《川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达程度的影响吴宁，周登锋，齐洁琳，张锡芹，步兵，刘蒲香，王明玉，孙汉英，刘文励【摘要】本研究讨论川芎嗪对骨髓移植BT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达程度的影响及其促进骨髓造血重建的机制。取安康BALB/小鼠，随机分为3组：正常组不做处理，BT+生理盐水组简称生理盐水组和BT+川芎嗪治疗组简称川芎嗪组。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0.2毫升/只和川芎嗪注射液每次2毫克/只，2次/天，直至处死为止。在BT后第7、14、21、28天处死小鼠，用RT-PR和esternblt方法检测骨髓基质细胞bFGFRNA及其蛋白表达程度。结果说明：BT后第7、14、
2、21天川芎嗪组和生理盐水组骨髓基质细胞bFGFRNA及其蛋白的表达均明显低于正常组P0.01或P0.05，但川芎嗪组明显高于生理盐水组P0.01或P0.05，到第28天，川芎嗪组bFGFRNA及其蛋白的表达已恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异P0.01。结论：川芎嗪可能通过增加bFGF的表达程度而促进骨髓微环境的修复，加速BT后骨髓的造血重建。【关键词】川芎嗪；骨髓移植；骨髓基质细胞；碱性成纤维细胞生长因子EffetfLigustrazinentheExpressinfbFGFinbnearrstralellsfieafterBTAbstratThisstudyaspur
3、psedtinvestigatetheeffetfligustrazinentheexpressinfbFGFinbnearrstralells(BS)andtexplretheehanisfheatpietirenstitutinafterbnearrtransplantatin(BT).Theieererandlydividedint3grups：nralgrup,salinegrupandligustrazinegrup.BTusedelsereestablished.Theiefnralgruperenttreated,theiefsalinegruperegivennralsalin
4、e(0.2l/use,tieaday)thrughgastritube,hiletheiefligustrazinegruperegivenligustrazine(0.2l/use,tieaday)thrughgastritube.nday7,14,21and28afterBT,theferaeretakenandthebnearrnnulearell(BN)suspensinsereusedfrtheultivatinfbnearrstralellsardingtDextersultureethd.TheRNAandprtEinexpressinsfbFGFinBSereassayedby
5、RT-PRandesternbltrespetively.TheresultsshedthattheexpressinfbFGFinBSnthelevelfRNAandprteinereallreduedsignifiantlyafterBT,andinreasedsllyiththetie.nday7,14and21afterBT,theexpressinsfbFGFRNAandprteininbnearrstralellsfligustrazinegrupandsalinegruperelerthanthatinbnearrstralellsfnralgrup,buttheexpressi
6、nsfbFGFRNAandprteininligustrazinegruperebvinslyhigherthanthatinsalinegrup(P0.01rP0.05).nday28afterBT,theexpressinsfbFGFRNAandprteininligustrazinegrupreturnedtnrallevel,hiletheexpressinsfbFGFRNAandprtininsalinegrupntreturnedtnrallevel,thereassignifiantdifferenebeteenthesetgrups.Itisnludedthatligustra
7、zineanenhanebFGFexpressinlevelinbnearrstralellsaftersyngeneibnearrtransplatatininie,hihnfirsthatligustrazineanenhanetherepairfbnearrirvessels,iprvebnearrirenvirnentandprteheatpietirenstitutin.Keyrdsligustrazine;bnearrtransplantatin;bnearrstralell;bFGF造血干细胞HS移植是目前治疗多种难治性血液病主要手段之一。受者在BT前需要承受大剂量的放疗、化疗。
8、骨髓是对辐射敏感的器官之一。射线不仅杀伤骨髓中的造血细胞，而且对骨髓微环境中的基质细胞及其分泌的生长因子也有特异性的影响1。以往我们的研究说明，川芎嗪通过促进骨髓微血管系统修复、增加骨髓微环境供氧、改善骨髓微环境，并促进骨髓基质细胞生长及其黏附才能，促进造血干细胞增殖2。碱性成纤维细胞生长因子basifibrblastgrthfatr,bFGF是一种多功能的细胞因子，与其特异性受体bFGFR结合后刺激内皮细胞增殖、移行，促进血管新生，为一种血管新生诱导因子。本试验通过观察川芎嗪对骨髓移植(BT)后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达的影响，进一步讨论川芎嗪促进BT小鼠造血重建的作用机制。材料和方法实验
9、动物清洁级近交系BALB/小鼠H-2d，LSb，8-10周龄，18-22克，雌雄兼用湖北省实验动物中心提供。每只小鼠于照射前3天到照射后14天喂饲庆大霉素水200U/day清洁肠道。药物盐酸川芎嗪注射液20g/L无锡市第七制药厂产品，批号030822。试剂和仪器兔抗小鼠bFGF、bFGFR单克隆抗体SantaruzBitehlgy公司提供；NBT/BIP染色试剂盒(武汉中健公司产品)，PR引物上海生物工程公司合成；TRIZL、PRkit、DL2000arkerTaKaRa公司产品；DEP、RNaseA酶、PIPrega公司产品；FIT-山羊抗兔Ig单克隆抗体北京中山公司产品；流式细胞仪Betn
10、Dikinsn产品。分组及处理BALB/小鼠72只，随机分为3组。正常组8只未作任何处理；BT+生理盐水组以下简称生理盐水组及BT+川芎嗪组以下简称川芎嗪组各32只。移植前4小时小鼠均经60线全身均匀照射，总剂量7.5Gy，剂量率为1.644Gy/in。BT模型的建立3：取正常的BALB/小鼠，颈椎脱臼处死后立即取双侧股骨制备单个核细胞悬液并计数，调整细胞浓度至1107/l，4小时内经尾静脉注入受照射的生理盐水组及川芎嗪组小鼠体内供体鼠和受体鼠比例为14，注入细胞数为2106/只，液体量0.2毫升/只。制成BT模型后，川芎嗪组小鼠立即喂饲盐酸川芎嗪注射液2毫克/只，每天2次；生理盐水组喂饲生理
11、盐水，0.2毫升/只，每天2次。以上两组均用药至处死为止。骨髓有核细胞计数(BN)于BT后7，14，21，28天颈椎脱臼法处死小鼠，称重，浸入75%乙醇中3分钟，然后取双侧股骨，用RPI1640从骨髓腔冲出有核细胞，按白细胞计数方法，计数有核细胞。骨髓基质细胞培养分别于BT后7、14、21、28天处死小鼠，参照Dexter方法4进展骨髓基质细胞培养。每周半量换液1次，至贴壁细胞长满为止14-21天。骨髓基质细胞bFGF蛋白表达的esternblt分析参照分子克隆实验南5进展。别离、搜集BN后，参加5倍体积的细胞裂解液并混匀，冰上裂解20分钟，离心吸上清即为细胞总蛋白。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
12、和转移按照说明书进展。兔抗小鼠bFGF单克隆抗体1500稀释4孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG单克隆抗体14000稀释二抗，37孵育1小时，用PBS洗膜，NBT/BIP显色。对esternblt的特异性条带进展灰度扫描，以积分光密度面积2表示条带的信号强弱，以此对目的蛋白表达程度进展半定量比拟。数据以各组条带积分光密度面积/未处理组条带积分光密度面积表示。骨髓基质细胞bFGFRNA程度表达的RT-PR检测参照分子克隆实验指南5进展。采用GeneFisher1.3软件设计引物序列：bFGF上游引物：5-GGAGAAGAGGAAAG-3，下游引物：5-GAGAATTGGAAGAAAAG-
13、3。-atin上游引物：5-GGATTGAGAGTTAGAGTGA-3，下游引物：5-GAGAGAATGTTGTGAGGAGGTGGGG-3。用TRIZL试剂盒，按说明提取骨髓基质细胞总RNA并测定纯度。93预变性1分钟，93变性30秒，72延伸60秒。bFGF56退火30秒，共35个循环，循环后72延伸8分钟。PR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统对DNA条带扫描，以目的基因扫描密度值/-atin基因扫描密度值的百分数%作为目的基因RNA的相对表达量。bFGF扩增产物大小为288bp，-atin为400bp。统计学分析数据以均数标准差(SD)表示，采用SAS10.0统计软件进展
14、t检验。结果骨髓基质细胞bFGF蛋白表达程度分析BT后第7至21天，川芎嗪组和生理盐水组bFGF蛋白表达程度均明显低于正常组P0.05或P0.01，但川芎嗪组明显高于生理盐水组P0.05或P0.01；到BT后第28天川芎嗪组已根本恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异P0.01图1、2。骨髓基质细胞bFGFRNA表达程度分析讨论骨髓造血微环境在构造上分为基质细胞和细胞外基质，其中骨髓基质细胞(bnearrstralells,BS)是骨髓造血微环境的核心，它通过与造血细胞亲密接触，可以持续稳定地分泌多种细胞因子包括正、负造血调控因子调节造血，其构造和功能的完好性对于保护机体造血
15、的稳定性具有非常重要的作用。骨髓是对辐射敏感的器官之一，射线在损伤造血细胞的同时对骨髓微环境也有一定程度的损伤，而损伤后骨髓造血功能的恢复必须先有血管系统特别是静脉窦的修复和血流的重建，以保护细胞成长所需要的营养物质和体液因子，促进造血细胞、基质细胞的生长发育及其功能。bFGF既是一种高度特异的内皮细胞丝裂原，又是血管生成素、细胞生长因子6，具有多种功能，且与细胞迁移、分化及组织发育有关。血管内皮细胞、成纤维细胞、T、B淋巴细胞、巨核细胞、血小板等为其特异性靶细胞。bFGF通过与靶细胞外表特异性受体bFGFR结合刺激内皮细胞增殖、移行，增加血管通透性，调节血管新生及血管形成。在以往的研究中，我们实验小组已经证实,川芎嗪可以明显减少骨髓移植早期骨髓内基质出血，改善骨髓微环境供氧，加快早期骨髓血管网络修复，促进造血微环境的恢复7。川芎嗪还能上调骨髓基质细胞FAK、SF、VEGF的表达8,9，促进骨髓基质细胞增殖，调控造血过程，并可以促进骨髓组织中HS、D44、D31、IA-1的表达10-13，后者参与介导造血干细胞黏附定居和增殖分化，可以加快骨髓移植后的造血重建。在实验中我们观察到：bFGF在BT后不同时间点小鼠骨髓基质细胞中有不同程度的表达。说明基质细胞可产生分泌bFGF。BT后
