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1、思考题思考题1 1：培养基配置好后，为什么必须立即培养基配置好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？的？思考题思考题2 2：如果需要配制一种含有某抗生素的如果需要配制一种含有某抗生素的固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或工作浓度）为工作浓度）为50ug/mL50ug/mL，你将如何操作？，你将如何操作？（提示：抗生素在高温下易失效）（提示：抗生素在高温下易失效）实验四实验四 革兰氏染色法革兰氏染色法目的要求1.学习并掌握革兰氏染色法。学习并掌握革兰氏染色法。2.了解革兰氏染色原理。了解革兰氏染色
2、原理。3.巩固显微镜的使用方法及无菌操作技术。巩固显微镜的使用方法及无菌操作技术。v菌种菌种参考菌：参考菌：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(G+), 大肠杆菌大肠杆菌 (G-)待测菌：待测菌：蜡样芽孢杆菌、蓝细菌蜡样芽孢杆菌、蓝细菌(微囊藻微囊藻)v仪器仪器 显微镜显微镜v材料材料 载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、染色缸等吸水纸、染色缸等v染料染料 草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、乙醇、0.5%番红染色液番红染色液v制片制片v初染初染v媒染媒染v脱色脱色v复染复染v镜检镜检主要操作步骤主要操作步骤制片制片v要用活
3、跃生长期的培养物进行革兰氏染色要用活跃生长期的培养物进行革兰氏染色; ;v注意练习无菌操作；注意练习无菌操作；v在载玻片上滴一小滴生理盐水；在载玻片上滴一小滴生理盐水；v取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕迹即可；迹即可；v菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜过厚过厚, ,以免脱色不完全造成假阳性以免脱色不完全造成假阳性v涂片涂片-室温干燥室温干燥-固定固定初染初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液晶紫染色液( (加量以盖满菌膜为度加量以盖满菌膜为度) )，染色，染色1min1mi
4、n。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染媒染 滴加碘液冲去水迹，再染滴加碘液冲去水迹，再染1-2min1-2min，水水洗。洗。脱色脱色 吸水纸吸去多余水分吸水纸吸去多余水分, ,滴加滴加95%95%乙醇，乙醇，脱色脱色20-30s20-30s立即水洗，以终止脱色。立即水洗，以终止脱色。复染复染吸水纸吸去多余水分吸水纸吸去多余水分, ,滴加番红，染色滴加番红，染色2-3min2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。干燥后，置显微镜下观察。干燥后，置显微镜下观察。被染成蓝紫色者即为被染成蓝紫色者即为革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌(G )被染
5、成红色者是被染成红色者是革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌(G-)革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较成分 占细胞壁干重的% 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（10）磷壁酸 含量较高（50） 无类脂质 一般无（ 2） 含量较高（20）蛋白质 无 含量较高vG-菌菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细
6、菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。vG 菌菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层失水、含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层失水、孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即结晶紫的蓝紫色。时的颜色，即结晶紫的蓝紫色。作作 业业结果结果 简述简述4 4种细菌的染色结果（形态、颜色、种细菌的染色结果（形态、颜色、革兰氏染色结果）革兰氏染色结果）思考题思考题 84页，思考题页，思考题1、2、4下一次实验下一次实验: :细菌的芽孢染色和荚膜染色细菌的芽孢染色和荚膜染色
