚合酶I I补平，最后由连接补平，最后由连接酶酶连接。连接。DNADNA链延长的要点链延长的要点1 1) DNA) DNA聚合酶不能从头合成新链，只能在聚合酶不能从头合成新链，只能在3-3-OHOH羟基端延长。复制羟基端延长。复制起始起始时的时的3-3-OHOH羟基端是羟基端是RNARNA。2) 2) 按照碱基互补原则合成新链按照碱基互补原则合成新链。3 3) ) 两条链同时复制，新链的延伸方向是两条链同时复

20、制，新链的延伸方向是5 53 3，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连续合成，称随从链（后随链）。续合成，称随从链（后随链）。4) 复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制叉（复制叉（ReplicationReplication fork fork）, , 复制叉从起始点沿复制叉从起始点沿着着DNADNA移动。复制能够发生的移动。复制能够发生的DNADNA单位称复制子单位称复制子（RepliconReplicon）.（二）二）SV40SV40的的DNADNA延伸延伸1、前导链的延伸前导链的延伸 PolPol 合成一段

21、新链合成一段新链 在在RFCRFC和和PCNAPCNA协助下，协助下， PolPol PolPol 转转换换 由由PolPol 完成全部前导链的合成完成全部前导链的合成2 2、后随联的延伸、后随联的延伸三三 复制的终止复制的终止对于线性对于线性DNADNA复制例如复制例如 噬菌体等比较简噬菌体等比较简单，复制到单，复制到分子末端终止。分子末端终止。对于环状的大肠杆菌对于环状的大肠杆菌DNADNA复制和真核生物复制和真核生物的的DNADNA复制就比较复杂。复制就比较复杂。复制叉复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代DNADNA缠绕在一起，缠绕在

22、一起，需要分开。需要分开。在大肠杆菌：在大肠杆菌：有复制起始点，也有复制终止点。有复制起始点，也有复制终止点。终止子（终止子（Terminator)）含）含22bpTus: Terminus utilization substance复制叉复制叉到达终止区，完成复制前，到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代复制暂停。两个子代DNA缠绕在缠绕在一起，需要分开。一起，需要分开。第三节第三节 参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类参与参与DNADNA复制的酶或蛋白因子主要有以下几种：复制的酶或蛋白因子主要有以下几种：1 DNA1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNADNA的合成。的合成。2 2

23、引物酶引物酶 起始起始DNADNA的合成的合成3 3 连接酶连接酶 连接岗奇片段连接岗奇片段4 DNA4 DNA解链，解旋酶解链，解旋酶5 DNA5 DNA结合蛋白。结合蛋白。一一 DNADNA聚合酶聚合酶(Polymerase)(Polymerase)（一）一） 作用机制作用机制 以以DNADNA做模板，碱基互补配对，催化做模板，碱基互补配对，催化4 4种种dNTPdNTP 之间形成磷酸二酯键，从而延长之间形成磷酸二酯键，从而延长DNADNA链。链。 在模板链上进行在模板链上进行 不能从头合成，在引物的不能从头合成，在引物的3 3OHOH端上延长端上延长 新链延长方向为新链延长方向为5 53

24、 3延长延长 （二）二） 原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶 有有3 3种：种：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，II II，IIIIII。 多功能酶：合成多功能酶：合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用, , 延长延长DNADNA链。链。 水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性。切除不配外切核酸酶活性。切除不配对碱基，起校读作用对碱基，起校读作用1 DNA1 DNA聚合酶聚合酶 I I 5-3 5-3延长延长DNADNA链（链（DNADNA聚合酶活性）聚合酶活性） 从从3 3端水解水解端水解水解DNADNA（ 5 53 3外切酶活性外切酶活性） 从从5 5端水解水

25、解端水解水解DNADNA（ 5 53 3外切酶活性外切酶活性）， 只作用于双链只作用于双链 DNADNA。大片段（大片段（KlenowKlenow 片段）：含片段）：含 、 活性活性小片段：含小片段：含 活性活性 DNADNA聚合酶聚合酶 I I 在在DNADNA复制中所起的作用复制中所起的作用不是主要的复制酶不是主要的复制酶RNARNA引物的切除引物的切除DNADNA损伤的修复：紫外线作用形成的损伤的修复：紫外线作用形成的TTTT二二 聚体的切除聚体的切除链置换：链置换： 可能参与遗传重组可能参与遗传重组切口平移（切口平移（nick translationnick translation）

26、探针标记探针标记切口平移切口平移( (NickNick Translation) Translation)2 DNA2 DNA聚合酶聚合酶 II II不是复制酶，主要在不是复制酶，主要在DNADNA修复中起作用，无修复中起作用，无5 53 3外切酶活性。外切酶活性。3 DNA3 DNA聚合酶聚合酶 IIIIII催化效率高，主要复制酶。由催化效率高，主要复制酶。由1010种种亚基组成亚基组成： （1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶： ：DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 ：3-53-5外切酶活性，控制复制忠外切酶活性，控制复制忠 实性实性 ： （2 2） 二聚体：二聚体： 构成滑动钳，将全酶固定在构

27、成滑动钳，将全酶固定在 DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒- 750/ 750/秒。秒。 （3 3） 复合物复合物 ： 2 2 协助协助 二聚体结二聚体结合到合到DNADNADNADNA聚合酶聚合酶 IIIIII形成不对称的二聚体，与形成不对称的二聚体，与DNADNA双链结合，后随双链结合，后随链折叠链折叠1801800 0，使后随链的物理方向，使后随链的物理方向与主导链与主导链一一致，同时催化两条链的复制致，同时催化两条链的复制。（三）（三） 真核生物真核生物DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 : :

28、 多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶。 大亚基：大亚基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。 100nt/100nt/次次 小亚基：引物酶活性，合成小亚基：引物酶活性，合成RNARNA。 起始起始DNADNA的合成：合成的合成：合成RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构多亚基组成：多亚基组成：P125 P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性P50 P50 小亚基小亚基 与与PCNAPCNA结合相关结合相关P66P66P12

29、P12DNADNA聚合酶聚合酶 的的功能功能主要主要DNADNA复制酶：复制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA链。链。 与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“ “全酶全酶” ”，在，在RFCRFC和和PCNAPCNA等的等的协同下，促使协同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离，的解离， DNADNA聚合酶聚合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成- - DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。复制校正功能：复制校正功能： 3-53-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性在在DNADNA修复、重组、

30、细胞周期调控、修复、重组、细胞周期调控、DNADNA损伤检测中也起重要作用损伤检测中也起重要作用。DNADNA聚合酶聚合酶 、 、 主要功能：主要功能：DNADNA修复。修复。 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白1 1、RFCRFC：复制因子复制因子C(C(R Replication eplication F Factor actor C C) )。多亚基复合物，多亚基复合物，DNADNA聚合酶的附属蛋白，聚合酶的附属蛋白，识别引物末端识别引物末端,参与链的延长。类似参与链的延长。类似 复复合物。合物。2 2、PCNAPCNA：增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（P Proliferating ro

31、liferating C Cell ell N Nuclearuclear A Antigen)ntigen)， DNADNA聚合酶的附属聚合酶的附属蛋白，参与蛋白，参与DNADNA的合成，类似的合成，类似 二聚体。二聚体。3、PRP1和PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNADNA聚合酶聚合酶 与模板引物末端的亲和力，与模板引物末端的亲和力，增加增加DNADNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。三三 引物酶引物酶 primaseprimase DNADNA聚合酶不能引发聚合酶不能引发DNADNA新生链的合成，只能新生链的合成，只能 在在已存在的已存在的DNA

32、DNA链链或或RNARNA链上延长链上延长DNADNA。引物酶引物酶催化引物催化引物RNARNA的合成。的合成。四四 连接酶连接酶 ligaseligase 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板链结合必须都与完整的模板链结合。大肠杆菌的连接酶需大肠杆菌的连接酶需NAD+NAD+，真核细胞的连接酶真核细胞的连接酶需要需要ATPATP。可可连连接接双双链链DNADNA中中的的单单链链切切口口，RNA-DNARNA-DNA杂杂交交体体双双链链单单链链切切口口，不不能能连连接接双双链链RNARNA中中的的单单链链切切口。口。五五 与与DNA

33、DNA解链和解旋有关的酶解链和解旋有关的酶（一）（一） DNADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase） 催化双螺旋解旋和解链催化双螺旋解旋和解链需消耗需消耗ATPATP（二）（二） 拓扑异构酶（拓扑异构酶（TopoisomeraseTopoisomerase) )促进促进DNADNA双链的解开。需消耗双链的解开。需消耗ATPATP。（三）（三） 复制蛋白复制蛋白 A A（Replication Protein A Replication Protein A ，RPARPA）也称也称DNADNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（Single Strand Binding protein

34、Single Strand Binding protein，SSBSSB）主要功能：主要功能： 与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。在复制起始阶段在复制起始阶段,在细胞周期的调节信号作用下在细胞周期的调节信号作用下,起始复合物被激起始复合物被激活活,解螺旋酶解开解螺旋酶解开DNA双链双链, RPA特异地结合到暴露的特异地结合到暴露的DNA单链单链上促进上促进DNApol/引发酶复合物合成第一引发酶复合物合成第一个个RNA引物和引物和DNA短链短链;在延长阶段在延长阶段

35、, RPA解开双链维持解开双链维持DNA模板处于单链状态模板处于单链状态,并保护单并保护单链的完整性链的完整性,使使DNA连续复制。连续复制。DNADNA复制的忠实性复制的忠实性 保证复制忠实性的因素保证复制忠实性的因素： 1 1 碱基之间的氢键配对作用碱基之间的氢键配对作用 10 10-4 -41010-5-5 2 2 DNADNA聚合酶选择正确碱基的作用聚合酶选择正确碱基的作用 3 3 DNADNA聚聚合合酶酶的的校校正正作作用用和和3 35 5外外切切酶酶活活性性。 延延长长之之前前先先校校正正，切切除除3-3-末末端端错错配的碱基配的碱基。Poly III 和 Poly . 4 4、错

36、配修复、错配修复(mismatch repair)(mismatch repair)半甲基化半甲基化DNA。新合成链未甲基化。新合成链未甲基化。箭头所指处为错配碱基起始位点箭头所指处为错配碱基起始位点外切酶切除错配碱基外切酶切除错配碱基DNA聚合酶聚合酶III等修复等修复甲基化酶甲基化甲基化酶甲基化人类细胞中存在类似的错配修复人类细胞中存在类似的错配修复机制机制 第四节 DNA复制的调控复制的调控DNADNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNADNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。无论原核还市真核细胞中无论原

37、核还市真核细胞中DNADNA复制都只发生在复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNADNA必须也只能复制一次必须也只能复制一次。一一 大肠杆菌复制的调节大肠杆菌复制的调节1，起始体起始体 （ orisomeorisome，起始复合物，蛋白质起始复合物，蛋白质- -oriori C C复合物）的装配复合物）的装配 参与形成参与形成orisomeorisome的组分：的组分：Dna A, Hu, IHF，Fis，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A相互作用相互作用 ：Fis, IHF 调节调节 DnaA-ATP

38、与与oriCoriC 的结的结合，合，HU HU 调节调节DnaADnaA, IHF , IHF 结合到结合到oriCoriC, , 并增强并增强DnaADnaA解解链能力。链能力。2 2，防止复制再次起始，防止复制再次起始(1) (1) DnaDna A A活性的抑制活性的抑制 DnaDna A-ADP A-ADP DnaDna A-ATP A-ATP无活性无活性 RIDA RIDA 有活性有活性 ori C(2) 降低游离形式的降低游离形式的Dna A水平水平Dna A结合位点结合位点 dat A区区在复制后极短时间内降低在复制后极短时间内降低 Dna A 水平水平可以结合可以结合300分

39、子的分子的Dna A(3)(3)隔离隔离 oriori C C ori CGATCCTAG甲基化甲基化未甲基化未甲基化摸板链摸板链新合成链新合成链Seq A 特异识别特异识别,并结合于半甲基化并结合于半甲基化ori C 的的GATC序列序列,使使ori C被隔离被隔离,防止复制再次发生防止复制再次发生二二 真核生物复制起始调空真核生物复制起始调空1 1、DNADNA复制起始的调控复制起始的调控2 2、细胞周期监控点机制、细胞周期监控点机制( (一一) )、DNADNA复制起始的调节复制起始的调节1 1、复制起始点的选择复制起始点的选择 复制起始点数量的调控复制起始点数量的调控 真核细胞有多个复

40、制起始点，起用多少起始真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于点决定于S S期的长短。期的长短。 S S期短，起始点多。期短，起始点多。S S期长，起始点少。期长，起始点少。 遗传性起始点：遗传性起始点： DNADNA上的起始元件上的起始元件功能性起始点：功能性起始点： 实际起始点实际起始点遗传性起始点遗传性起始点 多于多于 功能性起始点功能性起始点酵母细胞酵母细胞3 3号染色体上有号染色体上有1414个遗传性复制起始个遗传性复制起始点，只有点，只有6 6个功能性复制起始点。个功能性复制起始点。将将Ura3Ura3基因处的强复制起始点突变后，在其附基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱

41、复制起始点就成为强复制起始点。近的弱复制起始点就成为强复制起始点。高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。CHOCHO细胞核细胞核 蟾蜍卵细胞抽提物蟾蜍卵细胞抽提物 损坏损坏CHOCHO细胞核或细胞核或 裸露裸露DNA DNA 非随机起始，同正常非随机起始，同正常 随机起始随机起始CHOCHO细胞细胞 复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关2 2、 复制起始调控机制复制起始调控机制（1 1） 复制的允许机制（复制的允许

42、机制（Licensing modelLicensing model） （2）蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控 （1 1） 复制的允许机制（复制的允许机制（Licensing modelLicensing model） 一个细胞周期中一个细胞周期中DNADNA复制发生一次且只能发生一次复制发生一次且只能发生一次 蟾蜍卵细胞蟾蜍卵细胞 外源细胞核外源细胞核 Licensing controlLicensing control 复制复制复制机制如何识别复制机制如何识别已经复制过一次的已经复制过一次的DNA复制起始点？复制起始点？复制后，复制后，Licensing Factor失活，失活，失活的失活的Li

43、censing Factor不能不能再次启动复制。核再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的膜破裂后（细胞分裂后），新的Licensing Factor进入进入核，启动下一周期核，启动下一周期的的DNA复制。复制。（2） 蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶： CDK CDK 和和 Cdc7-Dbf4Cdc7-Dbf4激酶激酶(1)(1)、前复制起始复合物前复制起始复合物的形成的形成 组成成分：组成成分：ORC(Origin Recognition Complex) ORC(Origin Recognition Complex)

44、 含含6 6种蛋种蛋白质，白质，Cdc6Cdc6，RLF RLF （Replication Licensing Factor, Replication Licensing Factor, 复制允复制允许因子）。许因子）。( (2 2) )、CDKCDK激活激活前前复制起始复合物复制起始复合物 复制前复合物复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物成起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物复制后复合物，就，就再也不能启动复制。再也不能启动复制。 CDKCDK（CyclinDependentCyclinDependent), C

45、dc7-Dbf4), Cdc7-Dbf4激酶，激酶， 蛋白激酶蛋白激酶A A，蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶2 2A A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。都参与复制的起始，在不同阶段起作用。前前复制起始复合物（复制起始复合物（pre-pre-replicativereplicative complex complex，pre-RC)pre-RC) （在遗传性复制起始点装配）在遗传性复制起始点装配） CDKCDK起始复合物（起始复合物（ReplicativeReplicative Complex,RC) Complex,RC) （在功能性复制起始点形成）在功能性复制起始点形成）在在G1G1期向期向S

46、S期过渡期间，期过渡期间，CDKCDK活性很高。活性很高。CDKCDK同时又是防止在同一细胞周期中同时又是防止在同一细胞周期中DNADNA复制再复制再次发生的因素。阻止复制起始复合物的组装。次发生的因素。阻止复制起始复合物的组装。CDKCDK对某些起始因子磷酸化。对某些起始因子磷酸化。（二）二） 复制检查点机制复制检查点机制 识别识别DNADNA损伤或损伤或DNADNA复制阻断，通过复杂复制阻断，通过复杂的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞周期。周期。在长期进化过程在长期

47、进化过程中，细胞形成一中，细胞形成一套保证细胞周期套保证细胞周期中中DNA复制和染复制和染色体分配质量的色体分配质量的检查机制，即细检查机制，即细胞周期检查点胞周期检查点检查点：检查点：(1) G1 S S期检查点期检查点查看查看DNADNA有无损伤有无损伤 DNA damage checkpointDNA damage checkpoint 细胞周期暂时减慢或停止。细胞周期暂时减慢或停止。查看查看DNADNA复制的进度复制的进度 DNA replication checkpointDNA replication checkpoint 限制限制DNADNA复制速度复制速度(2)、G2 M 管理

48、染色体的正确分配管理染色体的正确分配 Spindle assembly Spindle assembly checkpointcheckpoint启动相关基因恢复复制、启动相关基因恢复复制、启动启动DNA修复机制修复机制复制故障、复制故障、DNA损伤损伤中断细胞周期中断细胞周期探测器探测器(Sensor)传感器（传感器（Transducer） 效应器效应器（Effector）当细胞周期进程出现异常事件当细胞周期进程出现异常事件,如如DNA损伤或复制出错受阻时，损伤或复制出错受阻时，这类调节机制就被激活，及时这类调节机制就被激活，及时中断细胞周期的运行，待异常中断细胞周期的运行，待异常事件消失后

49、或损伤修复后，细事件消失后或损伤修复后，细胞周期才恢复进行胞周期才恢复进行。ATM、ATR、Rad17复合物、复合物、911复合物复合物ATM、ATR、Rad17复合物、复合物、911复合物复合物Cdc25A、Cdc25CP53、p21Chk1、chk2监控机制的组成：监控机制的组成：1 1、检控蛋白、检控蛋白 细胞周期蛋白家族（细胞周期蛋白家族（CyclinsCyclins) ) 细胞周期蛋白依赖蛋白激酶（细胞周期蛋白依赖蛋白激酶（CyclinCyclin DenpedentDenpedent protein protein Kinase,CDKsKinase,CDKs) ) 2 2、DNA

50、DNA修复体系修复体系The G1/S cell cycle checkpoint controls the passage of eukaryotic cells from the first “gap” phase (G1) into the DNA synthesis phase (S). Two cell cycle kinases, CDK4/6-cyclin D and CDK2-cyclin E, and the transcription complex that includes Rb and E2F are pivotal in controlling this check

51、point. During G1-phase, the Rb-HDAC repressor complex binds to the E2F-DP1 transcription factors, inhibiting the downstream transcription. Phosphorylation of R b by CDK4/6 and CDK2 dissociates the R b-repressor complex, permitting transcription of S-phase genes encoding for proteins that amplify the

52、 G1- to S-phase switch and that are required for DNA replication. Many different stimuli exert checkpoint control including TGFbeta, DNA damage, contact inhibition, replicative senescence and growth factor withdrawal. The first four act by inducing members of the INK4 or Kip/Cip families of cell cyc

53、le kinase inhibitors. TGFbeta additionally inhibits the transcription of Cdc25A, a phosphatase that activates the cell cycle kinases. Growth factor withdrawal activates GSK-3beta, which phosphorylates cyclin D, leading to its rapid ubiquitination and proteosomal degradation. Ubiquitination, nuclear

54、export and degradation are mechanisms commonly used to rapidly reduce the concentration of cell cycle control proteins.G1/S Checkpoint G1/S Checkpoint 312在在G1期期 Rb.HDAC阻遏复合物与阻遏复合物与E2F.DP1转录因子结合，抑制进转录因子结合，抑制进入入S期的基因转录。期的基因转录。若若Rb被被CDK4/6和和CDK2磷酸化，磷酸化，Rb阻遏复合物解离，进入阻遏复合物解离，进入S期和期和DNA复制所需要的基因转录。复制所需要的基因转

55、录。如果发生如果发生DNA损伤，损伤，DNA复制出复制出现问题，通过一些信号分子抑制现问题，通过一些信号分子抑制CDK2或或CDK4/6, 阻碍阻碍Rb的磷酸的磷酸化化。延长。延长S期，期，DNA复制暂缓，复制暂缓，启动修复机制，修复完成后，重启动修复机制，修复完成后，重新恢复新恢复DNA复制，进入复制，进入S期。期。第五节第五节 逆向转录逆向转录( (ReverseReverse Transcription) Transcription)本世纪之初发现肿瘤本世纪之初发现肿瘤RNARNA病毒病毒。6464年，年，TeminTemin报道了抑制报道了抑制DNADNA合成的放线菌素合成的放线菌素D

56、 D能抑制鸡肉瘤能抑制鸡肉瘤RNARNA病毒的繁殖病毒的繁殖。据此提出鸡肉瘤据此提出鸡肉瘤RNARNA病毒的繁殖须经过形成病毒的繁殖须经过形成DNADNA的阶段。的阶段。7 70 0年年Temin Temin 和和Baltimore Baltimore 两个实验室同时发现，两个实验室同时发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以RNARNA为为模板合成模板合成DNADNA的酶，称为的酶，称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶。聚合酶。遗传信息从遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，即以即以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA称为逆向转录，因

57、此催化这一反应的酶又称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称称逆转录酶逆转录酶。一一 逆向转录酶逆向转录酶由逆转录病毒基因组中由逆转录病毒基因组中polpol基因编码。是一种多基因编码。是一种多功能酶功能酶。有以有以RNARNA为模板和以为模板和以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA的的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性。需要需要RNARNA或或DNADNA做引物；做引物；有核糖核酸酶有核糖核酸酶 H H的活性（在逆转录酶的的活性（在逆转录酶的C C端），端），能从能从3 355和从和从5353水解水解RNARNA，使使RNARNA与与DNADNA的杂交体分离。的杂交体分离。二二 逆向转录过程逆向转录过程 三三 逆向转录酶的生物学意义逆向转录酶的生物学意义1 1 用于合成用于合成cDNAcDNA. . 建立建立cDNAcDNA文库文库( (cDNAcDNA Library) Library)，获得基因或探针获得基因或探针。2 2 与与PCRPCR连用连用 RT-PCRRT-PCR形成开放复合物形成开放复合物Dna AATPATP富含富含AT区区ATP