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1、血浆、血清、体液蛋白质组学血浆、血清、体液蛋白质组学研究及其应用研究及其应用11蛋白组学基本知识蛋白组学基本知识2血浆、血清蛋白组学血浆、血清蛋白组学唾液蛋白组学唾液蛋白组学尿液蛋白组学尿液蛋白组学脑、脊液蛋白组学脑、脊液蛋白组学2一、蛋白组学基本知识一、蛋白组学基本知识334蛋白质组蛋白质组(proteome = protein + genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质全套蛋白质蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics)研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学规律的科学
2、45n n基本生物学问题基本生物学问题基本生物学问题基本生物学问题Post-translational modificationPost-translational modificationProtein-protein interactionProtein-protein interactionGenome-Transcriptome-ProteomeGenome-Transcriptome-Proteomen n临床应用问题临床应用问题临床应用问题临床应用问题Disease marker-diagnosisDisease marker-diagnosisDrug target-therap
3、y Drug target-therapy Proteomics56蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术分离分离Gel-basedLiquid-basedHPLCFFESCX, RP, SECSDS-PAGE, IEF2DE鉴定鉴定MSMALDI-TOF-MSESI-MSMS-MS2D-HPLCMALDI-TOF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MSLC-ESI-MS-MS计算机计算机技术技术67IEF: isoelectric focusing (等电聚焦)2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦
4、分离；第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开HPLC：High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法)DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis基本缩略词基本缩略词iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量同位素标记相对和绝对定量78质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分
5、。离子源又分为：电子轰击源 (Electron Ionization，EI)化学电离源 (Chemical Ionization，CI)场致电离源 (FI)电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。MS：Mass Spectroscopy (质谱)MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。基本缩略词基本
6、缩略词89ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy， 电喷雾质谱MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱基本缩略词基本缩略词910PMF：
7、 Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)， 是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的 肽片段的质量图谱蛋白质组学研究中，质谱测序一般采用两种方式： 一种是利用串联质谱 (MS/MS) 测序； 另一种是利用源后衰变 (PSD：post-source decay) 技术测序基本缩略词基本缩略词IPG(EF)：Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦)1011PMF常用软件常用软件Mascot: Profound: Prowl.rockefeller.eduPepIdent
8、: www.expasy.ch/toolsProteinProspector: Prospector.ucsf.eduPepSea: 195.41.108.381112常用串联质谱检索工具常用串联质谱检索工具SEQUEST: Field.scripps.edu/sequestPepFrag: Prowl.rockefeller.eduProteinProspector: Prospector.ucsf.eduMascot: 1213ESI-MS/MSMAIDI-TOF图像分析确定差异点差异蛋白质质谱分析数据处理与生物信息学分析数据搜寻蛋白质鉴定条件A:样品条件B:样品基于基于2DE的差异蛋白质
9、组分析技术流程的差异蛋白质组分析技术流程1314Provides a hard-copy record of separationAllows facile quantitationSeparation of up to 3000 different proteinsHighly reproducibleGives info on Mw, pI and post-trans modificationsInexpensiveLimited pI range (4-8)Proteins 150 kD not seen in 2D gelsDifficult to see membrane prot
10、eins (30% of all proteins)Only detects high abundance proteins (top 30% typically)Time consuming30% of spots with multiple proteins from pI 4-7 2DE:Advantages & Disadvantages1415传统的基于传统的基于2DE的的差异蛋白质组学分析技术差异蛋白质组学分析技术优点：优点：技术路线成熟技术路线成熟重现性和直观性好重现性和直观性好费用较低费用较低展示差异蛋白质的展示差异蛋白质的PI和和Mw缺点：缺点：蛋白质共迁移蛋白质共迁移(co
11、migration)问题，不适合于很复杂的样品问题，不适合于很复杂的样品线性动态范围较窄线性动态范围较窄强疏水性，强硷性，分子量过大强疏水性，强硷性，分子量过大( 150kD）的）的 蛋白质受到限制蛋白质受到限制1516Proteins quantificationQuantitative analysisSCX RP2D chromatographicseparation of peptides数据处理与数据处理与生物信息学分析生物信息学分析ICAT label cysteines heavy light Combine trypsinizeheavy light 基于基于Shotgun差异
12、蛋白质组分析技术流程差异蛋白质组分析技术流程iTRAQ-LC-MS/MS1617Shotgun Protein IdentificationProtein mixtureProtein digestsSCX column fractionationReverse column separationAuto MS/MS detectionTandem MS spectraBioWorks data base searchResults1718Alleviate some limitations of the 2-DE/MS methodGenerally high throughputProte
13、in identification and quantification is straightforwardprocess is simpleCan be used to ID post-trans. modificationsRequires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibilityRequires high level expertiseShowed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteinsA
14、dvantages DisadvantagesShotgun:Advantages & Disadvantages1819Sensitivity and dynamic range of protein analysis methodsSensitivity Sensitivity Dynamic Range Dynamic Range (Orders of Magnitude)(Orders of Magnitude)Bio-Safe coomassieBio-Safe coomassieG-250 stainG-250 stain5-10ng5-10ng2-32-3Coomassie Bl
15、ueCoomassie BlueR-250 stainR-250 stain10-25ng 10-25ng 2-32-3Silver stain kit Silver stain kit 0.5-1ng0.5-1ng1-21-2SYPRO Ruby protein SYPRO Ruby protein gel staingel stain0.5-1ng0.5-1ng3-43-4MALDI-TOF/TOF-MS MALDI-TOF/TOF-MS 0.5-1pg0.5-1pg3-43-4ESI-MS/MS (ion trap)ESI-MS/MS (ion trap)0.5pg0.5pg3-4 (0
16、.05fmole-1pmole)3-4 (0.05fmole-1pmole)1920IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦)建立于建立于2020世纪世纪8080年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pHpH梯度并参与梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合。丙烯酰胺的共价聚合。优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。优点：与传统两性电解
17、质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达分辨率可达0.001pH, 0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法是目前分辨率最高的电泳方法可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pHpH梯度梯度2021n n使使用用宽宽pHpH范范围围的的胶胶条条（pH pH 3-103-10）可可以以在在同同一一块块凝凝胶胶上上看到样品中绝大多数的蛋白质。看到样品中绝大多数的蛋白质。n n将将有有重重叠叠区区域域的的窄窄pHpH梯梯度度的的胶胶条条联联合合使
18、使用用，也也同同样样可可以得到整个以得到整个pH 3-10pH 3-10范围的结果。范围的结果。n n因因为为绝绝大大多多数数蛋蛋白白聚聚焦焦在在pH pH 3-103-10的的中中间间区区域域，所所以以研研究究人人员员有有时时选选用用非非线线性性梯梯度度的的胶胶条条，这这种种胶胶条条将将两两端端的的pHpH梯梯度度压压得得很很窄窄，却却可可以以使使中中间间区区域域的的蛋蛋白白质质得得到到较好的分离。较好的分离。n n将将窄窄pHpH梯梯度度的的线线性性IPGIPG胶胶条条重重叠叠使使用用，效效果果要要比比用用非非线线性性胶胶条条好好得得多多，它它可可以以检检测测出出样样品品中中更更多多的的蛋
19、蛋白白质质斑点。斑点。pH 梯度范围的选择梯度范围的选择2122蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂有效抑制的酶有效抑制的酶有效抑制的酶有效抑制的酶缺点缺点缺点缺点PMSFPMSF（很常用，使用（很常用，使用（很常用，使用（很常用，使用浓度为浓度为浓度为浓度为1mM1mM）不可逆抑制剂，抑制：不可逆抑制剂，抑制：不可逆抑制剂，抑制：不可逆抑制剂，抑制：1. 1. 丝氨酸水解酶丝氨酸水解酶丝氨酸水解酶丝氨酸水解酶2. 2. 一些般胱氨酸水解酶一些般胱氨酸水解酶一些般胱氨酸水解酶一些般胱氨酸水解酶在含水溶液中很快失活在含水溶液中很快失活在含水溶液中很快失活在含水溶液中很快失活毒性大毒性
20、大毒性大毒性大多肽水解蛋白抑制剂，多肽水解蛋白抑制剂，多肽水解蛋白抑制剂，多肽水解蛋白抑制剂，如：如：如：如：1. 1. 亮肽素亮肽素亮肽素亮肽素leupeptinleupeptin2. 2. 抑肽素抑肽素抑肽素抑肽素pepstatinpepstatin3. 3. 抑肽酶抑肽酶抑肽酶抑肽酶aprotininaprotinin4. 4. 苯丁抑制剂苯丁抑制剂苯丁抑制剂苯丁抑制剂bestainbestain1. 1. 亮肽素抑制多种丝氨亮肽素抑制多种丝氨亮肽素抑制多种丝氨亮肽素抑制多种丝氨 酸和半胱氨酸蛋白酶酸和半胱氨酸蛋白酶酸和半胱氨酸蛋白酶酸和半胱氨酸蛋白酶2. 2. 抑肽素抑制天冬氨酸抑肽素
21、抑制天冬氨酸抑肽素抑制天冬氨酸抑肽素抑制天冬氨酸 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶3. 3. 抑肽酶抑制许多丝氨抑肽酶抑制许多丝氨抑肽酶抑制许多丝氨抑肽酶抑制许多丝氨 酸蛋白酶酸蛋白酶酸蛋白酶酸蛋白酶4. 4. 苯丁抑制剂抑制氨基苯丁抑制剂抑制氨基苯丁抑制剂抑制氨基苯丁抑制剂抑制氨基 酸多肽酶酸多肽酶酸多肽酶酸多肽酶价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵为小分子多肽，在双向为小分子多肽，在双向为小分子多肽，在双向为小分子多肽，在双向电泳结果中出现电泳结果中出现电泳结果中出现电泳结果中出现抑肽素抑肽素抑肽素抑肽素pepstatinpepstatin在在在在pHpH为为为为9 9 时不能起抑制作用时不能起抑制作
22、用时不能起抑制作用时不能起抑制作用1 mM EDTA, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 1 mM EGTA 抑制金属蛋白酶抑制金属蛋白酶抑制金属蛋白酶抑制金属蛋白酶常用蛋白酶抑制剂常用蛋白酶抑制剂2223优点优点: 样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上,能直观可靠确定能直观可靠确定; 对对isoform 的定量较准确的定量较准确; 比传统比传统2DE动态范围有所增加动态范围有所增加.缺点缺点: 标记效率低只标记效率低只Lys的氨基的的氨基的1%左右左右; 受限于受限于2DE的分离能力的分离能力; 受蛋白质在受蛋白质在2DE上共迁移现象的影响
23、上共迁移现象的影响,可能对复杂样品的可能对复杂样品的isoform定量产生影响定量产生影响.Image analysis:differential quantitation Protein extract 1Label with fluor 1Protein extract 2Label with fluor 2Co-separate by 2D PAGEMix labeled extractsImage gelExcitation wavelength 1Excitation wavelength 2Differential analysisImage analysis: Overlay i
24、mages 2-2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)2324n nCys-labelingCys-labelingn nModify before digestModify before digestn nHigh probability of losing PTMHigh probability of losing PTM缺点缺点: 只标记只标记Cys，没有，没有Cys的蛋白质得不到鉴定。的蛋白质得不到鉴定。纯化含纯化含Cys肽段时，肽段时，有效肽段损有效肽段损 失巨大
25、失巨大(达达90%)。ICAT 分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。2H, 1H 标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不 一致现象，使得定量困难一致现象，使得定量困难.ICAT Workflow (技术流程技术流程) 补充补充优点优点: 克服了克服了2DE方法相应的缺点。方法相应的缺点。 只鉴定含只鉴定含cys的肽段的肽段,减少了质谱分析的复杂程度。减少了质谱分析的复杂程度。2425n nIsobaric labeling: N-term + LysIsobaric labeling: N-term
26、+ Lysn nModify after digestModify after digestn nRequires MS/MS measurementsRequires MS/MS measurements优点优点: 全标记，范围广，灵敏度高于全标记，范围广，灵敏度高于ICAT。 可以做绝对定量。可以做绝对定量。缺点缺点: 需要需要MS/MS分折后才能定量分折后才能定量; 酶解后标记样品复杂程酶解后标记样品复杂程 度高度高; 只适合只适合LC-MALDI-TOF/TOF或或LC-MS/MS。iTRAQ Workflow (技术流程技术流程) 补充补充2526The mass differenc
27、e between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each modified amino group: Lys + Protein N-term.D Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue优点：优点： 蛋白水平标记，全标记蛋白水平标记，全标记NH2，范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白 质的分离分法如质的分离分法如2DE，SDS-PAGE等。等。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。缺点：需
28、要用除缺点：需要用除Trypsin 以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。ICPL Workflow (技术流程技术流程) 补充补充ICPL Reagent Structure2627Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 补充补充优点：优点：移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和 降低了数据库搜索的复杂性。降低了数据库搜索的复杂性。标记在标记在C上使得共流出时间一致。上使得共流出时间一致。缺点：同缺点：同ICAT试剂差不多。
29、试剂差不多。2728SILAC Workflow (技术流程技术流程) 补充补充(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)优点：优点： 省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤，省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤， 有利于低丰度蛋白质的检测定量。有利于低丰度蛋白质的检测定量。 完全兼容任何传统的蛋白分离手段。完全兼容任何传统的蛋白分离手段。缺点：缺点： 不能对组织样品进行分析定量。不能对组织样品进行分析定量。 培养细胞在富含稳定同位素介质中生长，培养细胞在富含稳定同位素介质中生长， 可能会影响细胞的繁殖，由此改变蛋白质的可
30、能会影响细胞的繁殖，由此改变蛋白质的 表达水平。表达水平。 昂贵。不适用于人体样品。昂贵。不适用于人体样品。2829Enzymatic labeling: trypsin catalyzed O16 to O18 exchange 补充补充优点：优点： 方便对方便对MS/MS扫描时扫描时Y系列离子的识别。系列离子的识别。 简单，快速。简单，快速。 完全标记，不带倾向性。完全标记，不带倾向性。 不会丢失翻译后修饰信息。不会丢失翻译后修饰信息。缺点：缺点： 不稳定。不稳定。 完全标记后肽段只相差完全标记后肽段只相差4Da。2930Label-free strategies:Extracted io
31、n current (XIC)-based quantification 补充补充优点：优点： 可准确定量。可准确定量。 不需标记，可对任何样品进行定量。不需标记，可对任何样品进行定量。 不丢失任何修饰信息。不丢失任何修饰信息。缺点：缺点： 在样品定量分析时，容易出错。在样品定量分析时，容易出错。 需做平行的两次实验，对仪器，环境等要求高。需做平行的两次实验，对仪器，环境等要求高。 不适合时，两个独立的样品进行多次纯化。不适合时，两个独立的样品进行多次纯化。3031Peptide ions from more abundant proteins would be selected Peptid
32、e ions from more abundant proteins would be selected more frequently in MS spectrummore frequently in MS spectrum. .LC-MS/MS Spectral counts OR number of peptides identified for each protein根据根据spectral counts 的数目直接估计丰的数目直接估计丰度或根据公式计算出一个丰度值度或根据公式计算出一个丰度值例子: emPAI =10PAI-1 where PAI is the number of
33、observed peptides divided by the number of theoretically observable peptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272Semiquantification: Spectral counts 补充补充优点优点: 简单，直接，多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量简单，直接，多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量.缺点缺点: 尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量；不同样本、不同尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量；不同样本、不同LC-MS/MS之间的比较不太准确之间的比较不太准确.31二、血浆二、
34、血浆/血清蛋白组学血清蛋白组学32(Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)3233HUPO PPP2001.10. 国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO)，在美国成立。启动人类蛋白质组计划(HumanProteome Project, HPP). HPP的主要研究目的：鉴定人类基因组编码的全部蛋白质及其功能；揭示：u 构成各种人类组织不同细胞类型的蛋白质表达谱；u 蛋白质组翻译后修饰谱；u 蛋白质组亚细胞定位图；u 蛋白质-蛋白质相互作用关系图；u 蛋白质结构与功能联系图3334HPP首批执行计划：人血
35、浆蛋白质组计划 (Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)人肝脏蛋白质组计划 (Human Liver Proteome Project，HLPP )HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn牵头十多个国家/地区、57个实验室参与HUPO PPP3435HUPOPPP的先期(pilot phase)目标：l 比较不同样本收集、处理和储存过程对蛋白质分析的影响；l 通过分析血浆蛋白质组，比较不同蛋白质组分析技术平台的 敏感性和局限性；l 比较不同高丰度蛋白去除(depletion)方法，以及去除与否 对蛋白鉴定的影响；l 数据提取、整理和储存的标
36、准化目的：l 全面认识人类正常血浆/血清中的全部表达蛋白l 全部表达蛋白在不同生理条件下的变异度 HUPO PPP3536人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的特别意义血清蛋白质组学研究的特别意义Gilbert Omenn，2006.12人血浆蛋白质学的专著人血浆蛋白质学的专著3637人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的独特地位血清蛋白质组学研究的独特地位l l 人血液中蛋白质的来源几乎与所有细胞、组织、器官有关人血液中蛋白质的来源几乎与所有细胞、组织、器官有关人血液中蛋白质的来源几乎与所有细胞、组织、器官有关人血液中蛋白质的来源几乎与所有细胞、组织、器官有关l l 人血液中蛋白质可以直接反映机体的
37、病理、生理状态。即人血液中蛋白质可以直接反映机体的病理、生理状态。即人血液中蛋白质可以直接反映机体的病理、生理状态。即人血液中蛋白质可以直接反映机体的病理、生理状态。即机体中的机体中的 每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录，以排泄物或信号分子的每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录，以排泄物或信号分子的 形式释放到血液中形式释放到血液中l l 人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和/ /或未知生物标志物的或未知生物标志物的或未知生物标志物的或未知生物标志物的 最有价值的标
38、本最有价值的标本最有价值的标本最有价值的标本常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分；常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分；在疾病的早期诊断方面，迫切需要发现更有效的疾病标志物，在疾病的早期诊断方面，迫切需要发现更有效的疾病标志物， 但迄今为止，公认的新的疾病标志物的数量极少。但迄今为止，公认的新的疾病标志物的数量极少。3738人血浆蛋白质总况人血浆蛋白质总况 血浆大约含有血浆大约含有血浆大约含有血浆大约含有7%7%的蛋白质，的蛋白质，的蛋白质，的蛋白质，1%1%的其它物质，的其它物质，的其它物质，的其它物质，92%92%的水分。的水分。的水分。的水分。 这些蛋白质
39、包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、 生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质 血浆蛋白质总数估计在血浆蛋白质总数估计在血浆蛋白质总数估计在血浆蛋白质总数估计在10,00010,000种甚至更多种甚至更多种甚至更多种甚至更多 所含蛋白总量达到所含蛋白总量达到所含蛋白总量达到所含蛋白总量达到60-80m
40、g/ml60-80mg/ml。血浆中总蛋白量的血浆中总蛋白量的99% 由为数不多的由为数不多的22种高丰度蛋白所占有种高丰度蛋白所占有 血浆中蛋白质血浆中蛋白质血浆中蛋白质血浆中蛋白质浓度在一个高动态范围内浓度在一个高动态范围内浓度在一个高动态范围内浓度在一个高动态范围内(9(91212个数量级个数量级个数量级个数量级) )变动变动变动变动 从从从从353550 mg/ml50 mg/ml的血清白蛋白，到的血清白蛋白，到的血清白蛋白，到的血清白蛋白，到110 pg/ml110 pg/ml或更低的趋化因子或更低的趋化因子或更低的趋化因子或更低的趋化因子3839人血浆蛋白质组的组成人血浆蛋白质组的
41、组成a. 组成性蛋白 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用， 如白蛋白，纤维蛋白原等b. 免疫球蛋白 血浆中大约含有数百万种抗体血浆蛋白根据其来源和功能可分为：高丰度蛋白和低丰度蛋白高丰度蛋白：高丰度蛋白：3940低高丰度蛋白低高丰度蛋白c. 组织渗漏蛋白组织渗漏蛋白：组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、 死亡而进入血液的蛋白质，可用于疾病的诊断及愈后评价 如心肌钙蛋白(cardiac troponins)，或心肌球蛋白(myoglobin) 用于诊断心肌梗塞d. “远距离远距离”受体和配体：受体和配体：肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等 生长因子；临时信使，如非激素类的蛋白e.
42、“局部局部”作用的受体和配体：作用的受体和配体：细胞因子及细胞反应调节因子， 如IL-8f. 一过性通过蛋白：一过性通过蛋白：如脂蛋白、溶酶体蛋白酶g. 异常分泌蛋白：异常分泌蛋白：如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤 相关蛋白4041意义：认识疾病演变过程，分离疾病特征标志和药物靶标如：细胞死亡或损伤后被释放到血浆中的组织渗漏蛋白， 肿瘤或其他病变器官释放到血浆中的异常分泌蛋白等特点：种类繁多，性质各异，作用重要，分离和鉴定相当困难h. 外来蛋白：外来蛋白：如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白 及其释放的蛋白i. 小分子量的蛋白及多肽组份：小分子量的蛋白及多肽组份：主要是细胞因子、 多肽类激素
43、及较大蛋白的酶解片断4142A. 人血浆中十种丰度最高的蛋白质，人血浆中十种丰度最高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约90%。B. 人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约9%。 占总量的占总量的1%，其数量多、，其数量多、含量低，但含量低，但最受最受关注。关注。54.31%16.61%3.32%3.64%3.83%1.98%3.45%2.94%1.12%4243血浆蛋白组成复杂，蛋白丰度水平差异巨大血浆蛋白组成复杂，蛋白丰度水平差异巨大43444445从相对分子质量的分布看，从相对分子质量的分布看
44、，10100 kDa的蛋白质占有的蛋白质占有相当大的比例，其中：相当大的比例，其中： 18% 20 k Da 69% 60 k Da 289种血浆蛋白的分子量大小分布4546l 人血浆蛋白是血浆中的所有蛋白质统称，来源广、 组成复杂、种类与数量多人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的特殊性血清蛋白质组学研究的特殊性l 人血浆蛋白质性质的动态范围广，对定量检测要求高l 人血浆蛋白中的高丰度蛋白对与疾病关系更密切的 低丰度蛋白研究的干扰大l 人血浆蛋白质受取材方式的影响较大l 血浆蛋白的不稳定性l 数据间的可比性差4647血浆血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题血清蛋白质组研究中需要着重注意的问
45、题1、样品的选择、样品的选择2、样品的收集与贮存、样品的收集与贮存3、去除高丰度蛋白和分级技术、去除高丰度蛋白和分级技术4、多维策略的运用、多维策略的运用4748蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异很大蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异很大样品的选择样品的选择血浆和血清的形成方式不同，所含蛋白的种类与数量不同血清：纤维蛋白被凝结去除，与纤维蛋白结合的蛋白被损失； 凝结过程中血细胞元素释放大量肽段血浆：抗凝剂 (EDTA、枸橼酸、肝素) 的选择影响研究结果， 尤其是对细胞因子的影响大分析低分子量的蛋白质时：分析低分子量的蛋白质时： 适于选用去除血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品肽
46、组学研究时：肽组学研究时： 最好选用去除血小板的血浆4849样品的收集与样品的收集与贮贮存存收集管：收集管： 商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定；商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定；商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定；商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定； 可能含有一些促凝或抗凝物质；可能含有一些促凝或抗凝物质；可能含有一些促凝或抗凝物质；可能含有一些促凝或抗凝物质； 可能会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆可能会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆可能会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆可能会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆/ /血清中低丰度蛋白的鉴定血清中低丰度蛋白的
47、鉴定血清中低丰度蛋白的鉴定血清中低丰度蛋白的鉴定抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度贮存：贮存： 室温室温4小时或小时或6小时，血样品变化很小小时，血样品变化很小 8小时后、特别是小时后、特别是24小时后小时后质谱分析结果有明显变化质谱分析结果有明显变化 4下下的结果与室温下结果差不多，时间推移到的结果与室温下结果差不多，时间推移到48小时或小时或96小时，小时， 变化非常显著；变化非常显著；长期存放在长期存放在-20，-80，或液氮中，或液氮中没有太大的变化没有太大的变化反复冻融反复冻融次数增加却有很大影响次数增加却有很大影响4950样品的
48、样品的贮贮存与结果存与结果Marshall et al., 2006 FreshPlasma4 hours8 HoursQualitative and quantitative changes to protein profile5051n n1)1)血浆或血清参考样本收集处理血浆或血清参考样本收集处理血浆或血清参考样本收集处理血浆或血清参考样本收集处理必必必必须在须在须在须在2h2h小时内完成小时内完成小时内完成小时内完成；n n2)2)血浆采用用加入血浆采用用加入血浆采用用加入血浆采用用加入1.0ml1.0ml枸橼酸钠枸橼酸钠枸橼酸钠枸橼酸钠(0.105mol/L)(0.105mol/L)
49、抗凝剂抗凝剂抗凝剂抗凝剂( (与血的比例为与血的比例为与血的比例为与血的比例为1:9)1:9)或者采用喷雾干燥的或者采用喷雾干燥的或者采用喷雾干燥的或者采用喷雾干燥的EDTAEDTA为为为为抗凝剂抗凝剂抗凝剂抗凝剂；血清在室温下；血清在室温下；血清在室温下；血清在室温下30min30min内用内用内用内用微粉硅胶促凝微粉硅胶促凝微粉硅胶促凝微粉硅胶促凝后分离。分别收集后分离。分别收集后分离。分别收集后分离。分别收集10ml10ml。n n3) 3) 分离在分离在分离在分离在2-62-6下操作下操作下操作下操作( (枸橼酸血浆，枸橼酸血浆，枸橼酸血浆，枸橼酸血浆，血小板计数要小于血小板计数要小于
50、血小板计数要小于血小板计数要小于130/ul) 130/ul) 。离心。离心。离心。离心后混合即分装到后混合即分装到后混合即分装到后混合即分装到250ul250ul硅烷化硅烷化硅烷化硅烷化EPEP管管管管中，中，中，中，-70-70保存。保存。保存。保存。n n4) 4) 无无无无HIVHIV、HBVHBV、HCVHCV、HTLV-1 HTLV-1 ( (人类人类人类人类T T细胞亲淋巴病毒细胞亲淋巴病毒细胞亲淋巴病毒细胞亲淋巴病毒1 1型型型型) )、 梅毒，无任何肝损伤。梅毒，无任何肝损伤。梅毒，无任何肝损伤。梅毒，无任何肝损伤。n n5)5)整个过程整个过程整个过程整个过程不加不加不加不
51、加cocktailcocktail等蛋白酶等蛋白酶等蛋白酶等蛋白酶抑制剂。抑制剂。抑制剂。抑制剂。n n6)6)所有所有所有所有供血者应清晨空腹取血；供血者应清晨空腹取血；供血者应清晨空腹取血；供血者应清晨空腹取血；24h24h内无服药和酒。内无服药和酒。内无服药和酒。内无服药和酒。n n此后的血浆蛋白质组学研究大多此后的血浆蛋白质组学研究大多此后的血浆蛋白质组学研究大多此后的血浆蛋白质组学研究大多 采用了这一套程序。采用了这一套程序。采用了这一套程序。采用了这一套程序。Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Mol Cell Proteom
52、ics.2003,2: 1096-1103HUPO PPP在先期研究中采用的统一样本标准在先期研究中采用的统一样本标准5152n n4 4下处理血液标本，下处理血液标本，下处理血液标本，下处理血液标本，2h2h内尽快分离血清及细胞；内尽快分离血清及细胞；内尽快分离血清及细胞；内尽快分离血清及细胞；n n用用用用U9U9缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀释血清稀释血清稀释血清稀释血清后，可以后，可以后，可以后，可以24h24h内在室温下运送或对血清及内在室温下运送或对血清及内在室温下运送或对
53、血清及内在室温下运送或对血清及WCXWCX（弱阳离（弱阳离（弱阳离（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作；子交换）磁珠结合过程进行操作；子交换）磁珠结合过程进行操作；子交换）磁珠结合过程进行操作；n n血清应分装并长期储存在血清应分装并长期储存在血清应分装并长期储存在血清应分装并长期储存在-80-80或液氮，但限冻融或液氮，但限冻融或液氮，但限冻融或液氮，但限冻融1 1次；次；次；次；n n溶血标本应弃用，建议重新取血。溶血标本应弃用，建议重新取血。溶血标本应弃用，建议重新取血。溶血标本应弃用，建议重新取血。刘建栋 等。基础医学与临床, 2007, 27(2)193-197CHAPS: 3-(3
54、-胆酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸, 两性离子表面活性剂DTT: 二硫苏糖醇(dithiothreitol), 还原剂用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、运送、操作及储存的标准建议条件运送、操作及储存的标准建议条件5253高丰度蛋白的去除和分级技术高丰度蛋白的去除和分级技术5354高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测A: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin b-chainE: a1-AntitrypsinPPI Website Oct 2002，P
55、lasma Proteome Institute5455IPG4-7A:原血B:低丰度蛋白IPG4-7未去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测-肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后2-D分离结果分离结果5556高丰度蛋白的去除策略高丰度蛋白的去除策略亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离抗体的亲和法抗体的亲和法抗体的亲和法抗体
56、的亲和法染料的亲和法染料的亲和法染料的亲和法染料的亲和法抗体亲和法抗体亲和法抗体亲和法抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白染料亲和法染料亲和法染料亲和法染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键通过高丰度蛋
57、白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。5657正常人血浆正常人血浆MARSMARS亲合柱亲合柱（结合组分（结合组分-BF-BF、流出组分、流出组分-FF-FF）结合组分、流出组分蛋白结合组分、流出组分蛋白的胰蛋白酶切的胰蛋白酶切肽段的阳离子交换色谱分离肽段的阳离子交换色谱分离反相色谱分离离子阱质谱鉴定
58、反相色谱分离离子阱质谱鉴定SequestSequest软件数据检索软件数据检索SepproTM MIXED12SepproTM MIXED12亲合柱亲合柱（结合组分（结合组分-BF-BF、流出组分、流出组分-FF-FF ）数据整合与分析数据整合与分析去除血浆高丰度蛋白的技术路线去除血浆高丰度蛋白的技术路线5758MechanismMechanismMethodsMethodsShortcomingShortcomingMeritMeritbiochemical biochemical biophysicalbiophysicalmolecular weight, molecular weigh
59、t, density, density, hydrophobicity, hydrophobicity, surface charge and surface charge and isoelectric point. isoelectric point. not protein-not protein-specific, specific, variable variable capacities, capacities, limited limited reproducibilityreproducibility simple, simple, convenientconvenientaf
60、finity affinity capturecapturedye affinitydye affinityonly deplete only deplete albumin, albumin, nonspecificnonspecificcheapcheapImmuno-Immuno-affinity affinity capturecapture antibody-based systemantibody-based systemexpensiveexpensivedeplete multi-deplete multi-high abundant high abundant protein
61、sproteinsHPPPAttempts for the depletion of high abundant proteins5859多重亲和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆多重亲和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆2DGE图谱图谱安捷伦高丰度蛋白去除柱安捷伦高丰度蛋白去除柱 (MARC)5960商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统ProteomeLab IgY蛋白质组分组分离系统蛋白质组分组分离系统(Beckman Coulter 公司公司)ProteoExtract Albumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒 (ME
62、RCK公司公司)AurumSerum高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒(Bio-Rad公司公司) Agilent Multiple Affinity Removal Column (MARC)安捷伦高丰度蛋白去除柱安捷伦高丰度蛋白去除柱 (安捷伦公司安捷伦公司)ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血浆中去除血浆中20种高丰度蛋白种高丰度蛋白 (Sigma-Aldrich公司公司)6061LH6 6种高丰度蛋白种高丰度蛋白同时清除同时清除HHLLLLLLL LLLHHHHHHHLLLL人体血清人体血清 样本样本低丰度蛋白低
63、丰度蛋白低丰度蛋白低丰度蛋白高丰度蛋白高丰度蛋白血清血清/血浆高丰度蛋白清除柱血浆高丰度蛋白清除柱抗抗-白蛋白白蛋白-树脂树脂抗抗-转铁蛋白转铁蛋白-树脂树脂抗抗-结合珠蛋白结合珠蛋白-树脂树脂抗抗- 1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-树脂树脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白A-树脂树脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白G-树脂树脂AB问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？各抗体以特定比率混合装填成色谱柱各抗体以特定比率混合装填成色谱柱6162血浆蛋白组成复杂，蛋白质组学研究技术各有利弊，单一技术平台不能达到最佳分离效果。血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白
64、组学研究的多维策略联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段主要包括：去除高丰度蛋白样本预分离系统分离系统质谱鉴定系统6263血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略获得了325个完整的蛋白质 u 高丰度蛋白去除高丰度蛋白去除+色谱分离色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定联合质谱鉴定两名健康男性血清免疫亲和吸附法去除血清8种主要的高丰度蛋白色谱预分离(pre-fractionation)， 离子交换色谱(anion-exchange chromatography，AEC) 分子筛色谱(size-exclusion chromatography，SEC)2-DE分离富
65、集的低丰度蛋白组分(fractions)近3700个蛋白质点MALDI-TOF质谱鉴定LC-MS/MS串联质谱进一步分析未能鉴定的蛋白质点Pieper R. et al. 2003, Proteomics, 3(4):422-4326364血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 鸟枪测序法(Shotgun sequencing)，即高丰度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱 + 反相色谱)分离 + 质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)Adkins JN. et al. 2002, Mol Cell Proteomics, 1(12):9
66、47-955女性志愿者血清protein A/G吸附去除免疫球蛋白胰蛋白酶对血浆全蛋白酶解强阳离子交换(strong cation exchange, SCX)反相(reversed phase)色谱分离电喷雾液相离子阱质谱(LCQ Ion Trap)鉴定490种不同血浆蛋白 蛋白质鉴定效率提高了3-5倍操作繁杂，自动化程度比较低影响因素较多稳定性有待提高6465血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 血浆全蛋白预分离(色谱聚集+反相高压液相色谱) + 组分胰蛋白酶酶解 + 串联质谱鉴定 (LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+MALDI-TOF-TOF-
67、MS )Beckman Coulter公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血浆蛋白预分离系统血浆蛋白先经多维色谱分离分离组分经胰蛋白酶酶解质谱鉴定克服了2-DE的缺点，操作简单，自动化程度高，简化了信息处理提高了低丰度蛋白质、膜蛋白、分子量特别大和特别小的蛋白质的分离检测能力回收率高，能保持蛋白质的完整性和活力。6566血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 多重窄pH范围2-DE+联合质谱鉴定(MALDI-TOF+LC-MS/MS)Starita Geribaldi M et al. 2003, Proteomics, 3(8
68、):1611-19使用相差1个pH范围的多重固相pH梯度干胶条，大大提高了传统2-DE的分离效率MALDI-TOF + LC-MS/MS联合质谱分析蛋白质鉴定的效率增长两倍，极酸和极碱性蛋白质的分离和鉴定效果6667血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 非变性等电聚焦预分离 + 变性等电聚焦预分离 + 1D分离 + 质谱鉴定(LC/MS/MS )Giometti在非变性条件下(不破坏蛋白质的三级结构)进行二维电泳分离分离到的蛋白质仍然保持原始状态使蛋白质生物功能和蛋白质之间相互作用的检测成为可能克服了传统2-DE (采用变性条件)的缺陷Manabe等通过采用非变性二
69、维电泳与变性二维电泳相结合的方法血浆中分离，鉴定出多个IgG结合蛋白6768血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u SELDI-TOF分离 + Q-TOF质谱鉴定表面增强激光解吸/离子化 -飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一种以固相表面亲和为基础的质谱分离技术完整血浆蛋白先经过与不同亲和表面(化学表面芯片和生物表面芯片)结合纯化SELDI质谱分离Q-TOF质谱鉴定差异蛋白质，尤其是小分子蛋白血浆蛋白的分离和鉴定中与上述其他技术具有很大的互补性用于疾
70、病相关的血浆蛋白质组研究6869血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略进行OGE之前用免疫方法去除6个血浆中的主要蛋白质，用1.5 mg分离组分，顺利获得81种蛋白质，其中仍有1个免疫球蛋白u 脱离凝胶电泳(Off-gel electrophoresis，OGE)技术Heller M. et al, 2005, Electrophoresis, 26(6):1174-88应用OGE技术经2个步骤将完整的蛋白质和肽段分解成散在的液态片段LC-MS/MS分析肽片段用1.5 mg人血浆蛋白获得了53个蛋白质，其中10个为不同的免疫球蛋白12 mg人血浆蛋白，获得73个蛋白，其
71、中15个与免疫球蛋白相关处于试验阶段处于试验阶段6970血清血清/血浆蛋白组学研究中多维策略的优势血浆蛋白组学研究中多维策略的优势2D1D3D4DPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/Serum1 LC-MS/MSrun20-40 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs1D SDSPAGEMicroSol-IEF1D SDSPAGE1D SDSPAGEMicroSol-IEFMajor ProteinDepletion100 800-10002000+2800+UniqueProte
72、insMicroSol-IEF：microscale solution IEF 微量等电聚焦电泳7071血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用生物标志物的识别淀粉样变和沉积疾病遗传性疾病免疫蛋白质组学脂质组学降解组学和多肽组学7172血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用淀粉样变和沉积疾病淀粉样变和沉积疾病遗传性疾病遗传性疾病免疫蛋白质组学免疫蛋白质组学脂质组学脂质组学淀粉样变病(amyloidosis)是指一些以折叠结构的纤维蛋白(鉴定成分)为主的淀粉样物质在器官组织细胞外沉积所引起的疾病如先天性糖代谢缺乏综合征识别组织相容复合物(MHC)、特
73、异抗体的抗原、外源病毒或疾病产生的蛋白识别脂蛋白及结合蛋白7273血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用降解组学和多肽组学降解组学和多肽组学识别与鉴定与疾病、生物过程中蛋白代谢特异相关的多肽生物标志物生物标志物 (Biomarkers)生物标志物现特指疾病或机体状态的信息指标，如基因序列或突变、mRNA 表达谱或组织蛋白等。主要指正常生物学过程、致病过程或正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药理反应等过程的一种生物指标干预疗法的药理反应等过程的一种生物指标FDA在“药物基因组学“提出”有效生物标志物“有效生物标志物有效生物标志物”是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学
74、、是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标药理学或者临床意义的指标”7374血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用理想的生物标志物具有的特点与疾病发生、发展机制紧密相关：与疾病发生、发展机制紧密相关：具有较好的诊断、危险性分类具有较好的诊断、危险性分类 和预后评估的价值和预后评估的价值真实性真实性 具有良好的灵敏度和特异性具有良好的灵敏度和特异性具有可预测性具有可预测性 常用预测值常用预测值 (predictive value，PV) 表示，包括阳性预测值表示，包括阳性预测值(PPV) 和阴性预测值和阴性预测值 (NPV)能有效地用于临床疾病的
75、分型能有效地用于临床疾病的分型检测方法可实现标准化检测方法可实现标准化 易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当7475Petricoin等用疏水型芯片结合并分离了卵巢癌患者血浆相关蛋白，在肿瘤和健康血清之间发现了5个差异明显的蛋白质峰，它们共同构成卵巢癌诊断模型用该模型对肿瘤和健康人血浆进行盲筛，该模型诊断肿瘤的敏感性为100%，特异性为95%血清血清/血浆蛋白组学研究的实例血浆蛋白组学研究的实例7576Li等选用金属离子鳌合芯片结合并分离乳腺癌血浆蛋白，发现3个乳腺癌特异的差异蛋白峰。用这3个特异蛋白标志盲筛一
76、组乳腺癌和健康人血浆蛋白，乳腺癌检出的敏感性为93%，特异性为91%血清血清/血浆蛋白组学研究的实例血浆蛋白组学研究的实例7677三、尿蛋白质组学三、尿蛋白质组学Urinary Proteomics7778尿蛋白质组学研究的独特地位标本获得上：方便、无害、量大保存上：相对稳定尿液中的蛋白质组成尿液中的蛋白质组成可溶性蛋白固相成分正常人的尿液中存在1500种以上的蛋白质来源于大蛋白质分子裂解的大量多肽片段7879尿蛋白质的来源：可溶性蛋白尿蛋白质的来源：可溶性蛋白来源来源 注释注释 肾小球滤过肾小球滤过肾小球滤过肾小球滤过(Glomerular (Glomerular filtration of
77、 filtration of plasma plasma proteins) proteins) 正常尿液中含量正常尿液中含量正常尿液中含量正常尿液中含量 150 mg/ 150 mg/日；肾小球滤过功能降低会增日；肾小球滤过功能降低会增日；肾小球滤过功能降低会增日；肾小球滤过功能降低会增加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；加尿液中高分子量蛋白（如清蛋白）的含量；近端肾小管近端肾小管近端肾小管近端肾小管（proximal tubuleproximal tubule）吸收功能降低或血浆中）吸收功能降低或血浆中）吸
78、收功能降低或血浆中）吸收功能降低或血浆中异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如异常的低分子量蛋白会增加尿液中低分子量蛋白（如 2 2- -微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素微球蛋白、免疫球蛋白轻链、生素A A键合蛋白）以及氨基键合蛋白）以及氨基键合蛋白）以及氨基键合蛋白）以及氨基酸的含量。酸的含量。酸的含量。酸的含量。 上皮细胞分泌上皮细胞分泌上皮细胞分泌上皮细胞分泌(Epithelial cell (Epithelial cell sec
79、retion of secretion of soluble soluble proteins) proteins) 来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（来自胞外分泌的蛋白，如表皮生长因子（EGFEGF）由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（由糖基化磷脂酰化肌醇锚定蛋白（glycosyl glycosyl phosphatidyl inositol-anchored proteinphosphatidyl inositol-anchored protein）分解得到的）分
80、解得到的）分解得到的）分解得到的蛋白，如蛋白，如蛋白，如蛋白，如Tamm-HorsfallTamm-Horsfall蛋白蛋白蛋白蛋白 （Tamm-Horsfall Tamm-Horsfall proteinprotein）。）。）。）。 7980尿蛋白质的来源：固相成分尿蛋白质的来源：固相成分来源来源 注释注释 上皮细胞上皮细胞上皮细胞上皮细胞( (注注注注1)1)1. 1. 全细胞脱落全细胞脱落全细胞脱落全细胞脱落2. 2. 质膜与细胞内质膜与细胞内质膜与细胞内质膜与细胞内成分脱落成分脱落成分脱落成分脱落3. 3. 免疫细胞胞外免疫细胞胞外免疫细胞胞外免疫细胞胞外体体体体(exosomes)
81、(exosomes)分分分分泌泌泌泌1.1.在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加，在某些疾病状态，尿中会出现上皮细胞数量增加， 包括：在包括：在包括：在包括：在急性肾小管坏死时的急性肾小管坏死时的急性肾小管坏死时的急性肾小管坏死时的肾小管细胞脱落，肾小管细胞脱落，肾小管细胞脱落，肾小管细胞脱落， 肾小球疾病时的足突状细胞脱落肾小球疾病时的足突状细胞脱落肾小球疾病时的足突状细胞脱落肾小球疾病时的足突状细胞脱落( (podocyte shedding)podocyte shedding)2.2.可能与非特
82、异性的肾脏损伤或凋亡过程有关可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关可能与非特异性的肾脏损伤或凋亡过程有关3. 3. ExosomesExosomes又称外泌体又称外泌体又称外泌体又称外泌体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体，是由细胞分泌到胞外的囊泡状小体, , 体内多种细胞体内多种细胞体内多种细胞体内多种细胞 如如如如T-cells, mast cells, DCs, platelets, T-cells, mast cells, DCs, platelets, neurons, epithel
83、ial Cells neurons, epithelial Cells可以分泌外泌体。可以分泌外泌体。可以分泌外泌体。可以分泌外泌体。其它细胞其它细胞其它细胞其它细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞在某些疾病状态，尿中会出现红细胞，白细胞，或肿瘤细胞（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）（如膀胱癌细胞，淋巴瘤细胞）注注1：上皮细胞包括尿足细胞（：上皮细胞包括尿足细胞（urinary podocytes）、尿道上皮细胞在内的各种
84、泌尿器管道的）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的 上皮细胞上皮细胞8081尿蛋白质组学的研究意义尿蛋白质组学的研究意义n nin the early diagnosis in the early diagnosis of diseaseof disease n nin classification of in classification of disease with regard to disease with regard to likely therapeutic likely therapeutic responsesresponses n nin assessment of in
85、 assessment of prognosisprognosis n nin monitoring in monitoring response to therapyresponse to therapy n nThese approaches have These approaches have potential value, not only in potential value, not only in diseases of the diseases of the kidney kidney and urinary tractand urinary tract, but also
86、, but also in in systemic diseasessystemic diseases that that are associated with are associated with circulating small-protein circulating small-protein and peptide markers that and peptide markers that can pass the glomerularcan pass the glomerular ( (血管小球的血管小球的) filter.) filter.8182一个经典流程一个经典流程尿蛋
87、白质组学的研究范例尿蛋白质组学的研究范例1D：one-dimensional; HPLC：high-performance liquid chromatography HAS： human serum albumin MW：molecular weight LC：liquid chromatography MS：mass spectrometry SDS：sodium dodecyl sulfate8283以1D SDS 和 RP HPLC对尿蛋白质组进行分离和分级对分离和分级后的蛋白质组成份进行胶上或溶液内酶解，以LTQ-FT 和 LTQ-Orbitrap两种质谱仪进行MS、MS-MS分析从
88、十名健康受试者的尿中鉴定出了1543种蛋白尿蛋白质组学的研究范例尿蛋白质组学的研究范例Gene Ontology (GO)分析表明, 几乎有一半是膜蛋白几乎有一半是膜蛋白细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集尿中的细胞质膜蛋白可能来自尿中的细胞质膜蛋白可能来自exosomes的分泌的分泌Gene Ontology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。GO表示各物种的基因功能分类体系，较全面地概括了基因的功能信息。在基因表达谱分析中，GO
89、常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，可发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。8384acetone precipitation（丙酮沉淀）（丙酮沉淀）Ultracentrifugation（超速离心）（超速离心）The urine samples were fractionated by two different methods. The proteins were separated by 2D-PAGE. 尿蛋白的分离84852-DE comparing the urine of septic（败血症） rat
90、s without ARF to septic rats with ARFn nUrine was pooled from three Urine was pooled from three animals for each group. animals for each group. n nRedRed indicates indicates increased proteinincreased protein abundance with ARF(Acute abundance with ARF(Acute Renal Failure, Renal Failure, 急性肾功能衰竭急性肾功
91、能衰竭) ) n nGreenGreen indicates indicates decreased decreased proteinprotein abundance with ARF abundance with ARF n nYellowYellow indicates indicates no changeno change in in abundance abundance n nThe spot labeled A is ventral The spot labeled A is ventral prostate-specific protein which prostate-s
92、pecific protein which did not change in abundancedid not change in abundance8586激素敏感型与激素耐药型先天性肾病综合征的SELDI-TOF-MS研究尿蛋白组学研究举例n n激素敏感型（激素敏感型（Steroid-SensitiveSteroid-Sensitive，SSSS）INSINS与与激素耐药型（激素耐药型（steroid-resistantsteroid-resistant，SRSR）INSINS的临的临床鉴别难度大，临床的极早期诊断意义重大床鉴别难度大，临床的极早期诊断意义重大n nRobert P. W
93、oronieckiRobert P. Woroniecki等建立了一种基于等建立了一种基于SELDI-TOF-MSSELDI-TOF-MS的研究策略，的研究策略，分别以分别以CM10CM10， IMAC 30IMAC 30，H50H50和和Q10Q10蛋白质芯片对蛋白质芯片对激素敏感激素敏感型型NSNS、激素耐药型、激素耐药型NSNS进行分析进行分析8687n n使用不同的蛋白质芯片分析激素敏感型使用不同的蛋白质芯片分析激素敏感型INSINS或或激素耐药型激素耐药型INSINS患者尿样，在不同的相对分子患者尿样，在不同的相对分子质量区域出现了差异蛋白条带质量区域出现了差异蛋白条带n n经经BP
94、SBPS综合分析，最终确认质量数综合分析，最终确认质量数4,144 Da4,144 Da的的条带在从激素敏感型条带在从激素敏感型NSNS患者中鉴别激素耐药型患者中鉴别激素耐药型NSNS患者具有特别重要的意义。患者具有特别重要的意义。8788四、唾液蛋白质组学四、唾液蛋白质组学Salivary Proteomics8889概念以以“ “组学组学” ”的研究思路寻找、发现和鉴定唾液中与疾病发生、的研究思路寻找、发现和鉴定唾液中与疾病发生、发展、治疗过程相关的生物标志物（蛋白质、多肽），发展、治疗过程相关的生物标志物（蛋白质、多肽），阐明疾病的发病机理，建立新的临床诊断指标阐明疾病的发病机理，建立新
95、的临床诊断指标8990n n唾液（唾液（SalivaSaliva）主要是腮腺、）主要是腮腺、舌下腺、下颌下腺的分泌产舌下腺、下颌下腺的分泌产物物 n n唾液与血液、尿液一样，在唾液与血液、尿液一样，在疾病的临床筛查、诊断中具疾病的临床筛查、诊断中具有重要意义的诊断样品。有重要意义的诊断样品。n n人体的多种疾病、影响唾液人体的多种疾病、影响唾液成份，成份，唾液蛋白成分可提供唾液蛋白成分可提供局部或全身性病症的线索和局部或全身性病症的线索和状况状况。 唾液(Saliva)及对疾病的诊断意义 下颌下腺下颌下腺(submandibular, SM) 舌下腺舌下腺 (sublingual, SL)腮腺
96、腮腺( (parotid) )三叉神经三叉神经面神经面神经9091水分水分(99%)酶酶酶阻滞物酶阻滞物生长因子生长因子细胞因子细胞因子免疫球蛋白免疫球蛋白粘液素粘液素糖蛋白糖蛋白少量无机盐等少量无机盐等唾液的成分唾液的成分9192n na a：血清成分的选择性主动转运：血清成分的选择性主动转运n nb b：脂溶性成分的被动扩散：脂溶性成分的被动扩散n nc c：选择性成分的简单过滤：选择性成分的简单过滤n nd d：腺泡细胞活化泵将水合：腺泡细胞活化泵将水合NaNa+ +转运至转运至 唾液腺导管唾液腺导管n ne e：唾液腺导管细胞将低渗唾液中的：唾液腺导管细胞将低渗唾液中的 Na Na+
97、+泵回血液。泵回血液。n n图中，图中，f f为细胞膜，为细胞膜，g g为细胞膜孔，为细胞膜孔，h h为细为细胞间隙，胞间隙，i i为腺泡细胞。为腺泡细胞。唾液成分与血清成分是有密切的关系唾液成分与血清成分是有密切的关系 唾液分泌与血清关系唾液分泌与血清关系9293唾液中的主要功能蛋白质SalivaryFamiliesAnti-BacterialBufferingDigestionMineral-izationLubrication & ViscoelasticityTissueCoatingAnti-FungalAnti-ViralCarbonic anhydrases(脱水酶),Hista
98、tins(富组蛋白)Amylases(淀粉酶),Mucins(粘蛋白), Lipase(脂酶)Cystatins(胱蛋白),Histatins,Proline-rich proteins,StatherinsMucins, StatherinsAmylases,Cystatins, Mucins, Proline-rich proteins, StatherinsHistatinsCystatins,MucinsAmylases, Cystatins,Histatins, Mucins,Peroxidases蛋白类9394唾液蛋白质组学的主要研究内容唾液蛋白质组学的主要研究内容n n发现新的唾
99、液生物标志物（发现新的唾液生物标志物（发现新的唾液生物标志物（发现新的唾液生物标志物（salivary salivary biomarkersbiomarkers）与）与）与）与药物作用靶点药物作用靶点药物作用靶点药物作用靶点n n唾液蛋白质组学的分析技术唾液蛋白质组学的分析技术唾液蛋白质组学的分析技术唾液蛋白质组学的分析技术n n齿龈沟液（齿龈沟液（齿龈沟液（齿龈沟液（gingival crevicular fluidgingival crevicular fluid）的蛋白质）的蛋白质）的蛋白质）的蛋白质组学分析组学分析组学分析组学分析n n肿瘤诊断中的唾液蛋白质组学肿瘤诊断中的唾液蛋白质
100、组学肿瘤诊断中的唾液蛋白质组学肿瘤诊断中的唾液蛋白质组学n n舍格伦综合征（舍格伦综合征（舍格伦综合征（舍格伦综合征（Sjogrens SyndromeSjogrens Syndrome）的蛋白质）的蛋白质）的蛋白质）的蛋白质组学组学组学组学 （舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，特征（舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，特征（舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，特征（舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，特征: : 外分泌腺的进行性破坏外分泌腺的进行性破坏外分泌腺的进行性破坏外分泌腺的进行性破坏; ; 粘膜及粘膜及粘膜及粘膜及结膜干燥，伴有各种自身免疫性病征。结膜干燥，伴有各种自身免疫性病征。结膜干燥
101、，伴有各种自身免疫性病征。结膜干燥，伴有各种自身免疫性病征。90%90%发生于中年妇女。主要临床表现发生于中年妇女。主要临床表现发生于中年妇女。主要临床表现发生于中年妇女。主要临床表现为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎）为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎）为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎）为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎）n n糖尿病患者的唾液分析糖尿病患者的唾液分析糖尿病患者的唾液分析糖尿病患者的唾液分析n n唾液转录组学（唾液转录组学（唾液转录组学（唾液转录组学（saliva transcriptomics
102、saliva transcriptomics）9495国外研究进展国外研究进展n n美国加利福尼亚大学洛杉叽分校美国加利福尼亚大学洛杉叽分校于于20042004年开展了年开展了UCLAUCLA人类人类 唾液蛋白质组计划（唾液蛋白质组计划（Human Human Salivary Proteome ProjectSalivary Proteome Project）n n美国国立卫生研究院（美国国立卫生研究院（NIHNIH）已）已于于20052005年开展了名为年开展了名为“ “Salivary Proteomics in Salivary Proteomics in Disease and He
103、alth”Disease and Health”的研究项的研究项目目 9596全唾液蛋白质谱研究全唾液蛋白质谱研究n nShen HuShen Hu等用等用LC MS/MSLC MS/MS鸟枪法和鸟枪法和2-DE 2-DE MSMS对人唾液蛋白质组开展了大规模鉴对人唾液蛋白质组开展了大规模鉴定，使用两种策略一共在全唾液中鉴定定，使用两种策略一共在全唾液中鉴定出出310310种蛋白种蛋白n n其中最主要的酸性蛋白质包括组织蛋白其中最主要的酸性蛋白质包括组织蛋白酶酶L L（cathepsin Lcathepsin L，pI 4.36pI 4.36）、透明质）、透明质素结合蛋白（素结合蛋白（hyal
104、uronan-binding hyaluronan-binding proteinprotein，pI 4.38pI 4.38）n n最主要的碱性蛋白是唾液富脯氨酸糖蛋最主要的碱性蛋白是唾液富脯氨酸糖蛋白白PRB2PRB2（salivary proline-rich salivary proline-rich glycoprotein PRB2glycoprotein PRB2，pI 12.03pI 12.03）和一个）和一个等电点在等电点在12.0812.08的未知蛋白的未知蛋白n n所鉴定的蛋白中最微量的蛋白是所鉴定的蛋白中最微量的蛋白是T T细胞细胞受体受体 链片段（链片段（T-cell
105、 receptor delta T-cell receptor delta chain fragmentchain fragment，Mr 2.9 kDaMr 2.9 kDa）、防御）、防御素素HNP-3 HNP-3 链链A A（defensin HNP-3, defensin HNP-3, chain Achain A，Mr 3.5 kDaMr 3.5 kDa），后者是从），后者是从人人的的嗜中性白细胞分离纯化出嗜中性白细胞分离纯化出的的3 3种阳离种阳离子小肽子小肽（HNP-1HNP-1、HNP-2HNP-2与与 HNP-3HNP-3）中的一种，具有中的一种，具有抑制艾滋病病毒复制抑制艾滋
106、病病毒复制的的功能功能n n相对分子质量最大的蛋白质是粘蛋白相对分子质量最大的蛋白质是粘蛋白5B5B（mucin 5Bmucin 5B，Mr 590 kDaMr 590 kDa）9697五、脑脊液蛋白质组学五、脑脊液蛋白质组学Cerebrospinal fluid Proteomics9798n 脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经 系统疾病有关n 脑脊液：无色透明，充满在各脑室、蛛网膜下腔和 脊髓中央管内。脑脊液由脑室中的脉络丛产生， 与血浆和淋巴液的性质相似n 脑脊液产生过多，或循环通路受阻，均可导致颅内压脑脊液产生过多，或循环通路受阻，均可导致颅内压 升高。患中枢神经系统疾病时
107、，常常要作腰椎穿刺吸取升高。患中枢神经系统疾病时，常常要作腰椎穿刺吸取 脑脊液检查，以协助诊断脑脊液检查，以协助诊断脑脊液及脑脊液蛋白组学研究意义脑脊液及脑脊液蛋白组学研究意义9899CSF 取样取样腰椎穿刺(Lumbar puncture, LP)法：每日同一时间取样， 不需禁食采样量：10-30mL样品收集、保存：1000xg离心，去细胞碎片，分装0.5 mL 聚丙烯管，-80 保存保存micro-BCA protein assay kit (Pierce)micro-BCA protein assay kit (Pierce)测定蛋白浓度测定蛋白浓度99100脑脊液的双向荧光差异凝胶电泳
108、分析脑脊液的双向荧光差异凝胶电泳分析(2-D DIGE)脑脊液蛋白组学分析举例脑脊液蛋白组学分析举例n 以亲和柱技术除去清蛋白，以亲和柱技术除去清蛋白，以亲和柱技术除去清蛋白，以亲和柱技术除去清蛋白，IgGIgG，-1-1-抗胰蛋白酶，抗胰蛋白酶，抗胰蛋白酶，抗胰蛋白酶， IgAIgA，运铁蛋白，结合珠蛋白等六种高丰度蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白等六种高丰度蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白等六种高丰度蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白等六种高丰度蛋白 实验样品的蛋白用花青荧光染料（实验样品的蛋白用花青荧光染料（cyanine dyescyanine dyes）丙）丙 基基- -Cy3Cy3标记标记 对照样品用
109、激发波长不同、化学性质类似的另外一种花青荧光染料对照样品用激发波长不同、化学性质类似的另外一种花青荧光染料 丙基丙基- -Cy5Cy5标记标记 两种标记过的样品混合到一起，在同一块胶上进行电泳分离两种标记过的样品混合到一起，在同一块胶上进行电泳分离n 2-D DIGE 2-D DIGE分析分析分析分析100101脑脊液的双向荧光差异凝胶电泳分析脑脊液的双向荧光差异凝胶电泳分析(2-D DIGE)脑脊液蛋白组学分析举例脑脊液蛋白组学分析举例 进行荧光识别，通过不同波长的扫描，观察一个蛋白质点处两种荧光进行荧光识别，通过不同波长的扫描，观察一个蛋白质点处两种荧光 密度的深浅和有无密度的深浅和有无
110、得到特定蛋白质点的丰度变化、蛋白质的缺失或判定新蛋白质的出现得到特定蛋白质点的丰度变化、蛋白质的缺失或判定新蛋白质的出现n 图像分析图像分析n 对筛选出的蛋白质进行酶解后作对筛选出的蛋白质进行酶解后作MS/MS分析分析n 统计学分析统计学分析n 研究结果研究结果研究结果研究结果检测出约检测出约21002100个蛋白，比一般个蛋白，比一般2 DE2 DE的分离结果增加了的分离结果增加了99%99%101102分离条件：IPG胶（24cm，pH310，非线性），10%等度SDS-PAGE胶A：以Cy2对除去六种高丰度蛋白前 CSF蛋白质组标记后的2 DE分离结果B：以Cy3对除去六种高丰度蛋白后
111、CSF蛋白质组标记后的2 DE分离结果C：以Cy5对六种高丰度蛋白标记后的 2 DE分离结果D：用DeCyder差异 分析软件处理A、B、C三种荧光图像 后的2-D DIGE图像合成图，其中， 粉红色的点代表高丰度蛋白。说明高 丰度蛋白的去除会大大提高对于低丰 度蛋白的检测能力 在一块胶上对CSF进行2-D DIGE分析的结果102103n n人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直人血液中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，可以直接反映肌体的病理、生理
112、状态，所以是发现各种疾病相关生物标接反映肌体的病理、生理状态，所以是发现各种疾病相关生物标接反映肌体的病理、生理状态，所以是发现各种疾病相关生物标接反映肌体的病理、生理状态，所以是发现各种疾病相关生物标志物的最有价值的标本。志物的最有价值的标本。志物的最有价值的标本。志物的最有价值的标本。n n血浆血浆血浆血浆/ /血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题是：血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题是：血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题是：血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题是：1 1、样品的选择；、样品的选择；、样品的选择；、样品的选择；2 2、样品的收集与贮存；、样品的收集与贮存；、样品的收集与
113、贮存；、样品的收集与贮存；3 3、去除高丰度蛋白和分级技术；、去除高丰度蛋白和分级技术；、去除高丰度蛋白和分级技术；、去除高丰度蛋白和分级技术；4 4、多维、多维、多维、多维策略的运用。策略的运用。策略的运用。策略的运用。n n尿蛋白质组的分析与鉴定与多种疾病有关，因此也日益受到重视。尿蛋白质组的分析与鉴定与多种疾病有关，因此也日益受到重视。尿蛋白质组的分析与鉴定与多种疾病有关，因此也日益受到重视。尿蛋白质组的分析与鉴定与多种疾病有关，因此也日益受到重视。n n唾液蛋白质组不仅能反映口腔的病理变化，也可能与其它种类疾病唾液蛋白质组不仅能反映口腔的病理变化，也可能与其它种类疾病唾液蛋白质组不仅能
114、反映口腔的病理变化，也可能与其它种类疾病唾液蛋白质组不仅能反映口腔的病理变化，也可能与其它种类疾病的病理变化有关。的病理变化有关。的病理变化有关。的病理变化有关。n n脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经系统疾病有关。脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经系统疾病有关。脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经系统疾病有关。脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经系统疾病有关。总结总结103Thanks104104Homeworks1、从功能的角度，可以将血浆蛋白质的组成分为哪几类、从功能的角度，可以将血浆蛋白质的组成分为哪几类？2、血浆、血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题有哪血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题有哪些？些？3、理想的生物标志物的基本特征是什么？、理想的生物标志物的基本特征是什么？4、简述尿蛋白质组学的研究意义。、简述尿蛋白质组学的研究意义。105个人观点供参考，欢迎讨论
