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1、烟草病毒病检测与控制一、烟草病毒病发生概况烟草病毒病发生概况烟草病毒病TobaccoViralDiseases烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类重要病害，种类很多，国外报道已从烟草上分离到的病毒有27种左右，国内已发现16种，其中发生普遍的有烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和烟草蚀纹病毒（TEV）等。烟草病毒病损失情况山东省1974-1977年的4年中，有3年烟草病毒病流行发生，其中1975年大流行，重病田减产20%-50%，夏烟田感病品种减产达70%以上。目前，山东省烟草病毒病每年发病面积达40万亩，发病率在20%-80%，经济损失每年达2000余
2、万元。烟草病毒病及其危害烟草病毒病及其危害主要病毒：花叶病、叶斑病、曲叶病主要病毒：花叶病、叶斑病、曲叶病发病面积：发病面积： 200万亩万亩产量损失：平均产量损失：平均10%，经济损失：经济损失：3亿元亿元普通花叶病：福建省发生最为普遍，占所普通花叶病：福建省发生最为普遍，占所有病毒病的有病毒病的60%马铃薯马铃薯Y病毒病：花叶型和坏死型，在后病毒病：花叶型和坏死型，在后期引起很大损失，占所有病毒病的期引起很大损失，占所有病毒病的20%苗期：花叶型成熟期：坏死型PVY 侵染马铃薯后可引起脉坏死、褐脉病、黄斑坏死等症状，能引起马铃薯种质退化，产量降低。因寄主品种和病毒株系不同，PVY 可使马铃
3、薯发生不同程度的症状，可造成高达 80% 以上的马铃薯产量损失。PVY还对烟草、番茄、茄子等茄科作物造成严重危害。PVY在马铃薯生产的危害程度仅次于马铃薯卷叶病毒(PRLV)现实意义侵染症状侵染症状烟草马铃薯黄瓜花叶病毒病：占所有病毒病的黄瓜花叶病毒病：占所有病毒病的15%-18%烟草上胜红蓟黄脉病毒和广东番木瓜曲叶病毒烟草上胜红蓟黄脉病毒和广东番木瓜曲叶病毒烟草上胜红蓟黄脉病毒和广东番木瓜曲叶病毒烟草上胜红蓟黄脉病毒和广东番木瓜曲叶病毒普通烟普通烟心叶烟心叶烟普通烟普通烟珊西烟珊西烟三生烟三生烟本氏烟本氏烟苎麻花叶病毒苎麻花叶病毒(RaMoV)，导致普通烟矮化的病原；寄主范围广。导致普通烟矮
4、化的病原；寄主范围广。危险性检疫病毒危险性检疫病毒南芥菜花叶病毒病南芥菜花叶病毒病TRV？TEVTEVTLCVTLCV丛顶病脚叶烘烤后效果脚叶烘烤后效果左图为烤房中脚叶，上左图为烤房中脚叶，上图为脚叶单叶。图为脚叶单叶。单叶第一炕下炕情形第一炕下炕情形第二炕下炕情形第二炕下炕情形福建省总体发生情况：非常严重典型案例：福建上杭县一个村，180亩全部发病典型案例：福建武平县一个村，600亩全部发病烟草病毒病引起了严重的群体事件！福建上杭烟草花叶病二、烟草花叶病毒TMV病毒粒子病毒粒子TMV引起的烟草花叶病引起的烟草花叶病烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）
5、烟草花叶病症状自苗期至收获期均能发病。病株呈现典型的花叶症状。嫩叶发病，先是脉明，以后形成浅绿和深绿病斑，叶缘有时向背面卷曲。由于受害叶片部分细胞增多或增大，致使叶片厚薄不匀，皱缩扭曲，呈畸形，并有不规则的缺刻，严重时延长呈柳叶状，或呈带状。早期发病烟株节间缩短，植株矮化，生长缓慢或不育。病重的烟株花变形，蒴果小而皱缩，所产生的种子，发芽力很差。Symptoms of TMV in TomatoStrains of TMV infect tomato and cause poor yield, distorted fruits, delayed fruit ripening and vario
6、us fruit discoloration problems that affect market values.Why do mosaics develop? Many virus infected plants have patches of dark green tissue that looks healthy among a sea of light green or yellow tissue.This gives rise to the name mosaic to refer to the pattern of light green and dark green tissu
7、e, or dark green islands. Green islands typically do not contain very much virus which explains why they are healthy looking. Green islands can not usually be reinfected by the same virus. Plants regenerated from green island tissue can not be reinfected with the virus causing disease in the origina
8、l plant.These islands are thought to have arisen by RNA gene silencing early in infection. Tobacco Mosaic Virus Infected PlantInfected plants recover during Systemic Virus Invasion1)GFP Expression from virus vectors is very useful for monitoring gene silencing during virus invasion.2) Systemic movem
9、ent patterns of viruses & GFP post transcriptional gene silencing (PTGS) are similar. Silencing signals inactivating transgenic GFP follow the same exit patterns from veins as virus expressing GFP.3) Viruses fail to invade meristems & PTGS is not active in meristems. Dark Green Islands appearing dur
10、ing virus recovery lack virus. The light green areas contain large amounts of virus. The dark green islands and recovered tissue lack virus. The invaded leaf of the nontransgenic leaf has dark green islands that are resisting virus infection. The tip half of the transgenic leaf was invaded and the b
11、asal half exhibited recovery. Virus can not be detected in the dark green islands or in the recovered tissue. Recovery is based on gene silencing or RNAi.Non transgenic plantCP transgenic plantSilencing in GFP Engineered PlantsGFP infltration 3 dpiGFP infltration 6 dpi18921892年年2020世纪世纪4040年代年代人类认识病
12、毒过程中，烟草花叶病病毒人类认识病毒过程中，烟草花叶病病毒（Tobacco Mosaic VirusTobacco Mosaic Virus，TMVTMV）起了）起了很大作用很大作用 18861886年，德国年，德国Adolf Mayer，传毒试验，叶脉注，传毒试验，叶脉注射射 受受PasteurPasteur细菌学影响，认为细菌引起细菌学影响，认为细菌引起 1892 1892年，俄国年，俄国Dmitrii Ivanowski 改进改进 瓷质微孔滤器，细菌不能通过瓷质微孔滤器，细菌不能通过 提出非细菌观点，细菌毒素提出非细菌观点，细菌毒素 1898年，荷兰年，荷兰Martinus Beijer
13、inck 验证验证 细菌学检验，在凝胶中以一定速度扩散细菌学检验，在凝胶中以一定速度扩散 三个特点（三个特点（1）通过滤器；（）通过滤器；（2）细胞内繁殖；）细胞内繁殖；（3）体外非生命物质中不能生长）体外非生命物质中不能生长 正式提出烟草花叶病的病原不是细菌，而是一正式提出烟草花叶病的病原不是细菌，而是一种比细菌小得多的传染性活体物质（传染性活种比细菌小得多的传染性活体物质（传染性活质）质） 传染性活质是：传染性活质是：一种侵染因子一种侵染因子能繁殖能繁殖处于分散状态的生命体处于分散状态的生命体首次称这种致病因子为首次称这种致病因子为“Virus 病毒病毒”由于能通过细菌滤器，称由于能通过细
14、菌滤器，称“滤过性病毒滤过性病毒”Ivanowski 和和 Beijerinck开创性工作，开创性工作，揭开了现代病毒学研究序幕揭开了现代病毒学研究序幕 病毒学奠基人病毒学奠基人 病毒学之父病毒学之父伊凡诺夫斯基，俄罗斯伊凡诺夫斯基，俄罗斯著名科学家著名科学家1892年发现年发现烟草花叶病病原的滤过性烟草花叶病病原的滤过性贝杰林克（贝杰林克（1851-1931）荷兰著名科学家，荷兰著名科学家，1898年发现病毒年发现病毒斯坦利（斯坦利（1904-1971）美国著名化学家，）美国著名化学家，1935年提纯了烟草花叶病毒，年提纯了烟草花叶病毒， 1946年年获得诺贝尔奖获得诺贝尔奖19391939
15、年，年，KauscheKausche，电，电镜，镜，TMVTMV，杆状病毒，杆状病毒（第一次观察到病毒）（第一次观察到病毒）EarlyTMVElectronMicrograph烟草花叶病毒烟草花叶病毒像左图一样只含像左图一样只含有蛋白质和有蛋白质和RNA的病毒，其遗传的病毒，其遗传物质又是什么呢物质又是什么呢？烟草花叶病毒拆合试验烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是蛋白质外壳。拆分感染试验：将TMV的RNA与蛋白质分离、提纯；分别接种烟叶，发现RNA能使烟叶致病，而蛋白质不能；用RNA酶处理RNA后接种烟叶也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遗
16、传物质。重组合试验Frankel-Conrat,Singer(1956)进行了图示试验：综上所述：到上世纪中期，多方面证据都直接或间接地表明DNA是主要的遗传物质，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遗传物质。烟草花叶病毒烟草花叶病毒病毒病毒RNA+另一病毒另一病毒病毒蛋白质病毒蛋白质+另一病毒另一病毒正正常常的的烟烟草草叶叶感感染染病病毒毒的的烟烟草草叶叶烟草花叶病毒实验烟草花叶病毒实验正常烟草花叶病毒烟草花叶病毒病毒病毒RNA病毒蛋白质病毒蛋白质正正常常的的烟烟草草叶叶感感染染病病毒毒的的烟烟草草叶叶烟草花叶病毒实验烟草花叶病毒实验正常正常19561956年年，Fraenkel-Conra
17、tFraenkel-Conrat，TMV TMV RNARNA感感染染性性，蛋蛋白白质质和和RNARNA体体外外自自我我装装配配（self-assemblyself-assembly），蛋蛋白质与核酸相互作用研究模型白质与核酸相互作用研究模型的病毒粒子的病毒粒子Tobacco Mosaic Virus 杆状或线状植物病毒粒体的中间是杆状或线状植物病毒粒体的中间是螺旋状的核酸链螺旋状的核酸链，外，外面是由许多蛋白质亚基组成的衣壳。蛋白质亚基也排列面是由许多蛋白质亚基组成的衣壳。蛋白质亚基也排列成螺旋状，核酸链就嵌在亚基的凹痕处。成螺旋状，核酸链就嵌在亚基的凹痕处。 This gave exper
18、iment very surprising results that opened up a new wave of research in biology Engineering Resistant Plants1) Transform Transgenic Plants with Parts of the TMV Genome (Beachy 1985).2) Many Transgenic Plant lines were Resistant to the Virus.3) Many people started using this strategy to obtain resista
19、nt plants.4) In 1993, Bill Dougherty and John Lindbo constructed Transgenic Plants expressing genes of a potyvirus (TEV) and in one control experiment, a non translatable CP gene was included. Transgenic Disease Resistance Left - TMV Resistant Tomato Right - Untransformed Tomato One Month After inoc
20、ulationTransgenic Expression of Virus Genes Elicits Disease Resistance烟草花叶病毒126 kDa/183 kDa蛋白蛋白：RNA聚合酶聚合酶30kDa：移动蛋白（移动蛋白（MP）17.6kDa：除了结构功能外，还参与症状表现和病毒的长距离运输除了结构功能外，还参与症状表现和病毒的长距离运输 TMV为为SSRNA病毒，基病毒，基因组核酸全长因组核酸全长6395个核苷个核苷酸，共有酸，共有5个开放阅读框架。个开放阅读框架。核酸的核酸的5端有帽子结构，端有帽子结构，3端有类似端有类似tRNA的结构。的结构。 根根据据核核酸酸种种类
21、类和和性性质质不不同同，植植物物病病毒毒复复制制可可分分为多种类型。为多种类型。 以（以（+）RNA病毒为例，病毒的复制过程如下：病毒为例，病毒的复制过程如下：（1）病毒粒体进入寄主细胞，脱壳，释放）病毒粒体进入寄主细胞，脱壳，释放RNA；（2）RNA与与核核糖糖体体结结合合，翻翻译译出出病病毒毒复复制制酶酶等等与与复制相关的基因产物；复制相关的基因产物；（3）复复制制酶酶以以（+）RNA为为模模板板合合成成（-）RNA链链，并形成双链复制型；并形成双链复制型；（4）从复制型产生子代（）从复制型产生子代（+）RNA链；链；（5）以病毒）以病毒RNA为模板合成外壳蛋白；为模板合成外壳蛋白；（6）
22、外壳蛋白亚基和）外壳蛋白亚基和RNA组装成新的病毒粒体。组装成新的病毒粒体。 三、病毒检测方法生物学方法血清学方法：自制的ELISA试剂盒和胶体金免疫检测试纸电镜观察PCR检测植物种子、种苗带病毒监测植物种子、种苗带病毒监测免疫胶体金检测试纸质控线检测线胶体金试纸条的结构六部分组成样样品品垫垫（）（）（）胶胶体体金金垫垫（金金标标抗抗病病毒抗体）毒抗体）硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜背胶纸背胶纸吸水纸吸水纸塑料底板塑料底板背胶纸背胶纸背胶纸背胶纸MAX线线检检测测线线（兔兔抗抗病病毒抗体）毒抗体）质质控控线线（羊羊抗抗兔兔抗体）抗体）背胶纸背胶纸双抗体夹心原理病毒Y1-病毒-Y2Y1=兔抗病毒多抗Y
23、2=兔抗病毒多抗Y3=羊抗兔二抗技术路线抗血清的制备抗体IgG的纯化标记pH值及标记抗体量测定测定胶体金的制备免疫胶体金的制备与纯化试剂盒的条件优化和组装试剂盒的质量控制灵敏度特异性检测速度重复性稳定性与ELISA方法比较抗原的制备关键技术问题及其解决抗血清的制备抗体IgG的纯化标记pH值及标记抗体量测定测定胶体金的制备免疫胶体金的制备与纯化试剂盒的条件优化和组装试剂盒的质量控制灵敏度特异性检测速度重复性稳定性与ELISA方法比较抗原的制备抗体纯化方法纯化方法：纯化方法： （1）硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法 （2）辛酸铵沉淀法辛酸铵沉淀法 （3）分子筛分子筛G15纯化纯化 （4）离子亲和柱离子亲和
24、柱Blue Sepharose 6 Fast Flow纯化纯化 （5）亲和层析法亲和层析法抗体质量检测：抗体质量检测： （1）纯度）纯度 （2）纯化抗体的浓度与效价测定纯化抗体的浓度与效价测定不同方法纯化的抗体电泳图不同方法纯化的抗体电泳图1：分子筛G15纯化;2：离子亲和柱BlueSepharose6FastFlow纯化;3，改良辛酸沉淀;4：SRS沉淀;5：PlusProtein-A亲和柱纯化;6：Protein-A柱纯化;7：Marker纯化方法评判标准：得率、纯度、活性、便捷纯化方法评判标准：得率、纯度、活性、便捷1 2 3 4 5 6 797.4 kD66.2 kD43 kD31 k
25、D20.1 kD14.4 kD不同纯化方法获得的抗体情况提纯方法 原始血清量（ml）纯化后的抗体的体积（ml） 纯化后的抗体的浓度（mg/ml） 1ml抗血清提纯的IgG的量（mg） 提纯的IgG的效价改良辛酸沉淀法 122.8885.7761：654360Plus Protein-A柱15 1.460 7.300 1：819200胶体金制备-柠檬酸三钠法胶体金制备示意图胶体金的质量鉴定17nm400-700nm波长扫描透射电镜检测所制备的17nm胶体金溶液在400-700nm波峰扫描图（1）波峰：518nmOD518=1.456（2）主峰峰宽窄粒径均匀；透射电镜检测（17nm）所制备的直径为
26、17nm的胶体金透射电镜图胶体金标记抗体最适条件测定最适条件测定 （1 1）标记最适标记最适pHpH值测定值测定 （2 2）最适抗体稳定量测定最适抗体稳定量测定免疫胶体金质量鉴定免疫胶体金质量鉴定胶体金标记TMV抗体最适pH值的测定123456786.06.57.07.58.08.59.09.5结论:烟草花叶病毒抗体稳定胶体金的最适pH值为8.0。胶体金标记抗体最适pH值测定-胶体金标记TMV抗体最适pH的测定胶体金标记抗体最适抗体稳定量测定-胶体金标记TMV抗体最适稳定量的测定胶体金标记TMV抗体最适稳定量的测定12345678014.621.929.236.543.851.158.4/ug
27、/ml结论:烟草花叶病毒抗体胶体金的最小抗体用量为36.5ug/ml。免疫胶体金质量鉴定-胶体金标记TMV抗体胶体金标记TMV抗体的透射电镜照片检测线抗体、质控线抗体与金标抗体工作浓度的确定金标记抗体稀释度的确定金标记抗体稀释度的确定检测线抗体浓度的确定检测线抗体浓度的确定质控线抗体浓度的确定质控线抗体浓度的确定检测试纸条种类金标记抗体稀释度金标记抗体稀释度检测线抗体浓度检测线抗体浓度质控线抗体浓度质控线抗体浓度TMV1：3600ug/ml300ug/ml试纸条的性能测定试验（1 1）流速测定流速测定（2 2）特异性测定特异性测定（3 3）TMVTMV试纸条试纸条灵敏度试验灵敏度试验（4 4）
28、TMVTMV试纸条重复性试验试纸条重复性试验（5 5）TMVTMV试纸条与试纸条与ELISAELISA对比试验对比试验（6 6）TMVTMV试纸条保存稳定性试验试纸条保存稳定性试验试纸条的性能测定试验-TMV试纸条流速测定经测定胶体金流动速度（从胶体金垫到吸水垫）的速度为6cmmin；质控线显色时间为2-3min。胶体金试纸条流速测定检测病叶汁液稀释倍数检测病叶汁液稀释倍数110501002005001000检测线显色时间检测线显色时间30s30s2-3min3-5min3-5min5-10min10-30min试纸条的性能测定试验-TMV试纸条特异性测定胶体金试纸条特异性测定检测对象烟草花叶
29、病毒试纸条蒸馏水PBS(样品缓冲液)健康烟草叶片（心叶烟）健康卡特兰叶片感染烟草花叶病毒烟草叶片感染建兰花叶病毒卡特兰叶片感染黄瓜花叶病毒烟草叶片感染南方菜豆花叶病毒烟草叶片感染大豆花叶病毒烟草叶片感染马铃薯Y烟草叶片感染马铃薯卷叶病毒烟草叶片试纸条的性能测定试验-TMV试纸条灵敏度试验二代产品TMV胶体金试纸条灵敏度测定TMV胶体金试纸条灵敏度测定图示检测病叶汁液稀释倍数检测病叶汁液稀释倍数110501002005001000检测线显色检测线显色情况情况+（弱阳性）（弱阳性）阴性对照稀释10倍稀释20倍稀释50倍稀释1倍稀释100倍稀释200倍稀释1000倍阳性病叶参照：稀释500倍病毒含量
30、稀释1000倍病毒含量TMV260ng/ml130ng/mlTMV试纸条灵敏度试纸条的性能测定试验-TMV试纸条重复性试验挑取不同批次和批间的试纸条进行进行重复性检测，符合率100%，说明该方法稳定性好。试纸条的性能测定试验-TMV试纸条与ELISA对比试验样品数检测方法阳性结果阴性结果100份烟草样品间接ELISA9010TMV检测试纸条8710试纸条品种阳性符合率阴性符合率总符合率TMV检测试纸条96.67%100%97%试纸条的性能测定试验-TMV试纸条保存稳定性试验胶体金试纸条保存稳定性试验室温室温1天天 47天保存条件保存条件结果结果4保存六个月检测线和质控线清晰，释放完全。室温保存
31、六个月检测线和质控线仍很清晰，有少量胶体金释放不完全。37保存六个月检测线和质控线仍很清晰，有少量胶体金释放不完全。四、烟草花叶病的侵染循环侵染循环TMV靠汁液传染，是机械传染最强的病毒之一，只要叶片上的茸毛稍有损伤，病毒即能侵入，所以病叶、健叶接触经轻微摩擦，即可引起传染。在田间操作时，工作者的手或农具接触病株后再触及健株，也可引起传染。TMV的初次侵染源1.土壤内的病株残屑；2.带毒烟叶采自病株的烟叶；3.混在种子中的病株残；4.带病汁液（用烟草粉或烟草浸出液杀虫时）；5其他染病的其他寄主或杂草寄主。再侵染漂浮育苗或湿润育苗移栽培土打顶抹杈原因分析烟草花叶病的机械传毒。农事操作。现象2：大
32、片烟田同期发病典型案例：福建上杭县一个村，180亩全部发病典型案例：福建武平县一个村，600亩全部发病湿润育苗，是指把基质装到育苗盘孔穴中，播种后育苗盘不放入育苗池也不漂浮在营养液上，而是放在土表或普通简易支架上，营养液从上向下喷洒在基质上，始终保持基质湿润以满足种子萌发和烟苗生长。湿润育苗技术的特点：根系发达，无还苗期，烤烟湿润育苗技术整合了烤烟漂浮育苗与烤烟托盘育苗假植技术（二段育苗），苗床期前湿后干，前期水层只1-2，后期水分靠人工供给，没有水生根，侧根发达，茎杆较粗壮栽后根系直接生长，无还苗期。如何利用先进的育苗方法，结合科学管理，培育出烤烟壮苗是实现烟叶优质、适产、高效的基础。近年来
33、，由于湿润育苗根系发达，茎杆粗壮，均匀一致，壮苗率高，烟苗移栽到大田后抗逆性强，早生快发而受到烟农的青睐。原因分析烟草苗期感染病毒。TMV从根部侵染？现象3.无症烟草植株上长出的二叉烟全是花叶病原因分析烟田有TMV？TMV从根部侵染？烟田土壤普遍带毒田间杂草检测田间杂草检测采集曾经发生TMV严重发病的种植田间的植物，对其叶片和根部用TMV试纸条进行检测被TMV污染的田块上的植物普遍感染病毒！被TMV污染的田块上的植物普遍感染病毒！被TMV污染的田块上的植物普遍感染病毒！检测直接用毒源汁液浇灌根部培养的烟草叶片5株烟草有2株含TMV病毒释放验证：病毒释放验证：2011.03.2532株烟草根部土
34、壤冲净后放入水培液中培养2011.03.2835株烟草根部土壤冲净后放入水培液中培养2011.04.05选取30株烟草作为第一批进行摩擦接种检测第一批：2011.04.10取全部培养液，浓缩后进行病毒的定量检测2011.04.15取培养液，浓缩后进行病毒的定量检测2011.04.20取培养液，浓缩后进行病毒的定量检测第二批：2011.04.12摩擦接种第二批30株烟草2011.04.17取培养液，浓缩后进行病毒的定量检测2011.04.22取培养液，浓缩后进行病毒的定量检测病毒定量：病毒定量：RT-PCR绝对定量：以TMV的cp作为目的基因制作标准品。目的基因PCR扩增目的基因克隆重组质粒筛选
35、质粒DNA提取、重组质粒鉴定计算质粒DNA拷贝数梯度稀释制作标准品结论与问题烟草花叶病流行关键因子：病毒、寄主、环境。烟草根部是TMV侵染的主要方式！TMV可以在土壤中积累！病毒离开活体细胞怎么存活？含N基因的烟草柯克176用于烟草花叶病的防治。竹子花叶病毒马铃薯Y病毒病毒比病毒学家更聪明。病病毒比病毒学家更聪明。病毒在自然界的历史比人类要毒在自然界的历史比人类要久远的多，它们更清楚如何久远的多，它们更清楚如何在这个世界上生存在这个世界上生存-赖明诏赖明诏 “冠状病毒研究之父冠状病毒研究之父”赖明诏赖明诏, , 美国的美国的冠状病毒教科书不少出自他手。冠状病毒教科书不少出自他手。1975197
36、5年年以来，他一直从事冠状病毒的研究，对以来，他一直从事冠状病毒的研究，对牛、猪、鸡、猫、老鼠等多种动物体内牛、猪、鸡、猫、老鼠等多种动物体内的冠状病毒有比较深入的了解。在得到的冠状病毒有比较深入的了解。在得到“非典非典”冠状病毒的基因序列图后，他冠状病毒的基因序列图后，他发现其基因片段组成部分来自老鼠和禽发现其基因片段组成部分来自老鼠和禽类体内的冠状病毒基因类体内的冠状病毒基因; ;五、烟草花叶病防治防治烟草花叶病，应从种子开始，防止种子夹杂病残组织；选择未种过烟草的生地或达两年以上未种过烟草和不靠近烤房的地块或菜园地作苗床；彻底清除苗床及附近杂草；严格剔除病苗；不论是苗床或大田，都要施用净
37、肥。移栽还苗后，要进行查苗，发现病苗及早拔掉，补栽健苗；在后期发现病株，应迅速追施速效肥料，加强肥水管理，促使开秸开片。打顶抹叉时，健、病株要分开进行，在苗床或大田操作前注意用肥皂水洗手，以免人为地传染。对普通烟草花叶病的防治，培育抗病品种极为重要。TMVTMV粒体和基因组结构及其功能粒体和基因组结构及其功能TMV粒体结构粒体结构 TMV基因组及亚基因组结构和功能基因组及亚基因组结构和功能TMVTMV胞胞间间运运动动和和长长距距离离运运输输TMV胞间复制和移动模型胞间复制和移动模型TMV在寄主体内的长距离运输在寄主体内的长距离运输抗病毒植物源活性成分抗病毒植物源活性成分大分子大分子：蛋白、多糖
38、、寡糖小分子小分子：生物碱、黄酮、精油、单宁、脂肪酸小分子具有多重优势苦木苦味素类化合物苦木苦味素类化合物（Quassinoid）苦木科植物的代表性化合物，具有多种生物活性：抗疟；抗白血病；抗EB病毒；抗肿瘤；抗阿米巴原虫。农药抗病毒主要机理农药抗病毒主要机理抑制侵染抑制侵染：与病毒结合；破坏病毒粒体；在寄主表面形成保护层诱导寄主产生抗性诱导寄主产生抗性抑制增殖抑制增殖：阻止病毒核酸与核糖体结合；影响病毒核酸及蛋白的复制及合成；作用于传毒介体作用于传毒介体构效关系分析构效关系分析三萜类化合物抗三萜类化合物抗TMVTMV活性活性TMV移移动动蛋蛋白白表表达达及及抗抗体体制制备备鸦胆子种子鸦胆子种
39、子抗抗TMV活性成分分离与鉴定活性成分分离与鉴定抗抗TMV、CMV、PVY活性测定活性测定抗抗TMV机制研究机制研究体外机制体外机制体内机制体内机制对核酸作用对核酸作用对外壳蛋白作用对外壳蛋白作用对核酸影响对核酸影响对相关蛋白影响对相关蛋白影响植株水平植株水平细胞水平细胞水平悬浮细胞悬浮细胞1、鸦胆子活性成分的分离鉴定、抗、鸦胆子活性成分的分离鉴定、抗病毒活性测试及构效关系分析病毒活性测试及构效关系分析生物测定方法生物测定方法叶碟法叶碟法病毒标准曲线的建立；接种和处理；Indirect-ELISA检测抑制率的计算半叶法半叶法Brucea javanica种子种子乙酸乙酯提取物乙酸乙酯提取物浓缩
40、和拌样浓缩和拌样ABCDEF干柱上样（氯仿：丙酮干柱上样（氯仿：丙酮8 8：5 5）化合物化合物干柱层析干柱层析HPLCRP-18RP-18柱柱结晶结晶未结晶未结晶干柱层析干柱层析TLCTLC筛选洗脱液筛选洗脱液活性组分活性组分结构鉴定结构鉴定活性活性抗抗TMV侵染侵染抗抗TMV增殖增殖Quassinoids抗TMV活性化合物化合物（50 g/ml ）抑制率（）抑制率（）抑制中浓度（抑制中浓度（ g/ml）侵染侵染增殖增殖侵染侵染增殖增殖196.5 2.1a 98.5 1.4a 13.7 1.0d 2.1 0.1d 281.5 1.7bc 77.6 0.9b 22.8 1.4c 24.3 1.
41、9bc 370.2 2.0c 78.1 1.7b 30.2 2.6b 28.4 2.5b 486.2 1.1b 78.4 1.5b 13.7 1.9d 19.7 2.1c 512.1 2.1e 28.4 0.8d 619.7 1.3e 32.5 1.6d 7N3.2 0.9e 8N 3.6 0.7e Ribavirin43.5 1.9d 41.0 2.4c 72.9 2.8a 68.2 1.9a Quassinoids抗抗CMV和和PVY活性（活性（50 g/ml ）化合物化合物抑制率（抑制率（%）侵染侵染增殖增殖9*40.11.61019.10.331.51.1115.80.122.90.5
42、1213.60.453.41.8138.10.146.81.51452.71.273.52.11560.31.0167.60.215.50.21714.70.3化合物917抗TMV活性（50 g/ml ）讨讨 论论Quassinoids是鸦胆子中主要抗病毒活性成分；抗植物病毒活性是quassinoids的一个新的生物活性 。Cpd1和2是鸦胆子中主要的抗病毒成分；Quassinoids可能具有广谱的抗ssRNA病毒侵染的活性；Quassinoids D环中的甲氧桥的位置以及C-15位的酯链的改变是影响quassinoids的抗植物病毒活性的主要因素，氢键的数量也可能影响其抗病毒活性。2、TMV
43、-MP原核表达及原核表达及特异性抗体制备特异性抗体制备 M 1 2PCR扩增结果扩增结果 M 1 2pMD18-T-MP双酶切鉴定双酶切鉴定M 1 2pET-29a-MP双酶切鉴定双酶切鉴定M ：Marker1-2：目的片段：目的片段PCR产物产物 或酶切产物或酶切产物融合蛋白的诱导表达融合蛋白的诱导表达稀稀释倍数倍数 免疫后免疫后OD值（P） 免疫前免疫前OD值（N） P/N400 4.565 2.667 1.712800 3.893 1.967 1.9791,600 2.156 0.973 2.2163,200 1.582 0.675 2.3446,400 1.034 0.307 3.36
44、812,800 0.821 0.193 4.25425,600 0.643 0.171 3.76051,200 0.218 0.132 1.652抗血清效价测定及抗血清效价测定及western检测检测TMV感染叶片中的感染叶片中的MP的的western-blot检测检测3、Quassinoids体外抗体外抗TMV侵染机理侵染机理研究内容研究内容Quassinoids对TMV粒体的直接作用；透析处理对Quassinoids钝化作用的影响；Quassinoids对TMV-RNA的直接作用。Quassinoids对对TMV粒体的直接作用粒体的直接作用CKTreatment透析处理对透析处理对Quas
45、sinoids抗抗TMV的影响的影响化合物化合物未透析未透析透析透析12341234抑制率抑制率（%）94.880.1 72.785.812.710.65.214.7透析处理可以恢复TMV的侵染活性！Quassinoids对对TMV-RNA的作用的作用M ：Marker1：TMV-RNA2：TMV-RNA+cpd13：TMV-RNA+cpd24：TMV-RNA+cpd3左半叶：左半叶：TMV-RNA接种接种右半叶：右半叶：TMV-RNA+BruceineD讨讨 论论Quassinoids能够体外钝化TMV粒体及TMV-RNA，阻止其侵染寄主；Quassinoids不能破坏病毒粒子；Quassi
46、noids能够与TMV粒子结合，但是一种不稳定的、可逆的结合；Quassinoids不能够降解TMV-RNA；Quassinoids可能同TMV-RNA结合。4、Bruceine D抗抗TMV增殖机理增殖机理技术及方法技术及方法对TMV基因组及亚基因组增殖的影响：Real time-PCR技术（两步法，SYBR green）；Semi quantitative RT-PCR技术对TMV-CP和TMV-MP合成的影响：Indirect-ELISA技术；Western-blot技术特异性引物的特异性引物的PCR扩增扩增正链基因组正链基因组RNA负链基因组负链基因组RNAactinCP sgRNAI
47、2 sgRNA正链基因组正链基因组RNA负链基因组负链基因组RNACP sgRNAI2 sgRNAactinBruceine D对对TMV基因组及亚基因组基因组及亚基因组RNA复制的影响复制的影响0 1 2 4 8 g/mL Bruceine D CK TMV-CP TMV-MP Bruceine D在接种后不同时间段对在接种后不同时间段对TMV及其基因组及其基因组RNA复制的影响复制的影响接种不同时间后接种不同时间后Bruceine D对对TMV及其及其基因组基因组RNA的抑制情况的抑制情况Bruceine D处理对烟草悬浮细胞处理对烟草悬浮细胞中中TMV增殖的影响增殖的影响讨讨 论论Bru
48、ceine D能够通过抑制TMV基因组及亚基因组RNA的增殖，从而抑制了TMV相关蛋白的合成；TMV-CP和MP合成的被抑制导致了TMV在寄主体内长距离运输和细胞间移动能力的丧失；二者互相作用导致了TMV在寄主体内增殖被抑制；越早处理，抑制作用越明显。5、Bruceine D对烟草抗对烟草抗TMV的的诱导抗性及保护作用诱导抗性及保护作用Bruceine D对防御酶活性的影响对防御酶活性的影响POD PPOPALSODBruceine D对对TMV感染的烟草的感染的烟草的叶绿素和丙二醛含量的影响叶绿素和丙二醛含量的影响叶绿素叶绿素丙二醛丙二醛Bruceine D对烟草对烟草PPO、POD同工酶的
49、影响同工酶的影响 CK B B TMV CK B B TMVPODPPOBruceine D对对TMV感染烟草体内的感染烟草体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响可溶性糖可溶性糖可溶性蛋白可溶性蛋白Bruceine D对烟草对烟草PR蛋白蛋白的诱导作用的诱导作用M：Marker1 ：TMV处理处理2 ：清水处理：清水处理3 ：Bruceine D处理处理小结Bruceine D能够系统性地提高烟草体内防御酶活性；Bruceine D能够降低TMV感染造成的烟草体内MDA含量的升高；Bruceine D能够阻止TMV感染造成的烟草叶绿素含量的降低；Bruceine D能够阻止TMV感染造成的烟草体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低；Bruceine D能诱导烟草产生新的PPO和POD同工酶；Bruceine D能够诱导寄主产生不同于TMV诱导产生的PR蛋白。总之，Bruceine D能够诱导寄主产生对TMV的抗性，并且对TMV感染的烟草起到保护作用。
