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1、1实验二实验二 蛋白质等电点及含量测定蛋白质等电点及含量测定n1台可见光分光光度计配套台可见光分光光度计配套4个玻璃比色杯，用完个玻璃比色杯，用完务必立即洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布务必立即洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布(纸纸)擦拭。擦拭。n实验结束后，务必将使用过的玻璃器皿洗净、晾实验结束后，务必将使用过的玻璃器皿洗净、晾干、放回原处。干、放回原处。【温馨提示温馨提示】P40/P512n学习蛋白质的两性解离性质，掌握学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。白质等电点的一般原理和操作方法。n学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和操学习和掌握
2、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。作方法。【实验目的实验目的】01蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定4【实验原理实验原理】pH值沉淀法沉淀法测定蛋白定蛋白质等等电点点n蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：5n蛋白质分子所带净电荷为零时的蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为值称为蛋白质的等蛋白质的等电点电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均向增加，
3、所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。减到最低，且溶液变混浊。n牛乳中的酪蛋白的等电点是牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质。本实验采用蛋白质在不同在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。值即为该种蛋白质的等电点值。【实验原理实验原理】pH值沉淀法沉淀法测定蛋白定蛋白质等等电点点6n实验仪器实验仪器4支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（）、枪头（200uL）等。）等。n实验材料和试剂实验材料和试剂蒸蒸馏
4、馏水水、1M醋醋酸酸、0.1M醋醋酸酸、0.01M醋醋酸酸、酪酪蛋白溶液。蛋白溶液。【仪器试剂耗材仪器试剂耗材】 pH值沉淀法沉淀法测定蛋白定蛋白质等等电点点7【操作步骤操作步骤】pH值沉淀法沉淀法测定蛋白定蛋白质等等电点点n每小组每小组取取4支支15mL玻璃试管，按下表顺序分别精确地加玻璃试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，加入后入各试剂，加入后立即混匀立即混匀，加一管，摇匀一管。，加一管，摇匀一管。管号管号H2O/mL0.01M HAC/mL0.1MHAC/mL1M HAC/mLpH酪蛋白溶酪蛋白溶液液/mL观察察现象（象（min）0 10 20 18.400.6-5.91 28.7-0
5、.3-5.31 38.00-1.00-4.71 47.40-1.603.51 n静置，观察各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管静置，观察各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管pH即为即为酪蛋白的等电点。观察时可用酪蛋白的等电点。观察时可用+，+，+，表示浑浊度。，表示浑浊度。8【实验结果与分析实验结果与分析】 pH值沉淀法沉淀法测定蛋白定蛋白质等等电点点n观察各管中清澈度变化，观察各管中清澈度变化，记录结果记录结果（ 用用+，+，+，表示浑浊度）并表示浑浊度）并解释现象解释现象。n确定确定酪蛋白的等电点酪蛋白的等电点。n蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响
6、该实验结果准确性的因素有哪些？验结果准确性的因素有哪些？【思考题思考题】02蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定双缩脲法测定蛋白质含量11【实验原理实验原理】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量n双缩脲（双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子尿素经）是两分子尿素经180左右加热，放出左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。个分子氨后得到的产物。n在强碱性溶液中，双缩脲能与在强碱性溶液中，双缩脲能与Cu 形成紫红色络形成紫红色络合物，称为双缩脲反应合物，称为双缩脲反应。n凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有
7、个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，可发生双缩蛋白质含有多个肽键，可发生双缩脲反应。脲反应。2+12【实验原理实验原理】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量n紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，颜色深浅颜色深浅可在可在540 nm比色测定，故可用此法来测定蛋白质比色测定，故可用此法来测定蛋白质含量含量。测定的蛋白质浓度范围为。测定的蛋白质浓度范围为1-10 mg/mL。n此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的此法的优点是较快速，不同
8、的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。十分精确的蛋白质测定。13n实验仪器实验仪器6支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。）、可见光分光光度计等。（绘制标准曲线）（绘制标准曲线）2支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。）、
9、可见光分光光度计等。（样品测定）（样品测定）n实验材料和试剂实验材料和试剂双双缩缩脲脲试试剂剂、标标准准牛牛血血清清蛋蛋白白、蒸蒸馏馏水水、待待测测样样品品（可可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白）。）。【仪器试剂耗材仪器试剂耗材】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量14【操作步骤操作步骤】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量n1.标准曲线的绘制。标准曲线的绘制。（全班绘制全班绘制1份即可份即可）取取6支支15mL试管，编号试管，编号0-5，按下表顺序加入各试剂。，按下表顺序加入各试剂。试剂试剂/mL/mL试管试管0 01 12 23 34 45
10、5标准牛血清白标准牛血清白蛋白蛋白0.00.00.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0蒸馏水蒸馏水2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40.00.0双缩脲试剂双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量蛋白质含量 mg/mLmg/mL0.00.02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.015【操作步骤操作步骤】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量上述试剂加完后，充分混匀，上述试剂加完后，充分混匀，室温放置室温放置30 min。以以0号管为对照管号管为对照管，于，于540 nm处比色测
11、定吸光值，记处比色测定吸光值，记下各管吸光度。下各管吸光度。以每管以每管蛋白质含量为横坐标蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标对应吸光度为纵坐标，作吸光度作吸光度-蛋白质含量标准曲线。蛋白质含量标准曲线。（见电脑桌面（见电脑桌面Excel表格表格“标准曲线绘制标准曲线绘制”）16【操作步骤操作步骤】双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量n2.蛋白质样品测定蛋白质样品测定 （每小组做（每小组做1份）份） 1.另取另取2支支试管，分别加试管，分别加1 mL未知浓度的未知浓度的酪蛋白酪蛋白蛋白质样蛋白质样品液品液（注意样品浓度不要超过（注意样品浓度不要超过10 mg/mL），），加加1 mL蒸蒸馏水
12、馏水，加加4 mL双缩脲试剂双缩脲试剂，混匀，混匀，室温放置室温放置30 min。 2.2支样品溶液支样品溶液于于540nm处比色测定吸光值处比色测定吸光值。 3. 取两组样品测定的取两组样品测定的吸光值平均值吸光值平均值，根据回归方程计算出，根据回归方程计算出相应蛋白质的相应蛋白质的 浓度浓度。 4.按下列公式计算出样品蛋白质的含量：按下列公式计算出样品蛋白质的含量：样品蛋白质含量（样品蛋白质含量（mg/100 mL）=YN100/V 式中，式中，Y为标准曲线查得的蛋白质的量（为标准曲线查得的蛋白质的量（mg），），N为稀释倍数，为稀释倍数，V为样品所取的体积（为样品所取的体积（mL）。）。
13、y = 0.042x - 0.000417【实验结果与分析实验结果与分析】 双双缩脲法法测定蛋白定蛋白质含量含量样品蛋白质含量（样品蛋白质含量（mg/100 mL）=YN100/V2.计算样品蛋白质的含量计算样品蛋白质的含量 式中，式中，Y为标准曲线查得的蛋白质的量（为标准曲线查得的蛋白质的量（mg），），N为稀释为稀释倍数，倍数，V为样品所取的体积（为样品所取的体积（mL）。）。1.绘制蛋白质标准曲线绘制蛋白质标准曲线18【思考题思考题】n影响标准曲线的因素有哪些？影响标准曲线的因素有哪些？n蛋白质含量测定中需要注意什么问题？蛋白质含量测定中需要注意什么问题？19【注意事项注意事项】n等电点
14、测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须非常准确。非常准确。n标准曲线选择不能只看标准曲线选择不能只看R ，还应该看曲线斜率和截距。，还应该看曲线斜率和截距。R 大小与实验操作和仪器都有关系。大小与实验操作和仪器都有关系。 n显色时间过长，可能会出现雾状沉淀，影响比色。显色时间过长，可能会出现雾状沉淀，影响比色。（解决方法：尽快比色）（解决方法：尽快比色）n脂肪性物质会影响反应。（可用乙醇或石油醚使溶液脂肪性物质会影响反应。（可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上澄清液再测）澄清后离心，取上澄清液再测）n测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围内，如超出，应适当稀释样品后再测。内，如超出，应适当稀释样品后再测。22
