常规电镜操作流程

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1、常规电镜操作流程以 Spirit 120 为例1. 电镜的日常维护1.1 如何加液氮每天第一位使用的电镜的用户首先要检查电镜各项真空值是否正常，若正常可给电镜冷阱加注满液氮再观察使用。保持冷阱液氮 液位的目的有二：（1）防止样品污染，（2）维持样品室真空度正常。具体操作方法如下：将冷阱竖放置桌面上，向冷阱中倒入半罐液氮，待液氮表面平稳后，再将冷阱转移至电镜铜导线位置处，缓 慢将铜导线放到冷阱中后放稳冷阱。完成以上步骤后再将冷阱中加满液氮，盖好盖子，冷却 15 分钟后再开始使用电镜。1.2如何升/降高压每日首位（最后一位）使用电镜的用户，需要给电镜升（降）高压，具体操作步骤如下：（1）升高压（S

2、prit 120电镜为例）在Workset_Setup界面中找到High Tension以及Filament两项。下拉菜单选中40 kV后，再点亮High Tension按钮（颜色由灰色变 为黄色），观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，点击High Tension下拉菜单旁边向右按钮，高压值由40 kV 增至60 kV,再次观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点击High Tension下拉菜单旁边向右按钮增加高 压值，如此几次直至高压升至 100 kV。高压升至100 kV后，勾上High Tension界面最下端的F

3、ree high tension 一项，更改升高压的步长为3 kV后，点击这一栏中向右按 钮将高压升至103 kV,观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点向右按钮将高压升至106 kV,如此几次 直至高压升至 115 kV。高压升至115 kV后，再将每次加高压步长缩小至1 kV，点击向右按钮缓慢将高压升至120 kV。注意：每改变一次高压值均要等 电流稳定后再继续升高压。电压升至120 kV后勾掉Free high tension这项。（2）降高压（Sprit 120电镜为例）在Workset_Setup界面中找到High Tension以及Filame

4、nt两项。点击下拉菜单旁边向左按钮，将电镜高压由120 kV降至100 kV， 观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点击下拉菜单旁边向左按钮继续降电镜高压。高压降至20 kV后， 点High Tension按钮（由黄色变为灰色），关闭电镜高压。1.3如何做 Cryocycle每天最后一位使用完电镜的用户，需要给电镜做Cryo-cycle，主要目的是维持电镜良好的真空状态。Cryo-cycle的具体操作步骤如下：（1）首先要检查物镜光阑是否退出、样品台是否归零、放大倍数是否降至是几十倍、光斑是否扩 至最大。（2）保证以上步骤完成后，先关column，再关灯丝

5、电流，再逐级降高压至20KV后再关掉High tension。（3）扶稳冷阱，缓慢 将冷阱从电镜上转移至桌面，注意不要碰到铜导线。将多余的液氮倒回保温瓶中备用，冷阱放回制定位置平放保存。（4）点击 Cryo- cycle，待出现倒计时且进行1分钟后再刷卡下机。2. 常温样品观察2.1 上样前准备检查电镜真空状态，样品台是否归零，检查冷阱液氮液位。2.2上样品未通过中级以上考核用户需由已通过考核的陪同人上样。2.3加灯丝电流待 Column 真空值降到 15 以下后，点击 Filament ，按钮变为黄色即为开启状态。2.4开 ColumnColumn 按钮灰色时为开启状态。2.5低倍浏览样品大

6、致情况关灯后拿掉盖在电镜荧光屏上的黑色橡胶盖，调节电镜放大倍数至几百倍后移动样品台，快速浏览样品染色情况。点击 Workset _search中的add,添加感兴趣区域到search界面。26调整Z轴高度几百倍下找到样品中的一个标志点（如脏东西），移动样品台使标志点处于荧光屏的正中心。顺时针旋转 Magnification 旋钮，调节 电镜放大倍数至2000X至3000X，微缩光斑（逆时针旋转intensity）至充满荧光屏状态。点击Workset_stage界面右上方的小三角，打 开隐藏界面，切换至control界面。点击control界面中的set alpha（变为黄色），使样品台倾转-1

7、5，此时原处于荧光屏正中的标志物 会偏移出中心位置，按右侧控制面板最右侧的Z axis的上键或下键，使标志物重回荧光屏的中心。再次点击set alpha（颜色由黄变灰）， 使样品台恢复为0。27插入侧插相机顺时针旋转Magnification旋钮，调节电镜放大倍数至希望拍照倍数，同时逆时针旋转intensity按钮，缩拢光斑至满屏状态。荧光 屏上盖上黑色橡胶盖，点击放在桌上的侧插相机控制手柄的绿色插入控制键（in）,插入侧插相机。侧插相机控制界面选中live模式， 移动样品台寻找合适的拍照位置。28聚焦打开侧插相机的傅里叶变换（Fourier Transform）窗口，旋转右侧控制面板focu

8、s旋钮（focus下旋钮控制每次调节的步长，上旋钮 控制物镜电流），结合图像和FFT环的变化情况，找到正焦点。正焦时，图像颗粒边界模糊，FFT界面亮度均匀看不到环。欠焦时，图 像颗粒边界为白色。过焦时，图像颗粒边界为黑色。找到正焦点后，点击下右侧控制面板的R2键重置defocus值为零，在此基础上调 节focus旋钮至欠焦-3 pm左右观察样品（注：不同放大倍数下欠焦值设定不同，倍数越低，欠焦越大。50KX左右时，欠焦值调至-3pm为宜）。2.9拍照找到合适区域点击侧插相机控制界面的 Snapshot 拍照。2.10保存照片点开侧插相机菜单栏中Acquisition settings项（形如D

9、V）设置照片存储路径（Saving）和照片名称（Document Name_Snapshot ）。2.11下样前准备点掉侧插相机的live关闭相机，点击放在桌上的侧插相机红色退出控制键（out），撤出侧插相机。逆时针旋转Magnification旋钮， 降低放大倍数至几十倍，同时顺时针旋转 intensity 扩大光斑至最大。若使用了物镜光阑需退出。荧光屏上重新盖好黑色橡胶盖子。点 击Workset界面stage_control中的holder项，使样品台归零。点击setup中的Column （变为黄色），关闭镜筒。点击Filament （变为灰 色），关闭灯丝电流。Emission值为0后表

10、示已经关闭。2.12下样未通过中级以上考核用户需由已通过考核的陪同人下样。2.13刷卡下机并做实验记录登记3. 冷冻样品观察（需要使用底插相机）3.1上样前准备检查电镜真空状态，样品台是否归零，检查冷阱液氮液位。3.2 领取 Gatan626 杆通过高级考核的用户可以自己领取，未通过该项考核的用户需由该仪器管理员或已通过高级考核的用户陪同领取。具体领取方法如下：到冷冻样品杆存放处领取Gatan626杆并登记，同时拉开shutter检查一下压样品的卡环是否在。如果不在，请 及时与管理员联系。3.3常温下检查Gatan626杆的密封性首先修改Workset_Stage_Control界面中的set

11、 alpha角度为-55，然后点击set alpha （由灰色变为黄色），使样品台倾转-55，插 入样品杆，等待预抽。预抽结束后，旋转样品杆至球阀开放后将样品杆完全送入镜筒内。再次点击set alpha （由黄色变为灰色），使样 品台恢复为 0（未通过高级考核用户需由已通过考核的陪同人上样）。插入样品杆后观察电镜真空的变化，若起伏不大，则说明此杆 可以使用；反之，则需要更换样品杆。3.4 冷杆向 workstation 和样品杆的杜瓦罐中同时加入液氮，初加入液氮时拉动下 shutter（ shutter 打开一半即可，防止卡环被液氮冲走），防 止冷却过程中shutter冻住。workstati

12、on和杜瓦罐中的液氮大沸腾后（此时说明温度已接近液氮温度），向workstation和杜瓦罐中补充 液氮，稍低于 workstation 中黑色密封层即可。等待 workstation 和杜瓦罐完全冷却，此过程大约需要 15 分钟，等待过程中需不断给它 们补充液氮，杜瓦罐加满后 15 分钟内无需再加。3.5 上样未通过高级考核用户需由已通过考核的陪同人上样。此部分为高级培训内容，略。3.6 加灯丝电流待Column真空值降到15以下后点击Filament，按钮变为黄色即为开启状态。（T20电镜上下样无需关闭灯丝电流。）3.7 开 ColumnColumn 按钮灰色时为开启状态。3.8低倍浏览样

13、品大致情况拉开样品杆的shutter。关灯后拿掉盖在电镜荧光屏上的黑色橡胶盖，调节电镜放大倍数至几百倍后移动样品台，快速浏览样品冰 层情况。点击search中的add，添加具有代表性的厚度冰层区域到search界面，同时添加一个碳膜破损的位置。3.9 打开 Low Dose Mode切换Workset至Low Dose界面，点击打开的Low Dose （黄色为开启状态）模式。3.10 设定 Search 倍数Search按钮为黄色开启态时，电镜系统会默认进入Search所设定的放大倍数、spot size和intensity状态。通常定义search的倍数 为能大致看到一个square范围的倍

14、数，如2900X左右，此倍数下的光斑（剂量）不易太小，充满整个荧光屏为宜，以免损伤样品。电 镜系统仅能记录当前状态。311设定Exposure倍数与剂量Exposure的倍数与样品分子量、尺寸以及期望达到分辨率相关，通常为50KX到80KX左右。移动样品台至记录的空位置（search 界面中选中空位置的编号，点击GO,样品台即会自动移动到该为位置。样品台移动过程中Go按钮变灰为不可点状态，移动到指定位 置后Go按钮又可以点击。），旋转intensity旋钮至光斑充满荧光屏状态，点开Low Dose界面右侧的三角形图标，展开隐藏界面并切换 至Options界面。勾选该界面最下方的continuo

15、usly，点击Measurement，测试当前光强下的电子剂量。通常情况下，200 kV时，设置 剂量为30e/A2/s； 120 kV时，设置剂量为15e/A2/s； 100 kV时，设置剂量为10e/A2/s；电子剂量与曝光时间相乘即为每张照片所承受的 总剂量。若光斑满屏条件下达不到相应的剂量值，可调整Spot Size（Spot Size数字越小，光斑尺寸越大）值以满足需求。切记不要光 斑过小，以免损伤荧光屏和样品。312调整Z轴高度切换至Search倍数，调整Z轴高度，具体调整方法参考2.6步。313 调整 Exposure 倍数欠焦值Exposure倍数下移动样品台至碳膜区域，点开w

16、orkset_camera界面中的Live FFT,旋转右侧控制面板上的focus旋钮，对碳膜区域 进行聚焦。通常情况下，focus 直沿一个方向旋转时，FFT界面中的圆环数量增加尺寸减少；反方向旋转后，圆环数量不断减少尺寸 增大；过了某一个点后，圆环数量变多尺寸减少。该点就为正焦点（FFT中看不到环且各处亮度均匀），找到此点后，点击右侧控制面 板上的R2钮，重置此时的defocus值为零。再在此基础上调节defocus值至-3-5 pm范围内，用于Exposure倍数下的拍照。初学者可寻找带有冰污染的区域练习调焦。冰边缘出现白色边界时为欠焦，轮廓不清晰时为正焦，边缘出现黑色边界时为过焦。Exposure倍数调好焦后，切换电镜放大倍数至search倍数，调节此倍数下的def