《凝胶层析技术 综述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝胶层析技术 综述（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、凝胶层析技术研究及应用 摘要：本文综述了凝胶层析的定义原理及其相关参数，以及在实际操作过程中的 标准步骤，并讲述了凝胶层析技术的一般应用。关键词：凝胶层析 原理 操作流程 应用 引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。 它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色 谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。 1964 年， Moore 制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝 胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析
2、一般称为凝胶渗透层析）。随后这一 技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。1. 凝胶层析原理 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰 性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有 不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩 散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不 能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下 流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先
3、流出；而较小的分子则可以完全 渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大 小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小， 所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分 越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流 出，从而达到了分离的目的。2. 凝胶层析相关系数 2.1外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是 指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨
4、架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所 能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需的洗脱液的体 积。2.2分配系数 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数 实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。2.3排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极 限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以他们同时被最 先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种宁角度 排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-5 0的排阻极限为 30000，它表示分子量大于3
5、0000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 2.4分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子， 用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分 离范围为300070000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线 性蛋白的分级分离范围是不同的。2.5吸水率和床体积吸水率是指lg干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水分。 所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指lg干的凝胶吸水后的最终体 积。2.6凝胶颗粒的大小层
6、析用的凝胶一般都是球形，颗粒大小通常以目数（mesh ）或者颗粒直径（m） 来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离 效果差；颗粒小，分离效果好，但流速慢。一般比较常用的是100-200目。3. 凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分 子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离 又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的 物质（1000-5000）的脱盐可使用 Sephadex G-10，G-15 及Bio-Gel-p-2 或4。女口 果实验目的是将样品中一些分子量
7、比较近似的物质进行分离，这种分离又 叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于 Kd不同，最后得 到分离。 根据经验，组别分离时，大多采用 2-30cm 长的层析柱，分级分 离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm 产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D 般宜 在7-10之间，但对移动慢的物质宜在 30-40之间。4凝胶层析的应用 4.1脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用 凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速
8、、蛋白质和酶类 等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋 白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲 液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干 燥法除去挥发性盐类。4.2用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、 生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中 的致热原制备注射用水。4.3 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶
9、柱 内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量 的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知 物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质 的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。44高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中， 这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排 阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的 高分子溶液。参考文献：【1】 严希康。生化分离技术【M】。上海：华东理工大学出版社，1996.49-54【2】赵永芳生物化学技术原理及其应用【M】.2版，武汉：武汉大学出版社, 1994:113-146【3】李建武等编。生物化学实验原理和方法【M】。北京大学出版社1994【4】刘国诠.生物工程下游技术M.北京化学工业出版社.2003【5】孙彦生物分离工程M.北京化学工业出版社。2005【6】白颖，李建伟凝胶色谱法测定高聚物的平均分子量及分子量分布J. 塑料科技, 2007,(04)
