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1、大肠菌群计数检验操作规程颁发部门质量部新订修订复审页数共2页文件性质管理标准操作标准技术标准文件编码原编编码起草年 月 日审核年 月 日批准年 月 日QC年 月 日执行日期年 月 日分发部门质量管理部、QC一、 目的建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。二、 适用范围适用于大肠菌群计数的检验操作。三、 职责1. 检验人员严格按检验操作规程进行检验。2. QC主管监督检查执行情况。四、 程序1.范围 本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定 2.术语和定义 2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。3. 设备和材料 除
2、微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：361，301。 3.2冰箱：25。3.3 恒温水浴箱：46 1。 3.4天平：感量为 0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 3.9无菌培养皿：直径 90 mm。 3.10 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。 3.11菌落计数器。4.培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A中 A.1。
3、4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录 A中 A.24.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.3。4.4无菌生理盐水：见附录 A中 A.4。4.5无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.5。4.6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。5.检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10倍系列稀释 选择3个适宜稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管 361 48h2h不产气产气BGLB肉汤 361 48h2h产 气不产气 大肠菌群阳性大肠菌群阴性 查MPN
4、表报告结果图1大肠菌群 MPN计数法检验程序6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min，制成 1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。6.1.3样品匀液的 pH值应在 6.
5、57.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl 调节。6.1.4用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支 1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样
6、品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 1 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1 培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（m
7、L）样品中大肠菌群的MPN值。 附录A（规范性附录）培养基和试剂附录A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。121 高压灭菌 15 min。A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉（oxgall或o
8、xbile）溶液 200 mL 0.1%煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 制法 将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.07.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压灭菌15 min。A.3磷酸盐缓冲液 A.3.1成分 磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.3.2制法
9、贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。 A.4 无菌生理盐水 A.4.1成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.4.2制法：称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121高压灭菌15 min。A.5 1mol/L NaOHA.5.1成分NaOH 40.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.2制法：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。 A.6 1mol/L HClA.6.1成分 HCl 90 mL 蒸馏水 1 000 mL A.6.2制法 移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121高压灭菌15 min。1鉴tag7
