色谱分析法教材课件

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1、9.1 9.1 概述概述 色色谱谱法法也也叫叫层层析析法法，它它是是一一种种高高效效能能的的物物理理分分离离技技术术，将将它它用用于于分分析析化化学学并并配配合合适适当当的的检检测测手手段段，就成为色谱分析法。就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。液）的石油醚倒入管中。 此时，玻璃管的上端立即出现此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油几种颜色的混合谱带。然后用纯石油

2、醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。定。色谱法也由此而得名。 现现在在的的色色谱谱法法早早已已不不局局限限于于色色素素的的分分离离，其其方方法法也也早早已已得得到到了了极极大大的的发发展展，但但其其分分离离的的原原理理仍仍然然是是一一样样的的。我我们们仍仍然然叫叫它它色色谱分析。谱分析。一、色谱分离基本原理：一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱

3、法中存由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。同来进行分离的。使使用用外外力力使使含含有有样样品品的的流流动动相相（气气体体、液液体体）通通过过一一固固定定于于柱柱中中或或平平板板上上、与与流流动动相相互互不不相相溶溶的的固固定定相相表表面面。当当流

4、流动动相相中中携携带带的的混混合合物物流流经经固固定定相相时时，混混合物中的各组分与固定相发生相互作用。合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由由于于混混合合物物中中各各组组分分在在性性质质和和结结构构上上的的差差异异，与与固固定定相相之之间间产产生生的的作作用用力力的的大大小小、强强弱弱不不同同，随随着着流流动动相相的的移移动动，混混合合物物在在两两相相间间经经过过反反复复多多次次的的分分配配平平衡衡，使使得得各各组组分分被被固固定定相相保保留留的的时时间间不不同同，从从而而按按一一定定次次序序由由固固定定相相中中先先后后流流出出。与与适适当当的的柱柱后后检检测测方方法法结结合合，实实现现混

5、混合合物物中中各各组组分分的分离与检测。的分离与检测。 二、色谱分类方法：二、色谱分类方法： 色色谱谱分分析析法法有有很很多多种种类类，从从不不同同的的角角度度出出发发可可以以有有不不同同的的分分类类方方法。法。 （一）从两相的状态分类：（一）从两相的状态分类： 色色谱谱法法中中，流流动动相相可可以以是是气气体体，也也可可以以是是液液体体，由由此此可可分分为为气气相相色色谱谱法法（GCGC）和和液液相相色色谱谱法法（LCLC）。固固定定相相既既可可以以是是固固体体，也也可可以以是是涂涂在在固固体体上上的的液液体体，由由此此又又可可将将气气相相色色谱谱法法和和液液相相色色谱谱法法分分为为气气-

6、-液液色色谱谱、气气- -固固色色谱谱、液液- -固固色色谱谱、液液- -液液色色谱谱。分分类类情情况如下：况如下：色色谱谱法法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法气气- -液色谱法液色谱法气气- -固色谱法固色谱法液液- -固色谱法固色谱法液液- -液色谱法液色谱法 （二二）按按固固定定相相的的形形式式分分类类：按固定相的状态可分为：按固定相的状态可分为：柱色谱：固定相装在色谱柱中；柱色谱：固定相装在色谱柱中；纸纸色色谱谱：利利用用滤滤纸纸作作载载体体，吸吸附附在纸上的水作固定相；在纸上的水作固定相；薄薄层层色色谱谱：将将固固体体吸吸附附剂剂在在玻玻璃璃板或塑料板上制成薄层作固定相。板或

7、塑料板上制成薄层作固定相。 （三）按分离原理分类：可分为：（三）按分离原理分类：可分为：吸吸附附色色谱谱法法：利利用用吸吸附附剂剂（固固定定相相一一般般是是固固体体）表表面面对对不不同同组组分分吸吸附附能力的差别进行分离的方法；能力的差别进行分离的方法；分分配配色色谱谱法法：利利用用不不同同组组分分在在两两相相间间的的分分配配系系数数的的差差别别进进行行分分离的方法。离的方法。 离子交换色谱：利用溶液中离子交换色谱：利用溶液中不同离子与离子交换剂间的交换不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。能力的不同而进行分离的方法。 空间排斥（阻）色谱法：利空间排斥（阻）色谱法：利用多孔性

8、物质对不同大小的分子用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。的排阻作用进行分离的方法。9.2 色色谱谱流流出出曲曲线线（色色谱谱图图）及及有关术语有关术语 （一）气相色谱法分离的过程：（一）气相色谱法分离的过程： 分分离离过过程程（以以分分离离A、B两两组组分为例）为：分为例）为： 混合组混合组分的分分的分离过程离过程及检测及检测器对各器对各组份在组份在不同阶不同阶段的响段的响应应（二）色谱流出曲线：（二）色谱流出曲线：从载气带着组分进入色谱柱起就从载气带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的气体，并用检测器检测流出柱后的气体，并用记录器记录信号随时间变化的曲用记录器记录信号

9、随时间变化的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线，当线，此曲线就叫色谱流出曲线，当待测组分流出色谱柱时，检测器就待测组分流出色谱柱时，检测器就可检测到其组分的浓度，在流出曲可检测到其组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰。线上表现为峰状，叫色谱峰。如图所示为一色谱流出曲线：如图所示为一色谱流出曲线：色谱术语：色谱术语：1）基基线线：在在实实验验条条件件下下，色色谱谱柱柱后后仅仅有有纯纯流流动动相相进进入入检检测测器器时时的的流流出出曲曲线线称称为为基基线线。基基线线在在稳稳定定的的条条件件下下应应是是一一条条水水平平的的直直线线。它它的的平平直直与与否否可可反反应应出实验条件的稳定情况。出实验条

10、件的稳定情况。2 2）峰峰高高（h h）和和峰峰面面积积 ：色色谱谱峰峰顶顶点点与与基基线线的的距距离离叫叫峰峰高高。色色谱谱峰峰与与峰峰底底基基线线所所围围成成区区域域的的面面积叫峰面积。积叫峰面积。3 3）保留值）保留值 a.a. 死死时时间间(t(t0 0) ) ：不不与与固固定定相相作作用用的的物物质质从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值时时的的时时间间，它它与与色色谱谱柱柱的的空空隙隙体体积积成成正正比比。由由于于该该物物质质不不与与固固定定相相作作用用，因因此此，其其流流速速与与流流动动相相的的流流速速相相近近。据据 t t0 0 可可求求出出流流动动相平均流速相平均流速 b.

11、b. 保保留留时时间间trtr：试试样样从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值时时的的时时间间。它它包包括括组组份份随随流流动动相相通通过过柱柱子子的的时时间间t0t0和组份在固定相中滞留的时间。和组份在固定相中滞留的时间。c. 调调整整保保留留时时间间tr ：某某组组份份的的保保留留时时间间扣扣除除死死时时间间后后的的保保留留时时间间，它它是组份在固定相中的滞留时间。即是组份在固定相中的滞留时间。即 由由于于保保留留时时间间为为色色谱谱定定性性依依据据。但但同同一一组组份份的的保保留留时时间间与与流流速速有有关关，因因此此有有时时需需用用保保留留体体积积来来表表示示保保留留值。值。 d.d

12、. 死死体体积积V V0 0：色色谱谱柱柱管管内内固固定定相相颗颗粒粒间间空空隙隙、色色谱谱仪仪管管路路和和连连接接头头间间空空隙隙和和检检测测器器间间隙隙的的总总和和。忽忽略后两项可得到：略后两项可得到：n其中，其中，Fco为柱出口的载气流为柱出口的载气流速速（mL/min)，其值为：，其值为：nF0-检测器出口流速；检测器出口流速；Tr-室温；室温；Tc-柱温；柱温；p0-大气压；大气压；pw-室温时室温时水蒸汽压。水蒸汽压。 e. 保保留留体体积积Vr：指指从从进进样样到到待待测测物物在在柱柱后后出出现现浓浓度度极极大大点点时时所所通通过过的流动相的体积。的流动相的体积。 f.f. 调整

13、保留体积调整保留体积 ：某组：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。份的保留体积扣除死体积后的体积。g. 相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。n注注意意：r2,1只只与与柱柱温温和和固固定定相相性性质质有有关关，而而与与柱柱内内径径、柱柱长长L、填填充充情情况况及及流流动动相相流流速速无无关关，因因此此，在在色色谱谱分分析析中中，尤尤其是其是GC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！具具体体做做法法：固固定定一一个个色色谱谱峰峰为为标标准准s，然然后后再再求求其其它它峰峰 i 对对标标准准峰峰的的相相对对保保留留值值，此时以此时以 表示：表示：n 1, 又称选择

14、因子。又称选择因子。 h.h. 区区域域宽宽度度：色色谱谱峰峰的的区区域域宽宽度度是是色色谱谱流流出出曲曲线线的的重重要要参参数数之之一一，可可用用于于衡衡量量色色谱谱柱柱的的柱柱效效及及反反映映色色谱谱操操作作条条件件下下的的动动力力学学因因素素。宽宽度度越越窄窄，其其效效率率越越高高，分分离离的的效效果果也也越好。越好。区域宽度通常有三种表示方法：区域宽度通常有三种表示方法：标准偏差标准偏差 ：峰高：峰高0.607 0.607 倍处峰倍处峰宽处的一半。宽处的一半。半峰宽半峰宽W1/2W1/2：峰高一半处的峰：峰高一半处的峰宽。宽。W1/2=2.354 W1/2=2.354 峰底宽峰底宽W

15、W：色谱峰两侧拐点上切：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。线与基线的交点间的距离。W= 4W= 4 色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义： 色色谱谱峰峰数数= =样样品品中中单单组组份份的的最最少少个数；个数； 色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据； 色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据； 色色谱谱保保留留值值或或区区域域宽宽度度色色谱谱柱分离效能评价指标；柱分离效能评价指标； 色色谱谱峰峰间间距距固固定定相相或或流流动动相相选择是否合适的依据。选择是否合适的依据。9.3 色谱法基本原理色谱法基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，色谱分析的目的是将样品中各组分

16、彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但当两峰的，即与色谱过程的热力学性质有关。但当两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动

17、力学两方面来研究色谱行为。学两方面来研究色谱行为。 一、描述分配过程的参数一、描述分配过程的参数 1 1、分配系数、分配系数(K)(K)： 如如前前所所述述，分分配配色色谱谱的的分分离离是是基基于于样样品品组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间反反复复多多次次地地分分配配过过程程，而而吸吸附附色色谱谱的的分分离离是是基基于于反反复复多多次次地地吸吸附附一一脱脱附附过过程程。这这种种分分离离过过程程经经常常用用样样品品分分子子在在两两相相间间的的分分配配来来描描述述，而而描描述述这这种种分配的参数称为分配系数。分配的参数称为分配系数。 它它是是指指在在一一定定温温度度和和压压力力下下，

18、组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相之之间间分分配配达达平平衡时的浓度之比值，即衡时的浓度之比值，即 K K 只只与与固固定定相相和和温温度度 有有关关，与与两两相相体体积积、 柱柱管管特特性性和和所所用用仪仪 器无关。器无关。分配系数分配系数 K K的讨论的讨论n试试 样品一定时，样品一定时，K K 主要取决于固定相性质一主要取决于固定相性质一定温度下，组分的分配系数定温度下，组分的分配系数 K K 越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；每个组份在各种固定相上的分配系数每个组份在各种固定相上的分配系数K K不同；选择不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具适宜的固定相可改善分离效

19、果；试样中的各组分具有不同的有不同的K K值是分离的基础；某组分的值是分离的基础；某组分的K K = 0 = 0时，即时，即不被固定相保留，最先流出。不被固定相保留，最先流出。 在在一一定定条条件件下下，各各种种物物质质的的K K是是不不同同的的。K K较较小小的的组组分分在在色色谱谱分分析析中中每每次次分分配配后后在在气气相相中中的的浓浓度度较较大大，因因此此较较早早流流出出色色谱谱柱柱。K K较较大大的的组组分分每每次次分分配配后后在在气气相相中中浓浓度度较较小小，因因此此较较晚流出色谱柱。晚流出色谱柱。当分配次数足够多时，就能将具有不同当分配次数足够多时，就能将具有不同K K的的组分分开

20、。所以，我们可以认为，气相色谱法组分分开。所以，我们可以认为，气相色谱法是利用不同的物质具有不同的是利用不同的物质具有不同的K K而进行分离的。而进行分离的。而而K K的不同则是由于各组分在固定相中的溶解的不同则是由于各组分在固定相中的溶解度（对气度（对气- -液色谱）或吸附能力（对气液色谱）或吸附能力（对气- -固色谱）固色谱）不同而造成的。不同而造成的。 2. 2. 分配比分配比： 在在一一定定温温度度和和压压力力下下，组组份份在在两两相相间间的的分分配配达达平平衡衡时时，分分配配在在固固定定相相和和流流动动相相中中的的质质量量比比，称称为为分分配配比比。它它反反映映了了组组分分在在柱柱中

21、中的的迁迁移移速速率率。又又称称保保留因子。也叫容量因子或容量比。留因子。也叫容量因子或容量比。 n其其中其其中V Vm m V V0 0，V Vs s为固定相体积为固定相体积分配比分配比 k k 的求算：的求算：k k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值也等于组分的校正保留时间与死时间的比值因因此此，k k可可通通过过实实验验测测得得。由由此此也也可可知知道道，k k可可表表示示出出组组分分在在柱柱中中停停留留时时间间的的长长短短。k k越越大大，停停留留时时间也就越长。间也就越长。 称称为为相相比比率率，它它也也是是反反映映色色谱谱柱柱柱柱型型特特点点的的参参数数。对对填填充充柱柱， =

22、635=635；对对毛毛细细管管柱柱， =60600=60600。3.3. K K 与与 k k 的关系：的关系：4.4. 选选择择因因子子 ：色色谱谱柱柱对对A A、B B两两组组分分的的选选择择因因子子 定义如下：定义如下：A A为先流出的组分，为先流出的组分，B B 为后流出的组分。为后流出的组分。 注注意意：K K 或或 k k 反反映映的的是是某某一一组组分分在在两两相相间间的的分分配配；而而 是是反反映映两两组组分分间间的的分分离离情情况况！当当两两组组分分 K K 或或 k k 相相同同时时， =1 =1 时时，两两组组分分不不能能分分开开；当当两两组组分分 K K 或或 k k

23、 相相差差越越大大时时， 越越大大，分分离离得得越越好好。也也就就是是说说，两两组组分分在在两两相相间间的的分分配配系数不同，是色谱分离的先决条件。系数不同，是色谱分离的先决条件。 和和 k k 是是计计算算色色谱谱柱柱分分离离效效能能的的重重要要参数！参数！二、二、 塔板理论塔板理论 塔塔板板理理论论是是描描述述色色谱谱柱柱中中组组分分在在两两相相间间的的分分配配状状况况及及评评价价色色谱谱柱柱的的分分离离效效能能的的一一种种半半经经验验式式的的理理论论。塔塔板板理理论论将将一一根根色色谱谱柱柱当当作作一一个个由由许许多多塔塔板板组组成成的的精精馏馏塔塔，用用塔塔板板概概念念来来描描述述组组

24、分分在在柱柱中中的的分分配配行行为为。塔塔板板是是从从精精馏馏中中借借用用的的，是是一一种种半半经经验验理理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。 塔板理论假定：塔板理论假定：1 1）塔板之间不连续；）塔板之间不连续；2 2）塔板之间无分子扩散；）塔板之间无分子扩散；3 3）组组分分在在各各塔塔板板内内两两相相间间的的分分配配瞬瞬间间达达至至平平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H H；4 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5 5）流流动动相相以以不不连连续续方方式式

25、加加入入，即即以以一一个个一一个个的塔板体积加入。的塔板体积加入。 ( (一）、色谱分离过程：一）、色谱分离过程： 塔板理论是把色谱柱假想为一塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开蒸馏塔（

26、色谱柱），从而的组分后离开蒸馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。使分配系数不同的组分彼此得到分离。 分离过程如下图所示分离过程如下图所示 下面我们再举一个例子说明下面我们再举一个例子说明组分在色谱柱中的分配情况。组分在色谱柱中的分配情况。 为简单起见，设色谱柱由为简单起见，设色谱柱由5 5决决塔板（塔板（n=5nn=5n为柱子的塔板数）组成，为柱子的塔板数）组成，并以并以r r表示塔板编号表示塔板编号r=0r=0，1 1，2 2，3 3，4 4，5 5；某组分的；某组分的分配比分配比k=1k=1。 根据上述假定在色谱分离根据上述假定在色谱分离过程中。该组分的分布可计算如下：过

27、程中。该组分的分布可计算如下： 开始时，将单位质量（即开始时，将单位质量（即 m=1m=1）的该组分进入）的该组分进入0 0号塔板上，然后号塔板上，然后将流动相以一个板体积（将流动相以一个板体积（V V）一个板）一个板体积的脉动形式进入色谱柱；此时组体积的脉动形式进入色谱柱；此时组分将安下表所示在固定相和流动相进分将安下表所示在固定相和流动相进行分配：行分配： 板板号号r r 载气体积载气体积0 01 12 23 3进进样样m mM M0.0.5 5m mS S0.0.5 5V Vm mM M0.0.25250.250.25m mS S0.0.25250.250.252 2VVm mM M0.

28、0.1251250.125+0.10.125+0.125250.1250.125m mS S0.0.1251250.125+0.10.125+0.125250.1250.1253 3VVm mM M0.0.0630630.063+0.10.063+0.125250.063+0.10.063+0.125250.0.063063m mS S0.0.0630630.063+0.10.063+0.125250.063+0.10.063+0.125250.0.063063按上述分配过程，对于按上述分配过程，对于n=5n=5，k=1k=1，m=1m=1的体系，随着进入柱中板体积载气的体系，随着进入柱中板体

29、积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气相和液相的总质量）见下表：总量（气相和液相的总质量）见下表： r nr n0 01 12 23 34 4出出口口0 01 10 00 00 00 00 01 10.0.5 50.0.5 50 00 00 00 02 20.0.25250.0.5 50.0.25250 00 00 03 30.0.1251250.0.3753750.0.3753750.0.1251250 00 04 40.0.0630630.0.25250.0.3753750.0.25250.0.0630630 05 50.0.0320320.0.15

30、71570.0.3133130.0.3133130.0.1571570.0.0320326 60.010.016 60.0.0950950.0.2352350.0.3133130.0.2352350.0.0790797 70.000.008 80.0.0560560.0.1161160.0.2742740.0.2742740.0.1181188 80.000.004 40.0.0320320.0.0860860.0.1961960.0.2742740.0.1331339 90.000.002 20.0.0180180.0.0590590.0.1411410.0.2362360.0.138138

31、1 10 00.000.001 10.0.0100100.0.0380380.0.1001000.0.1891890.0.118118 n n r r0 01 12 23 34 4出出口口11110 00.0.0050050.0.0240240.00.069690.10.145450.00.0959512120 00.0.0020020.0.0160160.00.046460.10.107070.00.0737313130 00.0.0010010.0.0080080.00.030300.00.076760.00.0545414140 00 00.0.0040040.00.019190.00.

32、053530.00.0383815150 00 00.0.0020020.00.012120.00.036360.00.0282816160 00 00.0.0010010.00.008080.00.024240.00.01818由表中可见，当由表中可见，当n=5n=5时，即时，即5 5个塔板体个塔板体积的流动相进入柱中时，组分就开始从积的流动相进入柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。柱口流出。并且呈现先小后大的情况。以上是当塔板数为以上是当塔板数为5 5时的情况，出现时的情况，出现的峰形不对称的峰形不对称 ，这是由于塔板数太少，这是由于塔板数太少的原因。当塔板数大于的原因。

33、当塔板数大于5050时，峰形就时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，是对称的。在实际色谱柱中，n n值很大值很大（约为（约为10106 6 10109 9 ）。所以色谱峰一般）。所以色谱峰一般为正态分布。为正态分布。（二）柱效能指标：对于一个色谱（二）柱效能指标：对于一个色谱柱来说，其分离能力（叫柱效能）的柱来说，其分离能力（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目有关，塔板数大小主要与塔板的数目有关，塔板数越多，柱效能越高。越多，柱效能越高。 色谱柱的塔板数可以用理论塔板数色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效塔板数来表示。和有效塔板数来表示。式中：式中：t tR R为某组分的保留时间；为某组分的保留时

34、间； W W1/21/2为某组分色谱峰的半宽度；为某组分色谱峰的半宽度； W W为色谱峰的峰底宽度。为色谱峰的峰底宽度。由由式式可可见见，柱柱子子的的理理论论塔塔板板数数与与峰峰宽宽和和保保留留时时间间有有关关。保保留留时时间间越越大大，峰峰越越窄窄，理理论论塔塔板板数数就就越越多。柱效能也就越高。多。柱效能也就越高。1 1理论塔板数理论塔板数n n：对于一个柱子下说，其理论塔板数可由下式计算：对于一个柱子下说，其理论塔板数可由下式计算：对对于于一一个个柱柱长长固固定定为为L L的的柱柱子子，其其理理论论塔塔板板高高度度H H为为每每一一个个塔塔板板的的高高度度，即即组组分分在在柱柱内内每每达

35、达成成一一次次分分配配平平衡衡所所需需要要的的柱柱长长叫叫理理论论塔塔板板高高度度。它它越越小小，也表示柱效能越高。也表示柱效能越高。2 2有效塔板数有效塔板数n n有效有效：在在以以上上计计算算理理论论塔塔板板数数的的式式子子中中使使用用的的是是保保留留时时间间，它它包包括括了了死死时时间间，它它与与组组分分在在柱柱内内的的分分配配无无关关，因因此此不不能能真真正正反反映映色色谱谱柱柱的的柱柱效效。为为此此，引引入了有效塔板数的概念。入了有效塔板数的概念。同理有效塔板高度为：3.3.塔板理论的特点：塔板理论的特点： (1)(1)当当色色谱谱柱柱长长度度一一定定时时，塔塔板板数数 n n 越越

36、大大( (塔塔板板高高度度 H H 越越小小) )，被被测测组组分分在在柱柱内内被被分分配配的的次次数数越越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)(2)不不同同物物质质在在同同一一色色谱谱柱柱上上的的分分配配系系数数不不同同，用用有有效效塔塔板板数数和和有有效效塔塔板板高高度度作作为为衡衡量量柱柱效效能能的的指指标时，应指明测定物质。标时，应指明测定物质。 (3)(3)柱柱效效不不能能表表示示被被分分离离组组分分的的实实际际分分离离效效果果，当当两两组组分分的的分分配配系系数数 K K 相相同同时时，无无论论该该色色谱谱柱柱的的塔板数多大，都无法分离。塔板

37、数多大，都无法分离。 (4)(4)塔塔板板理理论论无无法法指指出出影影响响柱柱效效的的因因素素及及提提高高柱效的途径。柱效的途径。三速率理论三速率理论范弟姆特方程式：范弟姆特方程式： 塔塔板板理理论论是是一一个个半半经经验验性性的的理理论论。它它定定性性的的给给出出了了板板高高的的概概念念，但但不不能能指指出出影影响响板板高高的的因因素素。速速率率理理论论就就是是在在塔塔板板理理论论的的基基础础上上，给给出出了了影影响响塔塔板板高度的因素：高度的因素： u u 为流动相线速度；为流动相线速度； A A，B B，C C为常数，其中为常数，其中 A A分别表示涡流扩散系数；分别表示涡流扩散系数；

38、B B分子扩散系数；分子扩散系数； C C传传质质阻阻力力系系数数（包包括括液液相相和和固固相相传传质质阻阻力系数）。力系数）。 该该式式从从动动力力学学角角度度很很好好地地解解释释了了影影响响板板高高（柱柱效效）的的各各种种因因素素！任任何何减减少少方方程程右右边边三三项项数数值的方法，都可降低值的方法，都可降低H H，从而提高柱效。，从而提高柱效。1 1）涡流扩散项）涡流扩散项(A)(A) 在在填填充充柱柱中中，由由于于受受到到固固定定相相颗颗粒粒的的阻阻碍碍，组组份份在在迁迁移移过过程程中中随随流流动动相相不不断断改改变变方方向向，形形成成紊紊乱乱的的“涡涡流流”：从从图图中中可可见见，

39、因因填填充充物物颗颗粒粒大大小小及及填填充充的的不不均均匀匀性性同同一一组组分分运运行行路路线线长长短短不不同同流流出出时时间间不不同同峰形展宽。展宽程度以峰形展宽。展宽程度以A A表示：表示：A=2A=2 d dp p其其中中d dp p填填充充物物平平均均直直径径； 填填充充不不规则因子。规则因子。 可可见见，使使用用细细粒粒的的固固定定相相并并填填充充均均匀匀可可减减小小A A，提提高高柱柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0A=0。流动方向流动方向2 2）分子扩散项）分子扩散项(B/u)(B/u) 纵纵向向分分子子扩扩散散是是由由于于浓浓度度梯

40、梯度度引引起起的的。当当样样品品被被注注入入色色谱谱柱柱时时，它它呈呈“塞塞子子”状状分分布布。随随着着流流动动相相的的推推进进， “塞塞子子”因因浓浓度度梯梯度度而而向向前前后后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2B=2 D D 称称为为弯弯曲曲因因子子，它它表表示示固固定定相相几几何何形形状状对对自自由由分子扩散的阻碍情况；分子扩散的阻碍情况；D D组组分分在在流流动动相相中中的的扩扩散散系系数数。组组份份为为气气体体或或液液体时，分别以体时，分别以D Dg g或或D Dm m表示；表示；讨论：讨论： 分子量大的组分，分子量大的组分，D Dg g小，即小，

41、即B B小小D Dg g 随柱温升高而增加，随柱压随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；降低而减小； 流动相分子量大，流动相分子量大，D Dg g 小，即小，即 B B 小；小； u u 增加，组份停留时间短，纵向增加，组份停留时间短，纵向扩散小；扩散小；（B/uB/u） 对于液相色谱，因对于液相色谱，因D Dm m 较小，较小，B B 项可勿略。项可勿略。球状颗粒；球状颗粒；大大分分子子量量流动相；流动相；适适当当增增加加流速；流速；短柱；短柱；低温。低温。3 3）传质阻力项）传质阻力项(Cu)(Cu) 因因传传质质阻阻力力的的存存在在，使使分分配配不不能能“瞬瞬间间”达达至至平平衡衡，因因此

42、此产产生生峰峰形形展展宽宽。气气相相色色谱谱以以气气体体为为流流动动相相，液液相相色色谱谱以以液液体体为为流流动动相相，二二者者传传质质过过程不完全相同。下面分别作讨论。程不完全相同。下面分别作讨论。a a）气气液液色色谱谱：传传质质阻阻力力项项C C包包括括气气相相传传质质阻阻力力系系数数C Cs s和液相传质阻力系数和液相传质阻力系数C Cl l。流动相流动相固液界面固液界面固定液固定液组分分子组分分子ClCg讨论：讨论：F 减小填充颗粒直径减小填充颗粒直径d dp p；F 采用分子量小的流动相，使采用分子量小的流动相，使D Dg g增加；增加；F 减小液膜厚度减小液膜厚度d df f，C

43、 Cl l下降。下降。但此时但此时k k又减小。又减小。 因此，当保持固定液含量不变时，可通过因此，当保持固定液含量不变时，可通过 增加固定液载体的比表面来降低增加固定液载体的比表面来降低d df f。但比。但比 表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。F 增加柱温，可增加增加柱温，可增加D Dl l，但，但k k值也减小，为保值也减小，为保 持合适持合适C Cl l值，应控制柱温。值，应控制柱温。b b）液液液液色色谱谱：传传质质阻阻力力项项C C 包包括括流流动动相相传传质质阻阻力力系数系数C Cm m 和固定相传质阻力系数和固定相传质阻力系数 C Cs s。 sm

44、讨论：讨论： 流流动动相相传传质质阻阻力力包包括括两两方方面面：流流动动相相中中的的传传质质阻阻力力C Cm m、滞滞留留的的流流动动相相传传 质质阻阻力力CsCs 。分分别别与与填填充充物物大大小小 d dp p、扩扩散散系数系数(D(Dm m) )、微孔大小及其数量等、微孔大小及其数量等 有关。有关。 因因此此，降降低低流流动动相相传传质质阻阻力力的的方方法法有有：细细颗颗粒粒固固定定相相、增增加加组组分分在在 固固定定相相和和流流动动相相中中的的扩扩散散系系数数D D、适当降低线速度、短柱。适当降低线速度、短柱。 固固定定相相传传质质阻阻力力与与液液膜膜厚厚度度d df f、保保留留因因

45、子子 k k 和和扩扩散散系系数数D Ds s等有关。等有关。 因因此此，降降低低固固定定相相传传质质阻阻力力的的方方法法有有：与与气气液色谱中液相传质阻力的表述相同。液色谱中液相传质阻力的表述相同。 4 4）流速）流速u u 由由方方程程 H H = = A A + + B/u B/u + + CuCu知知道：道： 当当u u一一定定时时，仅仅在在A A、B B、C C 较较小小时时，H H 较较小小，柱柱效效较较高高；反反之之则则柱柱效效较较低低，色谱峰将展宽。色谱峰将展宽。 以以u u对对H H作作图图，可可得得H-uH-u曲曲线线（如图），从该曲线得到：（如图），从该曲线得到：板高，板

46、高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；低流速区低流速区(u小小)，B/u大，分子扩散项占主导，大，分子扩散项占主导， 此时选择分子量大的气体如此时选择分子量大的气体如N2和和Ar为载气，可为载气，可 减小扩散，提高柱效；减小扩散，提高柱效；高流速区高流速区(u大大)，Cu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导， 此时选择分子量小的气体如此时选择分子量小的气体如H2和和He为载气，为载气， 可增加扩散系数，提高柱效；可增加扩散系数，提高柱效； LC的的Hmin和和uopt均比均比GC的小一个数量级，即在的小一个数量级，即在

47、LC中，较低流速可获得较大的柱效。中，较低流速可获得较大的柱效。 曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的下的 最小板高最小板高Hmin( )；5 5）固定相颗粒大小对板高的影响）固定相颗粒大小对板高的影响 实实验验表表明明，颗颗粒粒越越细细，板板高高越越小小，受受线线速速影影响响越越小小。即即，在在HPLCHPLC分分析析中中采采用用细细粒粒作作固固定定相的理论根据！相的理论根据！ 但但颗颗粒粒细细导导致致柱柱流流速速慢慢，当当采采用用高高压压技技术术，才能实现才能实现HPLCHPLC的分析要求。的分析要求。板高, H(cm) 上上面面分分别别介介绍绍了了影影响响

48、色色谱谱分分离离的的基基本本原原理理以以及及影影响响柱柱效效的的各各种种因因素素，但但是是如如何何从从总总体体上上定定量量描描述述色色谱谱分分离离效效能能？如如何何将将各各种种影影响响因因素素对对分分离离的的影响定量地表述出来呢？影响定量地表述出来呢？9.4 9.4 分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程一、分离度一、分离度(Resolution, R)(Resolution, R) 同同时时反反映映色色谱谱柱柱效效能能和和选选择择性性的的一一个个综综合合指指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：用此式，可直接从用此式，可直接从色谱流出曲线上求出

49、分离度色谱流出曲线上求出分离度R R。色谱分离中的四种典型情况色谱分离中的四种典型情况 分离效果差，柱效低，选择分离效果差，柱效低，选择性（性（ ）低）低 完全分离，柱效高，峰窄，完全分离，柱效高，峰窄，选择性（选择性（ ）低）低 ；完全分离，选择性（完全分离，选择性（ ）增）增加，柱效低，峰宽加，柱效低，峰宽完全分离，柱效高，选择性完全分离，柱效高，选择性（ ）好）好R R 越越大大，相相邻邻组组分分分分离离越越好好。当当R=1.5 R=1.5 时时，分分离离程程度度可可达达99.7%99.7%，因因此此R=1.5 R=1.5 通常用作是否分开的判据。通常用作是否分开的判据。R=1.5R=0

50、.75R=1.0响应信号响应信号保留时间保留时间 t, min二、色谱分离方程二、色谱分离方程 R 的的定定义义并并未未反反映映影影响响分分离离度度的的各各种种因因素素。也也就就是是说说，R 未未与与影影响响其其大大小小的的因因素素：柱柱效效n、选选择择因因子子 和和保保留留因因子子 k 联系起来。联系起来。 对对于于相相邻邻的的难难分分离离组组分分，由由于于它它们们的的分分配配系系数数 K 相相差差小小，可可合合理理假假设设k1 k2=k，W1 W2=W。因因此此可可导导出出R与与n、 和和 k 的关系：的关系：有关色谱方程的讨论：有关色谱方程的讨论：1 1）分离度）分离度R R 与柱效的关

51、系与柱效的关系 分分离离度度R R与与理理论论塔塔板板数数n n 有有关关，即即R R 受受热热力力学学性质的影响。性质的影响。 对对具具一一定定相相对对保保留留值值 的的物物质质对对，R R与与有有效效塔塔板数板数n neffeff有关，说明有关，说明n neffeff可正确代表柱效能。可正确代表柱效能。 由色谱方程可得：由色谱方程可得：因因此此可可通通过过增增加加柱柱长长提提高高分分离离度度。然然而而，分分析析时时间间也也相相应应增增加加，且且峰峰宽宽也也展展宽宽！为为提提高高柱柱效效，用用减减小小塔塔板板高度高度 H H 的方法比增加柱长更有效。的方法比增加柱长更有效。2 2）分离度）分

52、离度R R与保留因子与保留因子 的关系的关系 越越大大，柱柱选选择择性性越越好好，对对分分离离有有利利。 的的微微小小变变化化可可引引起起 R R 较较大大改改变变。如如，当当 从从1.011.01增增加加至至1.101.10( (增增加加9% 9% ) )时时，R R 则则增增加加 9 9 倍倍( (但但 1.5, 1.5, R R增加不大增加不大) ) 。 改改变变 的的方方法法有有：降降低低柱柱温温、改改变变流流动动相相及及固固定相的性质和组成。定相的性质和组成。 3 3）分离度）分离度R R 分配比分配比 k k 的关系的关系 k k 增增加加，分分离离度度R R 增增加加，但但当当k

53、10k10，则则R R的的增增加加不不明明显显。通通常常k k在在210210之间。之间。 改改变变 k k 的的方方法法有有：适适当当增增加加柱柱温温(GC)(GC)、改改变变流流动动相相性性质质和和组组成成(LC)(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响( (梯度淋洗梯度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,1

54、0-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由由于于分分析析物物组组成成复复杂杂，以以某某一一组组成成的的流流动动相相可可能能使使部部分分待待测测物物得得到到好好的的分分离离，但但同同时时又又使使其其它它待待测测物物的的分分离离不不令令人人满满意意！实实际际工工作作中中采采用用程程序序升升温温（GC）和和梯梯度度淋淋洗洗（LC）来解决这个问题。来解决这个问题。三、分析时间三、分析时间 t t 分分析析时时间间通通常常指指最最

55、后后一一个个组组分分出出峰峰的的时时间间。其其值为值为可可见见，分分析析时时间间与与R R， ，k k、H/uH/u等等参参数数有有关关。R R 增加增加1 1 倍，分析时间则是原来的倍，分析时间则是原来的 4 4 倍。倍。 实实际际工工作作中中，即即要要能能获获得得有有效效的的分分离离，又又要要在较短时间内完成分析。在较短时间内完成分析。表表-1 -1 概念、表示方法及计算公式汇总概念、表示方法及计算公式汇总表表-2例例：两两物物质质A A和和B B在在30cm30cm长长的的色色谱谱柱柱上上的的保保留留时时间间分分别别为为16.416.4和和17.63min17.63min，有有一一不不与

56、与固固定定相相作作用用的的物物质质，其其在在此此柱柱上上的的保保留留时时间间为为1.30 1.30 minmin。物物质质A A和和B B的的峰峰底底宽宽分分别别为为1.111.11和和1.21min1.21min。试问：。试问：1 1）柱分辨率）柱分辨率R R；2 2）柱平均理论塔板数）柱平均理论塔板数n navav3 3）平均塔板高度）平均塔板高度H Havav4 4）若要求）若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6 6）不不增增加加柱柱长长，要要求求在在原原来来的的分分析析时时间间内内R R达达到到1.51.5，该该柱柱的塔板高度应为多少？的塔板高度应为多少？1 1）柱分辨率柱分辨率R R； 2 2）柱平均理论塔板数柱平均理论塔板数n navav3）平均塔板高度Havn4 44 4）若要求若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少，则柱长至少应为多少？5 5）使使用用上上述述较较长长的的柱柱进进行行分分析析时时，其其分分析析时时间为多长？间为多长？6 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内不增加柱长，要求在原来的分析时间内R R达达到到1.51.5，该柱的塔板高度应为多少？，该柱的塔板高度应为多少？