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1、BJLPbDNA,NASBA,LAMP技术原理与应用比较北京蓝谱生物科技北京蓝谱生物科技日本荣研指定中国日本荣研指定中国LAMP技术推广者技术推广者核酸检测技术变温检测技术 PCR (polymerase chain reaction) LCR(ligase amplification reaction)Real-time PCR等温检测技术LAMP等北京藍譜生物北京藍譜生物核酸等温检测技术信号的放大bDNA (branched DNA)模板的扩增TAS(Transcription-Based Amplification Systems) (self-sustained sequence re
2、plication)(nucleic acid sequence-based amplification)(strand displacement amplification)(loop-mediated isothermal amplification)北京藍譜生物北京藍譜生物BJLP一、bDNA技术原理与应用北京藍譜生物北京藍譜生物bDNA的合成北京藍譜生物北京藍譜生物bDNA检测应用Detection of Trypanosoma brucei spp. in Human Blood by aNonradioactive Branched DNA-Based Technique北京藍譜生
3、物北京藍譜生物bDNA检测技术特征条探针，其中只有两条目标探针要设计，其它探针都可以模块化。目标检测片段不会进行数量扩增。样本处理十分简单，不需要纯化。防止了扩增产物的污染问题。防止了抑制因素可能带来的假阴性问题。试剂无需冷藏保存。采用仪器或照相机检测化学发光。可高通量进行检测不同病原体。北京藍譜生物北京藍譜生物BJLP二、NASBA技术原理与应用北京藍譜生物北京藍譜生物NASBA检测应用北京藍譜生物北京藍譜生物NASBA检测技术特征使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环反响.上游引物带有RNA聚合酶结合位点，下游引物带有检测核苷酸序列，此外，还有一条俘获探针用于固定扩增产物扩增产
4、物是单链，后续操作较复杂连续等温反响,特殊仪器进行检测, 特异性强，灵敏度高，但本钱也非常高昂可与分子信标探针联合使用，进行单管实时荧光检测北京藍譜生物北京藍譜生物BJLPLAMP技术原理与应用53B3B2B1F1CF2CF3CLAMPLAMP引物位置与命名引物位置与命名FIP=F1C+TTTT+F2BIP=B1C+TTTT+B2B3F3(Loop F, Loop B)引物引物m m值的选择值的选择F3,B3F2,B2F1,B160F2,B265北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物北京藍譜生物LAM
5、P引物设计原那么引物间的距离 F2与B2之间的碱基数约为120-180个,F2与F3或者B2与B3间的碱基数为20个以内,F2与F1或者B2与B1之间碱基数为4060个，B1与F1之间可以没有碱基间隔。引物的Tm值正常情况下或者富含GC区域为60-65度，富含AT区域为55-60度。引物末端的稳定性F1C与B1C的5端，F2/B2，F3/B3的3端6个碱基的dG值要小于-4kal/mol.GC含量与二级结构GC含量约40-60%。尽量防止二级结构的产生，尤其是3端。其它事项在目标区域引物以外的序列中存在的限制性内切酶位点，可以用来确认扩增产物。北京藍譜生物北京藍譜生物常用反响体系FIP,BIP
6、: 40pmolF3,B3: 5pmolloopF,B: 20pmoldNTPBetaineTween20: 0.1%(NH4)2SO4: 10mMMgSO4: 8mMKcL: 10mMTris-Hcl(pH8.8): 20mMBst : 8U北京藍譜生物北京藍譜生物Loop引物的引入有助于提高灵敏度，缩短反响时间北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP扩增产物电泳分析Ladder-like pattern in gel-electrophoresis注：电泳分析为说明手段，并不建议在研究中使用北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP结果分析浊度n有无扩增反响可在有无扩增反响可在UV灯下观灯下观测颜色的变化测
7、颜色的变化模板模板: PSA荧光剂荧光剂: Ethidium Bromide (0.5 ug/ml) n有无扩增反响可借助肉眼判断扩有无扩增反响可借助肉眼判断扩增副产物焦磷酸镁存在与否来断增副产物焦磷酸镁存在与否来断定定模板模板:PSA不需要特殊的试剂或仪器不需要特殊的试剂或仪器北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP结果分析荧光在反响液里的钙黄绿素在反响液里的钙黄绿素 (一种螯合试剂一种螯合试剂)与镁离子结合并处于熄灭状态。与镁离子结合并处于熄灭状态。由于由于LAMP扩增反响会生成焦磷酸离子、而这些焦磷酸会与镁离子结合并释放了钙黄绿扩增反响会生成焦磷酸离子、而这些焦磷酸会与镁离子结合并释放了钙黄绿素
8、、这也导致了自由的钙黄绿素分子的熄灭效应终止并发出荧光。素、这也导致了自由的钙黄绿素分子的熄灭效应终止并发出荧光。P P2 2OO7 74-4-dNTPs Pyrophosphate Mn( (white precipitate) )扩增反响扩增反响DNA聚合酶聚合酶MnMn2+2+结合结合Mg2+钙黄绿素钙黄绿素Pyrophosphate Mg( (white precipitate) )+荧光目视检测的反响过程荧光目视检测的反响过程结合结合Template(SARS-CoV)钙黄绿素钙黄绿素MnMn2+2+北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP结果分析仪器特点：方法研究/检测专用，每隔6秒测定反
9、响产物的浊度2.可以设定相应的反响条件与检测要求3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析 4.检测结果图像等可以打印5.实时浊度仪LA-320C可同时检测32个样本，LAMP联管适用LAMP实时浊度仪 LA-320C北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP检测法特征简易操作过程（以甲型流感为例、利用荣研试剂盒）简易操作过程（以甲型流感为例、利用荣研试剂盒）提取咽拭子放在抽取液中加入样本用干粉试管加入反应引物颠倒混合5次干粉状试剂（可常温保存）新型A型结果判断目测或浊度仪RT-LAMP 反应 35分钟提取样本检测完成1小时之内小时之内LAMP=快速、简便、高特异、低成本北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP检测
10、法特征检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反响灵敏。采用4条引物，识别6个位点，特异性强。不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。反响不需要开盖，在一管内完成全部检测。利用Bst酶的链置换功能进行反响。参加反转录酶，可以完成的一步法检测。北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP方法与其他基因扩增法的比较从图表中可以看出，不管是反响步骤还是反响时间，LAMP方法都优于其他方法。北京藍譜生物北京藍譜生物LAMP检测法总结低本低本钱钱只需要一种只需要一种链链置置换换反响聚合反响聚合酶酶。 。不需要特殊的不需要特殊的试剂试剂或或仪仪器。器。简易简易采用恒温扩增反响。不需要先经过变性过程。采用恒温扩增反响。不需要先经过变性过程。快速快速扩增反响可在扩增反响可在 15 60 分钟内完成。分钟内完成。高特异高特异针对六个特定的区域设计四个不同的引物、针对六个特定的区域设计四个不同的引物、LAMP法能准确的对法能准确的对目标基因进行扩增反响。目标基因进行扩增反响。检测可借由判定有无扩增产物来决定。检测可借由判定有无扩增产物来决定。北京藍譜生物北京藍譜生物BJLP谢谢大家北京蓝谱生物科技北京蓝谱生物科技LAMP研究者的家研究者的家
